龍膽瀉肝湯氯仿提取物對(duì)白念珠菌VVC臨床株菌絲抑制作用研究

王霞 吳大強(qiáng) 施高翔 段強(qiáng)軍 邵菁 汪天明 汪長(zhǎng)中

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院，合肥 230038；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院 中西醫(yī)結(jié)合研究所，合肥 230038)

·論著·

龍膽瀉肝湯氯仿提取物對(duì)白念珠菌VVC臨床株菌絲抑制作用研究

王霞1,2吳大強(qiáng)1,2施高翔1,2段強(qiáng)軍1,2邵菁1,2汪天明1,2汪長(zhǎng)中1,2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院，合肥 230038；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院 中西醫(yī)結(jié)合研究所，合肥 230038)

目的 觀察龍膽瀉肝湯氯仿提取物 (chloroform extracts of Longdan xiegan decoction,CELX)對(duì)白念珠菌菌絲形成的影響，探討其可能的作用機(jī)制。方法 采用微量稀釋法測(cè)定龍膽瀉肝湯不同溶劑提取物對(duì)15株VVC臨床株的最低抑菌濃度 (minimal inhibitory concentration,MIC)；采用固體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基觀測(cè)菌落形態(tài)及菌絲侵襲能力；XTT還原法評(píng)價(jià)白念珠菌菌絲活性；平板法計(jì)數(shù)6 h內(nèi)藥物對(duì)白念珠菌CFU的影響；熒光顯微鏡下觀察菌絲代謝活力；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)檢測(cè)其菌絲相關(guān)基因：ALS3、SSA1、SUN41、HWP1、UME6和ECE1的表達(dá)量。結(jié)果 CELX對(duì)15株VVC臨床株MIC介于32～64 mg/L之間，效果優(yōu)于總提物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物的MIC；256 mg/L的CELX能顯著抑制菌絲的形成；256 mg/L的CELX在固體培養(yǎng)基中可抑制菌落褶皺，在半固體培養(yǎng)基中可抑制菌絲侵襲；qRT-PCR結(jié)果顯示256 mg/L CELX可使菌絲相關(guān)基因ALS3、SSA1、SUN41、HWP1、UME6和ECE1分別下調(diào)81.6%、60.2%、69.8%、73.7%、49.5%、52.8%。結(jié)論 龍膽瀉肝湯氯仿提取物 (CELX)可通過(guò)影響菌絲相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)抑制菌絲的形成，從而降低白念珠菌對(duì)機(jī)體的侵襲力。

龍膽瀉肝湯；白念珠菌；外陰陰道念珠菌??；菌絲

[Chin J Mycol，2016，11(6):341-347]

外陰陰道念珠菌病 (vulvovaginal candidiasis，VVC)是一種主要由白念珠菌引起的陰道真菌感染性疾病，病情常遷延難愈，復(fù)發(fā)率較高，對(duì)婦女的身心健康影響較明顯。氟康唑等西藥雖有較好療效，但易產(chǎn)生耐藥性。中藥用于治療VVC具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。其中，龍膽瀉肝湯是臨床上治療VVC的常見(jiàn)方藥。

龍膽瀉肝湯[1]出自《醫(yī)方集解》引《太平惠民和劑局方》，原方中龍膽草為君藥，大苦大寒，瀉火除濕；黃芩、梔子亦苦寒，瀉肝膽濕熱，助君藥清熱除濕為臣藥；木通、澤瀉、車(chē)前子清利肝經(jīng)濕熱；生地黃、當(dāng)歸養(yǎng)血滋陰，顧護(hù)肝體，標(biāo)本兼顧。柴胡疏暢肝膽之氣，引諸藥入肝膽經(jīng)；以上共為佐藥，甘草和中調(diào)和諸藥，為佐使藥。方中諸藥合用，共奏瀉肝膽實(shí)火，清下焦?jié)駸帷Ｔ趮D科疾病的治療方面，龍膽瀉肝湯已成為歷代醫(yī)家所廣泛應(yīng)用的良方[2]。本實(shí)驗(yàn)主要探討龍膽瀉肝湯對(duì)白念珠菌VVC臨床株的重要致病物質(zhì)——菌絲侵襲力的干預(yù)作用及機(jī)制，以期為治療白念珠菌VVC 感染提供依據(jù)。

