假絲酵母菌性外陰陰道病不同基因型致病菌株藥物敏感性比較

祁文瑾，李白鸞，錢 源

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假絲酵母菌性外陰陰道病不同基因型致病菌株藥物敏感性比較

祁文瑾，李白鸞，錢 源

【摘要】目的對妊娠與非妊娠假絲酵母菌性外陰陰道病(VVC)致病菌株進(jìn)行基因分型，并初步探討不同基因型菌株對抗真菌藥物是否存在敏感性差異。方法選取2011—2014年在昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科門診就診的VVC患者373例，其中非妊娠VVC患者197例，妊娠(10～40周)VVC患者176例。以科瑪嘉顯色培養(yǎng)基和VITEK 2系統(tǒng)鑒定致病菌菌種，采用改良的微量平板稀釋法進(jìn)行克霉唑、制霉菌素和咪康唑的體外藥敏實(shí)驗(yàn)，特異引物PCR對致病白假絲酵母菌基因分型，并對不同基因型致病菌的體外藥敏結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果非妊娠VVC患者檢出白假絲酵母菌166株(84.26%)，妊娠VVC患者檢出白假絲酵母菌134株(76.14%)，妊娠VVC患者白假絲酵母菌檢出率低于非妊娠VVC患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.901，P=0.048)。妊娠與非妊娠VVC患者致病白假絲酵母菌克霉唑、咪康唑最小抑菌濃度(MIC)值均低于非白假絲酵母菌(妊娠：Z克霉唑=6.275，P<0.001；Z咪康唑=5.102，P<0.001；非妊娠：Z克霉唑=3.095，P=0.002；Z咪康唑=2.169，P=0.030)；妊娠VVC致病白假絲酵母菌咪康唑、制霉菌素MIC值低于非妊娠VVC患者(Z=3.074，P=0.002；Z=4.982，P<0.001)。妊娠VVC致病白假絲酵母菌對克霉唑、咪康唑敏感率較高(≥91.04%)，少有耐藥菌株；非妊娠VVC致病白假絲酵母菌菌株對克霉唑敏感率達(dá)96.38%。妊娠VVC患者A基因型菌株113株，B基因型菌株10株，C基因型菌株11株；非妊娠VVC患者分別為152、5、9株，兩組患者不同基因型白假絲酵母菌菌株構(gòu)成比比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.189，P=0.114)。妊娠VVC患者A基因型菌株的咪康唑MIC值高于非妊娠VVC患者A基因型菌株(Z=2.804,P=0.005),而制霉菌素MIC值低于非妊娠VVC患者A基因型菌株(Z=4.869，P<0.001)。妊娠VVC致病白假絲酵母菌B、C基因型菌株全部對克霉唑、咪康唑敏感，而A基因型菌株敏感率分別為91.15%、89.38%；非妊娠VVC致病白假絲酵母菌B基因型菌株全部對克霉唑、制霉菌素敏感，C基因型菌株全部對克霉唑、咪康唑敏感，而A基因型對克霉唑、制霉菌素、咪康唑敏感率分別為94.74%、69.08%、80.30%。結(jié)論非妊娠VVC患者可優(yōu)先選擇克霉唑治療，妊娠VVC患者可優(yōu)先選擇咪康唑治療。妊娠與非妊娠VVC患者白假絲酵母菌均以A基因型最為多見，且不同基因型白假絲酵母菌對抗白假絲酵母菌藥物的敏感性存在差異。