1 材 料

1.1 菌株與藥物

白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株SC5314及質(zhì)控菌株近平滑念珠菌ACTT22019由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院姜遠(yuǎn)英教授惠贈(zèng)。15株白念珠菌VVC臨床分離株由合肥市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科陶瑞雪主任及安徽省立醫(yī)院檢驗(yàn)科魯懷偉主任惠贈(zèng)。龍膽瀉肝湯復(fù)方中10味中藥 (龍膽草、黃芩、梔子、木通、澤瀉、車(chē)前子、生地、當(dāng)歸、柴胡、甘草)購(gòu)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，并經(jīng)鑒定。

1.2 試劑

甲醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇均為分析純，由上海中試化工總公司提供，溶壁酶 (SIGMA公司)，Total RNA提取試劑及PCR反應(yīng)試劑 (日本TOYOBO公司)，引物 (上海生工生物工程有限公司)。

1.3 培養(yǎng)基

RPMI 1640液體培養(yǎng)基，1 mol/L NaOH溶液調(diào)整該液體培養(yǎng)基在25℃的pH為7.0±0.1，濾過(guò)除菌，4℃保存?zhèn)溆?。沙氏液體培養(yǎng)基 (青島高科技海博生物技術(shù)有限公司)，YPD培養(yǎng)基 (北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司)。

1.4 儀器

RE2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海亞榮生化儀器廠)；96孔微量培養(yǎng)板 (美國(guó)康寧公司)；DPH-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 (上海一恒科技有限公司)；血細(xì)胞計(jì)數(shù)板 (上海求精生化試劑儀器有限公司)；CKX41-32型倒置顯微鏡 (日本OLYMPUS公司)；ABI7000熒光定量PCR儀 (美國(guó)生物應(yīng)用系統(tǒng)公司)。

2 方 法

2.1 龍膽瀉肝湯提取物的制備

將龍膽瀉肝湯按5倍量80%甲醇水溶液加熱 (70℃)冷凝回流4次，每次3 h，過(guò)濾，濾液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮揮干，有機(jī)溶劑用水分散，然后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，分別得到石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物，正丁醇提取物，并將各溶劑提取物用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，充分蒸干溶劑，最終得到相應(yīng)的固體濃縮物。

2.2 菌懸液的配制

從4℃保存的沙氏固體培養(yǎng)基上挑取白念珠菌VVC臨床株單個(gè)菌落，接種至沙氏液體培養(yǎng)液中，37℃、200 r/min培養(yǎng)16 h，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，再用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋至2×106CFU/mL，備用。

2.3 微量稀釋法測(cè)定龍膽瀉肝湯不同溶劑萃取物對(duì)白念珠菌VVC臨床株的最低抑菌濃度 (minimal inhibitory concentration,MIC)

依據(jù)CLSI的M27-A3方案[3],先按二倍稀釋法配制不同濃度提取物，使其終濃度為2 048、1 024、512、256、128、64、32、16、8 mg/L，按每孔100 μL加入96孔板中，再加入2.0×103CFU/mL菌體的混懸液100 μL，37℃培養(yǎng)48 h，以肉眼觀察無(wú)菌生長(zhǎng)的最小藥物稀釋度作為各菌株的MIC。同時(shí)設(shè)培養(yǎng)基空白對(duì)照和培養(yǎng)基加菌體 (不含藥物)的陰性對(duì)照 (或稱(chēng)生長(zhǎng)對(duì)照)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，選取效果最好的溶劑萃取部位進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)氯仿提取物 (chloroform extracts of Longdan xiegan decoction,CELX)的抑菌效果最好，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用該提取物。

2.4 液體培養(yǎng)基中觀察菌絲形態(tài)

取100 μL白念珠菌菌懸液 (2×106CFU/mL)與100 μL終濃度為256、128、64 mg/L的龍膽瀉肝湯氯仿提取物 (chloroform extracts of Longdan xiegan decoction,CELX)于96孔板中混合，同時(shí)設(shè)置空白組、氟康唑陽(yáng)性對(duì)照藥 (32 mg/L)組。37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，用光學(xué)顯微鏡觀察并用相機(jī)拍攝其菌絲形態(tài)。

2.5 固體培養(yǎng)基上觀察菌落形態(tài)

配制YPD固體培養(yǎng)基，分別加入終濃度為256、128、64 mg/L的CELX。用倍比稀釋法將白念珠菌菌懸液稀釋至20 CFU/mL，用微量移液器吸取100 μL，均勻涂布于YPD固體培養(yǎng)基上。同時(shí)設(shè)置空白組、氟康唑陽(yáng)性對(duì)照藥 (32 mg/L)組。在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后，用光學(xué)顯微鏡觀察并用相機(jī)拍攝其菌落形態(tài)。

2.6 半固體培養(yǎng)基中觀察菌絲侵襲現(xiàn)象

配制YPD半固體培養(yǎng)基[4]，加入終濃度為256、128、64 mg/L的CELX。用倍比稀釋法將白念珠菌菌懸液稀釋至20 CFU/mL。取100 μL于半固體培養(yǎng)基上，用稀釋涂布法均勻涂布，同時(shí)設(shè)置空白組、氟康唑陽(yáng)性對(duì)照藥組。37℃培養(yǎng)5 d后切開(kāi)培養(yǎng)基，拍攝橫切面白念珠菌絲侵襲程度。

2.7 XTT還原法評(píng)價(jià)白念珠菌菌絲活性

將100 μL白念珠菌菌懸液 (2×106CFU/mL)與100 μL終濃度為256、128、64 mg/L的CELX于96孔板中混合，同時(shí)設(shè)置空白組、氟康唑陽(yáng)性對(duì)照藥 (32 mg/L)組。37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后吸棄培養(yǎng)液，無(wú)菌PBS洗去未黏附菌，各孔加入60 μL XTT，避光培養(yǎng)2 h后,于492 nm處測(cè)吸光度。

2.8 平板法計(jì)數(shù)6 h內(nèi)白念珠菌CFU

將2 mL含CELX液體培養(yǎng)基與2 mL菌液 (2×106CFU/mL)混合后加入24孔板中使其成為終濃度為256、128、64 mg/L的CELX的菌液，同時(shí)設(shè)置空白組、氟康唑陽(yáng)性對(duì)照藥 (32 mg/L)組。37℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)2 h、4 h、6 h后取出，微量移液器吸取100 μL菌液置于新試管中，加入PBS液稀釋后，吸取100 μL菌液均勻涂布于沙氏固體培養(yǎng)基上。37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，計(jì)數(shù)CFU。

2.9 熒光顯微鏡下觀察菌絲代謝活力

取1 mL菌液 (2×106CFU/mL)與1 mL終濃度分別為256、128、64 mg/L CELX于6孔板中混合，每孔分別置入一張無(wú)菌潔凈蓋玻片，37℃，200 r/min培養(yǎng)6 h后取出玻片，無(wú)菌PBS漂洗3次，10 mmol/L FUN1熒光染料避光染色30 min，熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.10 qRT-PCR檢測(cè)菌絲相關(guān)基因的表達(dá)

白念珠菌總RNA的提取 2 mL菌液與2 mL終濃度分別為256、128、64 mg/L CELX混合，37℃，200 r/min作用6 h后，離心收集菌體，用無(wú)菌PBS沖洗3次后進(jìn)行總RNA的提取。具體操作方法參照ToyoBo公司MagExtractor-RNA-提取試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI基因庫(kù)查得所需基因序列，并用Primer Premire 5.0軟件設(shè)計(jì)所需引物，委托上海生工合成引物，各引物情況見(jiàn)表1。