假絲酵母菌性外陰陰道病(vulvovaginal candidiasis，VVC)是一種常見的婦產(chǎn)科感染性疾病，妊娠婦女陰道假絲酵母菌的感染率高于非妊娠婦女，可能導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎膜早破及新生兒感染等不良妊娠結(jié)局[1-2]。由于用藥限制，妊娠期VVC治療相對困難。本研究對妊娠和非妊娠VVC患者的陰道致病假絲酵母菌進(jìn)行基因分型和體外藥敏研究，探討致病菌株本身的基因型差異是否對抗真菌藥物的敏感性存在影響，為進(jìn)一步有效治療妊娠和非妊娠VVC患者提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料選取2011—2014年在昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科門診就診的VVC患者373例，其中非妊娠VVC患者197例，年齡18～45歲，平均年齡(27.4±5.6)歲；妊娠VVC患者176例，年齡20～43歲，平均年齡(29.0±3.5)歲，妊娠10～40周?；颊呔型怅庰W、陰道分泌物異常等典型VVC癥狀，假絲酵母菌鏡檢、培養(yǎng)陽性，且不存在免疫相關(guān)性疾病及糖尿病等合并癥，無長期抗生素使用史。

1.2研究方法

1.2.1菌種鑒定患者均于陰道后穹隆處收集陰道分泌物，接種于沙堡羅氯霉素培養(yǎng)基(法國-生物梅里埃公司)，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24～48 h，有乳酪狀假絲酵母菌菌落生長為培養(yǎng)陽性，挑取單菌落接種于斜面培養(yǎng)基保存，以科瑪嘉顯色培養(yǎng)基(法國科瑪嘉公司生產(chǎn)，鄭州博賽公司分裝)和VITEK 2酵母菌鑒定卡(法國-生物梅里埃公司)進(jìn)行菌種鑒定。標(biāo)準(zhǔn)株為白假絲酵母菌ATCC90028，購自美國細(xì)胞典藏中心。

1.2.2藥敏實(shí)驗(yàn)參考美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會的抗真菌藥物敏感實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(CLSI/NCCLS)，以改良的微量平板稀釋法進(jìn)行FDA分類B類藥物克霉唑、制霉菌素，C類藥物咪康唑(美國Sigma化學(xué)制劑公司，純度>99.9%)的體外藥敏實(shí)驗(yàn)，藥物終濃度均為0.031 3～16.000 μg/ml[3-4]。

最小抑菌濃度(MIC)值：以96孔U型細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行，菌液最終濃度為(1～5)×103CFU/ml，35 ℃溫箱孵育24～48 h觀察結(jié)果，根據(jù)顯色指示劑Alamar blue(英國Serotec公司)的顏色變化判別MIC值，質(zhì)控菌株為克柔假絲酵母菌ATCC 6258和近平滑假絲酵母菌ATCC 22019，購自美國細(xì)胞典藏中心。

1.2.3白假絲酵母菌的基因分型選取經(jīng)鑒定確認(rèn)為白假絲酵母菌的菌株，以溶壁酶(Sigma，美國)25 ℃處理24 h破壁[5]，北京莊盟國際生物基因科技有限公司ZP302酵母基因組DNA小量提取試劑盒抽提DNA?；蚍中筒捎锰禺愐锞酆厦告湻磻?yīng)(INT-PCR)進(jìn)行，引物參考文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)，序列為CA-INT-L(5′-ATAAGGG AAGTCGGCAAAATAGATCCGTAA-3′)，CA-INT-R(5′-CCTTGGCTGTGGTTTCG CTAGATAGTAGAT-3′)，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR以25 μl體系進(jìn)行擴(kuò)增，含有10×buffer 2.5 μl，MgCl2(25 mmol/L)1.5 μl，dNTP(10 mmol/L)0.25 μl，Taq酶(5 μg/μl)0.25 μl，引物各(100 pmol/μl)0.15 μl，基因組DNA約25 ng。95 ℃預(yù)變性4 min，按94 ℃變性45 s，62 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸4 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶(EB)染色，于紫外燈下觀察并攝片保存結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料的分析采用χ2檢驗(yàn)；不同菌株的藥物MIC值比較采用秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1致病假絲酵母菌菌種鑒定結(jié)果非妊娠VVC患者檢出白假絲酵母菌166株(84.26%)，非白假絲酵母菌31株(15.74%)；妊娠VVC患者檢出白假絲酵母菌134株(76.14%)，非白假絲酵母菌42株(23.86%)。妊娠VVC患者白假絲酵母菌檢出率低于非妊娠VVC患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.901，P=0.048)。