表1 各引物序列表

反轉(zhuǎn)錄為cDNA 遵照ToyoBo公司ReverTraAce qPCR RT Master Mix with gDNA Remover試劑盒說(shuō)明的反應(yīng)條件將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)配置均在冰上操作。具體如下：6 μL RNA先變性 (65℃ 5 min，4℃ 1 min)，然后加入其他反應(yīng)試劑[4×DNA master (55 μL)：gDNA remover (1.1 μL)] 2 μL,5RT-Master MixⅡ 2 μL混合后按如下操作進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：50℃ 5 min；98℃ 5 min；4℃ 1 min。反應(yīng)完成后將cDNA稀釋10倍備用。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng) 采用SYBR Green Real time PCR Master Mix試劑盒,按下列組成配制PCR反應(yīng)，總反應(yīng)體系為25 μL：2×SYBR Green Real time PCR 12.5 μL，PCR Forward Primer (10 μmol/L) 1 μL，PCR Reverse Primer 1 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O 10 μL。擴(kuò)增反應(yīng)在ABI7000熒光定量PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 60 s；擴(kuò)增定量程序40個(gè)循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為：變性95℃ 15 s；退火55℃ 15 s；延伸72℃ 45 s；熔解曲線：60～95℃，加熱速率為0.1℃/s。內(nèi)參基因?yàn)锳CTIN。每個(gè)樣品均設(shè)置3重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

定量分析 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，分別測(cè)定目的基因ALS3、SSA1、SUN41、HWP1、UME6和ECE1及內(nèi)參ACT1的CT值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取其平均值。采用相對(duì)定量方式表示各樣品目的基因的表達(dá)量，計(jì)算⊿CT=CT目的基因-CT內(nèi)參基因及2-⊿⊿CT值，2-⊿⊿CT表示目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的表達(dá)倍數(shù)。

2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié) 果

3.1 龍膽瀉肝湯各萃取部位對(duì)白念珠菌VVC臨床株的MIC

相較于其他萃取部位，CELX對(duì)15株VVC臨床株的抑菌能力最強(qiáng)，MIC為32～64 mg/L，氟康唑?qū)?biāo)準(zhǔn)菌株SC5314的MIC為0.5 mg/L，在正常范圍之內(nèi) (見(jiàn)表2)。因有11株臨床株的MIC為64 mg/L，故選取一株該抑菌濃度的VVC臨床株CA14進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

3.2 液體培養(yǎng)基中CELX作用6 h后對(duì)白念珠菌菌絲形態(tài)影響

倒置顯微鏡下觀察到，空白對(duì)照組有大量菌絲，縱橫密集交織；64 mg/L CELX組較對(duì)照組菌絲相有所減少，并可見(jiàn)一定量的酵母相；128 mg/L CELX組有大量的酵母，只有少量菌絲；256 mg/L CELX組則均為酵母相，氟康唑作為陽(yáng)性對(duì)照藥，在濃度為32 mg/L時(shí)，有大量酵母相，可見(jiàn)少量菌絲相。如圖1。

表2 各溶劑萃取部位對(duì)VVC臨床株的MIC (mg/L)

Tab.2 The MICs of extracts toCandidaalbicansisolated from VVC (mg/L)

菌株總提物石油醚氯仿乙酸乙酯正丁醇水提物氟康唑SC53145121024128512102410240.5CA0151210243251210245121CA02512102432512102451216CA03512102464256102410244CA04512102464512102410244CA05512102464256512102432CA06512102464256512102432CA0751210243225651251216CA085121024642565125124CA09102410246425651210244CA101024102464512102410248CA111024102464512102410248CA1210241024645121024102416CA135121024322565125122CA14512102464256512102432CA1510241024645121024102464

3.3 CELX對(duì)白念珠菌在固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)與半固體培養(yǎng)基中菌絲侵襲能力的影響

觀察固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組菌落邊緣呈鋸齒狀，表面出現(xiàn)可視菌絲且滲透培養(yǎng)基內(nèi)部，64 mg/L CELX低劑量組菌落邊緣呈鋸齒狀，培養(yǎng)基內(nèi)部菌絲變短，128 mg/L、256 mg/L CELX組則觀察不到褶皺，邊緣光滑。陽(yáng)性對(duì)照組為32 mg/L氟康唑，其菌落表面皺縮，邊緣平滑。