非妊娠VVC患者共檢出非白假絲酵母菌6種，其中光滑假絲酵母菌12株(38.71%)；妊娠VVC患者共檢出非白假絲酵母菌8種，其中光滑假絲酵母菌19株(45.24%)。所有VVC患者陰道致病非白假絲酵母菌構(gòu)成比見表1。

表1妊娠與非妊娠VVC患者陰道非白假絲酵母菌鑒定結(jié)果

〔n(%)〕

Table 1Identification results of non candida albicans candida species in the vagina of pregnant VVC patients and non-pregnant VVC patients

菌種妊娠VVC患者非妊娠VVC患者光滑假絲酵母菌19(45.24)12(38.71)克柔假絲酵母菌5(11.91)4(12.90)熱帶假絲酵母菌8(19.05)7(22.58)近平滑假絲酵母菌3(7.14)3(9.68)季也蒙假絲酵母菌2(4.76)3(9.68)法式假絲酵母菌2(4.76)2(6.45)挪威假絲酵母菌1(2.38)0 其他假絲酵母菌2(4.76)0

2.2妊娠與非妊娠VVC患者體外藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果妊娠與非妊娠VVC患者致病白假絲酵母菌克霉唑、咪康唑MIC值均低于非白假絲酵母菌(Z妊娠克霉唑=6.275，P<0.001；Z妊娠咪康唑=5.102，P<0.001；Z非妊娠克霉唑=3.095，P=0.002；Z非妊娠咪康唑=2.169，P=0.030)；妊娠VVC致病白假絲酵母菌咪康唑、制霉菌素MIC值低于非妊娠VVC患者(Z=3.074，P=0.002；Z=4.982，P<0.001)，妊娠VVC致病非白假絲酵母菌制霉菌素MIC值低于非妊娠VVC致病非白假絲酵母菌患者(Z=2.672，P=0.008)，克霉唑MIC值高于非妊娠VVC致病非白假絲酵母菌患者(Z=5.273，P<0.001，見表2)。

根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)報(bào)道[3-4，6-7]界定的MIC節(jié)點(diǎn)值：咪康唑0.5～8.0 μg/ml，克霉唑1.0～16.0 μg/ml，制霉菌素4.0～8.0 μg/ml，將所有菌株分為敏感、中敏和耐藥菌株，結(jié)果顯示：妊娠VVC致病白假絲酵母菌對克霉唑、咪康唑的敏感率較高(≥91.04%)，對制霉菌素敏感率也高達(dá)89.55%；致病非白假絲酵母菌對咪康唑、制霉菌素敏感率約為90%，但對克霉唑敏感率僅為47.62%。非妊娠VVC致病白假絲酵母菌對克霉唑敏感率達(dá)96.38%，對制霉菌素敏感率為69.88%，非妊娠VVC致病非白假絲酵母菌對克霉唑敏感率達(dá)100.00%，對制霉菌素敏感率為80.65%(見表2)。

2.3不同基因型陰道致病假絲酵母菌藥敏分析應(yīng)用INT特異引物對已鑒定確認(rèn)為白假絲酵母菌的非妊娠和妊娠VVC致病菌株進(jìn)行擴(kuò)增后，菌株均可擴(kuò)增出清晰的450 bp和/或840 bp DNA片段，據(jù)此可將全部致病白假絲酵母菌分為A、B、C 3型：僅有450 bp片段者為A型(標(biāo)準(zhǔn)株ATCC90028即屬于該基因型)，僅有840 bp片段者為B型，兩條片段均有為C型(見圖1)。妊娠與非妊娠VVC患者不同基因型白假絲酵母菌菌株構(gòu)成比比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.189，P=0.114)。

妊娠VVC患者A基因型菌株的咪康唑MIC值高于非妊娠VVC患者A基因型菌株(Z=2.804,P=0.005),而制霉菌素MIC值低于非妊娠VVC患者A基因型菌株(Z=4.869，P<0.001)。妊娠VVC致病白假絲酵母菌B、C基因型菌株全部對克霉唑、咪康唑敏感，而A基因型菌株的敏感率分別為91.15%、89.38%；非妊娠VVC致病白假絲酵母菌B基因型菌株全部對克霉唑、制霉菌素敏感，C基因型菌株全部對克霉唑、咪康唑敏感，而A基因型對克霉唑、制霉菌素、咪康唑的敏感率分別為94.74%、69.08%、80.30%(見表3)。

注：M=DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)，1=標(biāo)準(zhǔn)株ATCC90028，B=B基因型菌株，C=C基因型菌株，其余未標(biāo)出均為A基因型

圖1白假絲酵母菌INT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

Figure 1INT-PCR amplificantion results of candida albicans

3討論

本研究中，非妊娠VVC患者陰道白假絲酵母菌檢出率為84.26%，與何亮等[8]白假絲酵母菌檢出率為84.91%的結(jié)果接近，略高于國外76.3%的報(bào)道[9]，妊娠VVC患者陰道白假絲酵母菌檢出率為76.14%，低于非妊娠VVC患者，提示無論妊娠與否，VVC患者的陰道致病假絲酵母菌均以白假絲酵母菌最為多見，但妊娠期白假絲酵母菌比例降低而非白假絲酵母菌比例增加。體外藥敏結(jié)果MIC值比較顯示，非妊娠VVC致病白假絲酵母菌克霉唑、咪康唑MIC值均低于非白假絲酵母菌，但妊娠VVC患者咪康唑、制霉菌素MIC值均低于非妊娠VVC患者；除證實(shí)白假絲酵母菌對抗真菌藥物相對敏感外，還提示妊娠VVC患者對某些藥物的敏感性與非妊娠VVC患者存在一定差異，其機(jī)制可能與妊娠期VVC治療用藥局限性減少了繼發(fā)性藥物敏感性降低有關(guān)，但這一推論還需更多研究證實(shí)。

表2　妊娠與非妊娠VVC患者致病菌體外藥敏實(shí)驗(yàn)MIC值

表3　不同基因型白假絲酵母菌對不同抗真菌藥物的敏感性分析

CLSI的M27-A方案是國際公認(rèn)的假絲酵母菌體外藥敏研究金標(biāo)準(zhǔn)[3]，但該標(biāo)準(zhǔn)并未給出咪康唑和制霉菌素的MIC節(jié)點(diǎn)值。因此，本研究根據(jù)所測藥物MIC值，綜合CLSI標(biāo)準(zhǔn)和既往文獻(xiàn)報(bào)道確定了3種藥物的節(jié)點(diǎn)值，將所有菌株分為敏感、中敏和耐藥菌株進(jìn)行進(jìn)一步分析比較[3-4，6-7]。結(jié)果提示：對于白假絲酵母菌所致妊娠VVC患者，3種藥物均可選擇，克霉唑、咪康唑略優(yōu)，而非白假絲酵母菌所致妊娠VVC患者可優(yōu)先選擇制霉菌素和咪康唑；對于非妊娠VVC患者，無論致病菌種如何，克霉唑均可優(yōu)先選擇，咪康唑?yàn)榇芜x。