半固體培養(yǎng)基中，空白對(duì)照組菌絲能夠深入培養(yǎng)基內(nèi)部，而隨著CELX組藥物濃度的不斷增加，其菌絲長(zhǎng)度越來(lái)越短，256 mg/L CELX組菌絲則完全消失。32 mg/L氟康唑陽(yáng)性藥對(duì)照組其菌絲較短，呈簇狀。見(jiàn)圖2。

3.4 XTT還原法評(píng)價(jià)CELX對(duì)白念珠菌菌絲活性的影響

CELX與白念珠菌作用6 h后，與空白對(duì)照組相比，64 mg/L用藥組吸光度有所降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，128 mg/L、256 mg/L用藥組白念珠菌菌絲代謝活力顯著下降，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖3。

3.5 平板法計(jì)數(shù)6 h內(nèi)藥物對(duì)白念珠菌CFU的影響

通過(guò)平板計(jì)數(shù)菌落形成單位數(shù)量，根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算原始CFU后，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)4 h、6 h時(shí)，256 mg/L組能明顯抑制白念珠菌的生長(zhǎng)。見(jiàn)圖4。

3.6 熒光顯微鏡下觀察菌體形態(tài)及代謝活力

FUN1染色后，熒光顯微鏡下空白對(duì)照組有大量菌絲，相互交錯(cuò)，且熒光呈黃色，表明代謝旺盛；隨著用藥組CELX濃度的增加，菌絲量逐漸減少，CELX濃度為128 mg/L時(shí)，可見(jiàn)少量菌絲，熒光呈綠色，顯示代謝開(kāi)始減弱，256 mg/L CELX用藥組中則均為酵母相，綠色熒光偏暗；陽(yáng)性對(duì)照藥組中未見(jiàn)菌絲，可見(jiàn)綠色熒光。見(jiàn)圖5。

3.7 CELX對(duì)VVC臨床株菌絲相關(guān)基因的表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組相比，CELX在64 mg/L時(shí)，ALS3下調(diào)了61.5%，128 mg/L時(shí)，ALS3、SUN41、HWP1分別下調(diào)了67.3%、57.3%、56.9%；256 mg/L時(shí)，除UME6外，ALS3、SSA1、SUN41、HWP1、ECE1分別下調(diào)了81.6%、60.2%、69.8%、73.7%、52.8%。見(jiàn)圖6。

4 討 論

在正常情況下，白念珠菌以一定數(shù)量的酵母相定植于人體黏膜表面并不引起疾病。然而，在機(jī)體免疫力低下或菌群失調(diào)時(shí)，白念珠菌通過(guò)二相性形態(tài)轉(zhuǎn)化即由酵母相形成菌絲相，同時(shí)產(chǎn)生水解酶如分泌型天冬氨酸蛋白酶 (SAP)、磷脂酶、脂肪酶等，實(shí)現(xiàn)對(duì)宿主細(xì)胞尤其是黏膜細(xì)胞的侵襲[5]?，F(xiàn)認(rèn)為，外陰陰道念珠菌病 (VVC)的發(fā)生與陰道微環(huán)境改變或局部免疫功能減退導(dǎo)致白念珠菌大量繁殖，并由酵母相轉(zhuǎn)變?yōu)榫z相進(jìn)而侵襲陰道黏膜細(xì)胞導(dǎo)致陰道炎癥損傷密切相關(guān)[6]。

此前，本課題組已經(jīng)證實(shí)，龍膽瀉肝湯提取物對(duì)白念珠菌生物膜具有一定的抑制作用[7]，但對(duì)其重要致病物質(zhì)——菌絲的侵襲力是否具有干預(yù)效應(yīng)尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)測(cè)定龍膽瀉肝湯各提取部位 (石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水)對(duì)15株白念珠菌VVC臨床株的最小抑菌濃度 (MIC)，證實(shí)龍膽瀉肝湯氯仿提取物 (CELX)為最佳的提取部位，其MIC為32～64 mg/L，遠(yuǎn)低于其他提取物，表明CELX對(duì)白念珠菌具有顯著的抑制作用。同時(shí)選取了一株具有代表性的VVC臨床菌株進(jìn)行后面的一系列實(shí)驗(yàn)。

在本實(shí)驗(yàn)通過(guò)液體培養(yǎng)基的觀察發(fā)現(xiàn)，256 mg/L的CELX能顯著抑制菌絲的形成。在固體培養(yǎng)基中，空白對(duì)照組菌落表面出現(xiàn)可視菌絲且深入培養(yǎng)基內(nèi)部，菌落邊緣呈鋸齒狀。用藥組均未見(jiàn)絲化現(xiàn)象，且隨著用藥劑量的增加，菌落邊緣逐漸平整光滑，菌落中心皺縮越來(lái)越小。

外陰陰道念珠菌病 (VVC)中，菌絲可以通過(guò)主動(dòng)侵入陰道黏膜細(xì)胞間隙繼而侵害表皮細(xì)胞層[8]，本實(shí)驗(yàn)中半固體瓊脂培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)，其凝固后的瓊脂內(nèi)形成的孔狀結(jié)構(gòu)可以一定程度上代表細(xì)胞間的間隙。在該實(shí)驗(yàn)中，空白對(duì)照組菌絲能夠深入培養(yǎng)基內(nèi)部，而隨著用藥組濃度的不斷增加，其菌絲長(zhǎng)度越來(lái)越短，圖片顯示256 mg/L CELX組菌絲則完全消失?？傊?，液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示了CELX對(duì)VVC臨床菌株菌絲的抑制作用，且呈劑量依賴(lài)性。

為了檢測(cè)不同濃度CELX對(duì)白念珠菌代謝活力及形態(tài)影響，以FUN-1熒光染料進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下觀察。本實(shí)驗(yàn)中，空白對(duì)照組中有大量菌絲相互交錯(cuò)，且由于菌絲代謝活性旺盛，其菌絲的熒光呈黃色 (紅移)，隨著用藥組濃度的增加，菌絲相逐漸減少，熒光偏向與原始的綠色 (藍(lán)移)，表明菌絲受到抑制且代謝活性降低。同時(shí)，通過(guò)XTT還原法和平板法計(jì)數(shù)白念珠菌CFU，進(jìn)一步驗(yàn)證了256 mg/L CELX能影響白念珠菌的代謝活性。

為了進(jìn)一步了解CELX對(duì)VVC臨床菌株菌絲的作用，本實(shí)驗(yàn)采用了qRT-PCR法檢測(cè)ALS3，SSA1，SUN41，HWP1，UME6，ECE1等菌絲相關(guān)基因的表達(dá)量[9-11]。其中，ALS3，SSA1基因所編碼的產(chǎn)物 (als3p，ssa1p)又稱(chēng)為“侵襲素”，能與宿主細(xì)胞相應(yīng)的受體 (如N-鈣粘蛋白、E-鈣粘蛋白等)結(jié)合，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞對(duì)菌體的內(nèi)吞進(jìn)而造成侵襲損害[12-13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，除UME6外，ALS3，SSA1，SUN41，HWP1，ECE1均呈不同程度的下調(diào)，說(shuō)明CELX可能通過(guò)影響菌絲相關(guān)基因表達(dá)來(lái)抑制菌絲的形成從而降低白念珠菌對(duì)機(jī)體的侵襲能力。

中藥氯仿提取物中一般含有游離生物堿、有機(jī)酸、黃酮及香豆素類(lèi)等成分，龍膽瀉肝湯是由10味中藥組成的復(fù)方，其CLEX提取物中抗白念珠菌菌絲的的主要有效成分以及作用機(jī)制值得進(jìn)一步探討。