假絲酵母菌的rDNA為串狀重復(fù)序列，包括編碼25S、18S、5.8S的基因，本研究所采用的INT引物是針對白假絲酵母菌的25S rRNA設(shè)計(jì)的特異引物，該區(qū)包括459個(gè)基因序列，可擴(kuò)增450 bp片段(A基因型)，在該區(qū)域插入大小為379 bp的基因即可擴(kuò)增出840 bp片段(B基因型)，若同時(shí)擴(kuò)增出450 bp和840 bp片段則為C基因型。本研究中，所有致病白假絲酵母菌經(jīng)特異INT引物PCR擴(kuò)增后，均獲得清晰而穩(wěn)定的條帶，檢測成功率100%，VVC患者致病白假絲酵母菌均同時(shí)具有A、B、C 3種基因型，且以A基因型最為多見；妊娠與非妊娠患者并不存在不同基因型構(gòu)成比的差異。

分析A、B、C 3種基因型白假絲酵母菌對上述3種抗真菌藥物的敏感性差異，結(jié)果顯示：妊娠VVC患者A基因型菌株的咪康唑MIC值高于非妊娠VVC患者A基因型菌株,而制霉菌素MIC值低于非妊娠VVC患者A基因型菌株。進(jìn)一步分析不同基因型菌株對3種藥物的敏感、中敏和耐藥菌株構(gòu)成比可以看出：妊娠VVC致病白假絲酵母菌B、C基因型菌株全部對克霉唑、咪康唑敏感，而A基因型敏感菌株分別為91.15%、89.38%；非妊娠VVC致病白假絲酵母菌B基因型菌株全部對克霉唑、制霉菌素敏感，C基因型菌株全部對克霉唑、咪康唑敏感，而A基因型對克霉唑、制霉菌素、咪康唑敏感率分別為94.74%、69.08%、80.30%。上述結(jié)果提示不同基因型VVC致病白假絲酵母菌存在對抗假絲酵母菌藥物的敏感性差異，不同患者中的同一基因型菌株也存在藥物敏感性差異，對相關(guān)問題的進(jìn)一步研究可望為將來更有效地治療妊娠和非妊娠VVC患者提供幫助。

作者貢獻(xiàn)：祁文瑾進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負(fù)責(zé)；李白鸞進(jìn)行質(zhì)量控制、實(shí)驗(yàn)實(shí)施和評估；錢源進(jìn)行資料收集和部分實(shí)驗(yàn)。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：賈萌萌)

·讀者服務(wù)·

2016年《中國全科醫(yī)學(xué)》部分專題方向預(yù)告

《中國全科醫(yī)學(xué)》在借鑒WONCA大會主題內(nèi)容的基礎(chǔ)上，結(jié)合目前我國臨床醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)及全科醫(yī)生關(guān)注的疾病，2016年擬刊出的專題方向如下：(1)自閉癥兒童的篩查、診斷和早期干預(yù)；(2)骨質(zhì)疏松的治療課題研究；(3)乳腺癌：乳腺癌研究新進(jìn)展，乳腺癌篩查、預(yù)防和控制，乳腺癌治療的最佳臨床實(shí)踐等；(4) 精神疾病的規(guī)范化診斷與治療及管理；(5) 糖尿病防治新技術(shù)；(6) 哮喘治療課題研究；(7) 結(jié)核的治療及抗結(jié)核藥物研究；(8) 肝炎的治療課題研究；(8) 艾滋病的流行病學(xué)及臨床管理。

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(本刊編輯部整理)

·用藥分析·

【關(guān)鍵詞】念珠菌病，外陰陰道；妊娠；基因型；微生物敏感性試驗(yàn)

祁文瑾，李白鸞，錢源.假絲酵母菌性外陰陰道病不同基因型致病菌株藥物敏感性比較[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(2)：233-237.[www.chinagp.net]

Qi WJ，Li BL，Qian Y.Comparison of susceptibility of pathogenic microorganisms of different genotypes in patients with vulvovaginal candidiasis[J].Chinese General Practice，2016，19(2)：233-237.