圖1 RPMI 1640液體培養(yǎng)基中CELX對(duì)白念珠菌菌絲形態(tài)的影響 (×400)：a.空白對(duì)照組,b.64 mg/L CELX,c.128 mg/L CELX,d.256 mg/L CELX,e.32 mg/L氟康唑 圖2 CELX對(duì)白念珠菌在固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)與半固體培養(yǎng)基中菌絲侵襲能力的影響：a,f,k.空白對(duì)照組;b,g,l.64 mg/L CELX;c,h,m.128 mg/L CELX;d,i,n.256 mg/L CELX;e,j,o.32 mg/L氟康唑 (a～e為相機(jī)拍攝的固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)，f～j為顯微鏡下固體培養(yǎng)基菌落邊緣的形態(tài) (×40)，k～o為顯微鏡下半固體培養(yǎng)基中菌絲向內(nèi)侵襲形態(tài) (×40)) 圖3 CELX對(duì)白念珠菌菌絲活性的影響 (與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01) 圖4 平板法計(jì)數(shù)6 h內(nèi)藥物對(duì)白念珠菌CFU的影響 (與空白組對(duì)比，*P<0.05) 圖5 熒光顯微鏡下不同濃度CELX對(duì)白念珠菌絲代謝活力及形態(tài)影響 (×400)：a.空白對(duì)照組,b.64 mg/L CELX,c.128 mg/L CELX,d.256 mg/L CELX,e.32 mg/L氟康唑

Fig.1 The effect of CELX against hyphae formation ofCandidaalbicansFig.2 The effects of CELX on colonies on solid media and invasive growth in semi-solid media forCandidaalbicansFig.3 The activity of hyphae ofC.albicanstreated by CELX for 6 h (Compared with control group,*P<0.05，**P<0.01) Fig.4 CFU variation of plate assay count (Compared with control group,*P<0.05) Fig.5 Fluorescence microscopic images ofCandidaalbicanshyphae treated with CELX

圖6 CELX對(duì)VVC臨床株菌絲相關(guān)基因的表達(dá)的影響 (與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01)

Fig.6 Expression of hyphae-specific genes ofCandidaalbicanstreated CELX by qRT-PCR (Compared with control group,*P<0.05，**P<0.01)

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[本文編輯] 王 飛

Inhibitory effects of chloroform extracts of Longdan xiegan decoction against hyphae formation ofCandidaalbicansisolated from VVC

WANG Xia，WU Da-qiang，SHI Gao-xiang，DUAN Qiang-jun，SHAO Jing，WANG Tian-ming，WANG Chang-zhong

(SchoolofIntegratedTraditionalandWesternMedicine，AnhuiUniversityofChineseMedicine,InstituteofIntegratedTraditionalandWesternMedicine，AnhuiAcademyofChineseMedicine,Hefei230038)

Objective To investigate the effects of chloroform extracts of Longdan xiegan decoction (CELX) against hyphae formation ofCandidaalbicansclinical strains isolated from Vulvovaginal Candidiasis (VVC).Methods Microdilution method was used to determine the minimal inhibitory concentrations (MICs) of Longdan xiegan decoction extracts againstC.albicansisolated from VVC.Solid agar and Semi-solid agar were utilized to evaluate colony morphology and invasive growth ofC.albicans,respectively.XTT and Fluorescence microscope assay were applied to determine the metabolic activity of hyphae ofC.albicanstreated by CELX for 6 h.Plate assay counted CFU variation.Quantitative Real-time PCR (qRT PCR) was adopted to analyze the expression of hyphae-specific genes includingALS3,SSA1,SUN41,HWP1,UME6 andECE1.Results The MICs of CELX againstC.albicansstrains were between 32 and 64 mg/L,which were better than MICs of total extract,petroleum ether extract,ethyl acetate extract,buty alcohol extract and water extract.CELX with concentration of 256 mg/L inhibited hyphae formation and influenced colony morphology significantly,with the wrinkle in solid agar and invasion in semi-solid agar being blocked.The expression of hyphae formation related genes,ALS3,SSA1,SUN41,HWP1,UME6 andECE1 were down-regulated by 81.6%,60.2%,69.8%,73.7%,49.5%,52.8%.Conclusion Our results suggested that CELX could inhibit hyphae formation through repress hyphae-relative genes expression to reduce the invasive activity against patient.

Longdan xiegan decoction；Candidaalbicans；vulvovaginal candidasis (VVC);hyphae

國(guó)家自然科學(xué)基金 (81573725)；安徽省自然科學(xué)基金 (1408085MH165，1508085MH163)

王霞，女 (漢族)，碩士研究生在讀.E-mail:1158880238@qq.com

汪長(zhǎng)中,E-mail:ahwcz63@sina.com

R 379.4

A

1673-3827(2016)11-0341-07

2016-08-08