Comparison of Susceptibility of Pathogenic Microorganisms of Different Genotypes in Patients With Vulvovaginal CandidiasisQIWen-jin，LIBai-luan，QIANYuan.DepartmentofObstetrics&Gynecology，theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversty，Kunming650032，China

【Abstract】ObjectiveTo conduct genetic typing on pathogenic microorganisms in pregnant and non-pregnant patients with vulvovaginal candidiasis(VVC)and investigate the difference in the susceptibility of pathogenic microorganisms of different genotypes towards antifungal drugs.MethodsWe enrolled 373 VVC outpatients who were treated in the Department of Obstetrics & Gynecology of the First Affiliated Hospital of Kunming Medical Universty from 2011 to 2014，among which 197 patients were not pregnant and 176 pateins were pregnant(10 weeks to 40 weeks).Using CHROM agar Salmonella Medium and Vitek 2 system，the pathogenic microorganisms were identified.In vitro tests on drug sensitivity to clotrimazole，nystatin and miconazole were conducted using the improved version of trace plate dilution method.Specific primer PCR was used to congduct genetic typing on pathogenic candida albicans.In vitro chemo-drug sensitive tests were undertaken on candida isolates with different genotypes of VVC.ResultsA total of 166(84.26%)stains of candida albicans were detected in non-pregnant VVC patients，and 134(76.14%)stainswere detected in pregnant VVC patients.Pregnant VVC patients had lower detection rate of candida albicans than non pregnant VVC patients(χ2=3.901，P=0.048).In all patients，the MIC values of clotrimazole and miconazole of pathogenic candida albicans were lower than non candida albicans candida species(pregnant:Zclotrimazole=6.275，P<0.001；Zmiconazole=5.102，P<0.001；non-pregnant:Zclotrimazole=3.095，P=0.002；Zmiconazole=2.169，P=0.030)；pregnant patients had lower MIC values of miconazole and nystatin than non pregnant patients(Z=3.074，P=0.002；Z=4.982，P<0.001).Pregnant patients had high proportion(≥91.04%)of strains of pathogenic candida albicans sensitive to clotrimazole and miconazole，and strains with drug resistance was in a small proportion；non-pregnant patients had high proportion(96.38%)of strains of pathogenic candida albicans sensitive to clotrimazole.In pregnant patients，there were 133 strains of A genotype，10 strains of B genotype and 11 strains of C genotype，and the numbers for non-pregnant patients were 152，5 and 9 respectively.The two groups were not significantly different in the proportions of candida albicans stains of different genotypes(χ2=4.189，P=0.114).Pregnant patients were higher than non-pregnant patients in the MIC value of miconazole and lower than non-pregnant in the MIC value of nystatin of strains of A genotype(Z=2.804，P=0.005；Z=4.869，P<0.001).In prenant patients，pathogenic candida albicans strains of B genotype and C genotype were all sensitive to clotrimazole and miconazole，and the proportions of pathogenic candida albicans strains of A genotype sensitive to clotrimazole and miconazole were 91.15% and 89.38% respectively；in non-pregnant patients，pathogenic candida albicans strains of B genotype were all sensitive to clotrimazole and nystatin，and those of C genotype were all sensitive to clotrimazole and miconazole，while the proportions of strains of genotype A sensitive to clotrimazole，nystatin and miconazole were 94.74%，69.08% and 80.30% respectively.ConclusionClotrimazole is the primary therapy in the treatment of nonpregnant VVC patients，while miconazole is the primary choice for pregnant VVC patients.Candida albicans strains of genotype A are the most common in either pregnant and non-pregnant VVC patients，and difference exists in candida albicans strains of different genotypes in VVC patients in the sensitivity towards anti-fungus drugs.

【Key words】Candidiasis，vulvovaginal；Pregnancy；Genotype；Microbial sensitivity tests

收稿日期：(2015-07-08；修回日期：2015-11-16)

【中圖分類號】R 711.31

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.02.023

通信作者：祁文瑾，650032云南省昆明市，昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科；E-mail：wenjincookie@163.com

基金項(xiàng)目：作者單位：650032云南省昆明市，昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科