進(jìn)口奶牛十二指腸賈第蟲(chóng)感染情況及其多位點(diǎn)基因序列研究

王臣榮，張振杰，李俊強(qiáng)，余復(fù)昌，曹建科，張龍現(xiàn)

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南省人獸共患病國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002)

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進(jìn)口奶牛十二指腸賈第蟲(chóng)感染情況及其多位點(diǎn)基因序列研究

王臣榮，張振杰，李俊強(qiáng)，余復(fù)昌，曹建科，張龍現(xiàn)*

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南省人獸共患病國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002)

摘要：為了解進(jìn)口奶牛十二指腸賈第蟲(chóng)感染情況及其集聚體和基因亞型分布特征，作者基于SSU rRNA、tpi、gdh和bg基因位點(diǎn)對(duì)奶牛十二指腸賈第蟲(chóng)進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果如下：基于SSU rRNA基因位點(diǎn)進(jìn)行PCR檢測(cè)，奶牛十二指腸賈第蟲(chóng)感染率為9.5%(48/507)，48份陽(yáng)性樣品均為十二指腸賈第蟲(chóng)集聚體E；斷奶后犢牛感染率最高(20.70%)，不同年齡段奶牛十二指腸賈第蟲(chóng)感染率統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著 (P<0.01)?；趖pi、gdh和bg基因位點(diǎn)分別擴(kuò)增出48份陽(yáng)性樣品中19、28和34個(gè)，1份在tpi基因位點(diǎn)呈集聚體A和E混合感染。多位點(diǎn)基因序列分析和種系進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，該場(chǎng)進(jìn)口奶牛應(yīng)為引進(jìn)后感染十二指腸賈第蟲(chóng)。研究表明進(jìn)口成年奶牛不易攜帶人獸共患十二指腸賈第蟲(chóng)，引種場(chǎng)奶牛傳播人獸共患十二指腸賈第蟲(chóng)風(fēng)險(xiǎn)較低。

關(guān)鍵詞：十二指腸賈第蟲(chóng)；集聚體；基因亞型；奶牛

十二指腸賈第蟲(chóng)(Giardiaduodenalis)可感染包括人在內(nèi)的多種脊椎動(dòng)物，被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為重要的人獸共患寄生蟲(chóng)之一[1]。在亞洲、非洲和拉丁美洲約有2億人感染十二指腸賈第蟲(chóng)，且每年新增約50萬(wàn)有腹瀉、嘔吐等臨床癥狀的賈第蟲(chóng)病患者[2]。成年奶牛感染十二指腸賈第蟲(chóng)后多無(wú)臨床癥狀，犢牛感染十二指腸賈第蟲(chóng)后可出現(xiàn)腹瀉、吸收不良和體重減輕等癥狀[3]。賈第蟲(chóng)病生活史簡(jiǎn)單，主要通過(guò)“糞-口”途徑或直接攝入被污染的食物或水途徑進(jìn)行傳播，流行病學(xué)研究表明，奶牛是人類感染十二指腸賈第蟲(chóng)的重要傳染源[4]。

基于分子生物學(xué)研究，十二指腸賈第蟲(chóng)是一個(gè)復(fù)雜的集合體，已鑒定8個(gè)(A-H)集聚體，其中集聚體A和B為人獸共患集聚體，集聚體E主要感染偶蹄類動(dòng)物[1]。近年來(lái)，包括人在內(nèi)的多種動(dòng)物體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)了集聚體E感染，提示該集聚體存在人獸共患性[1，5]。在比利時(shí)、美國(guó)、加拿大、丹麥、澳大利亞、葡萄牙等國(guó)家，奶牛以集聚體E為優(yōu)勢(shì)感染集聚體；相比之下，在意大利、加拿大和新西蘭等少數(shù)國(guó)家報(bào)道奶牛以集聚體A和B為優(yōu)勢(shì)集聚體[6]。國(guó)內(nèi)在河南省和黑龍江省進(jìn)行的調(diào)查發(fā)現(xiàn)奶牛可感染集聚體A、B和E，存在人獸共患風(fēng)險(xiǎn)[6-7]。目前，我國(guó)已成為世界上最大奶牛進(jìn)口國(guó)，然而有關(guān)進(jìn)口奶牛攜帶十二指腸賈第蟲(chóng)情況及其集聚體分布特征尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)某場(chǎng)自澳大利亞新引奶牛進(jìn)行十二指腸賈第蟲(chóng)分子流行病學(xué)調(diào)查，采用多位點(diǎn)序列分型方法進(jìn)行基因亞型鑒定，并比較引進(jìn)地奶牛十二指腸賈第蟲(chóng)集聚體分布特征，以解析十二指腸賈第蟲(chóng)的遺傳穩(wěn)定性及其生物安全影響。

1材料與方法

1.1樣品采集

調(diào)查樣品來(lái)自河南省某規(guī)?；M(jìn)口奶牛場(chǎng)，該場(chǎng)于2013年4月20日從澳大利亞引進(jìn)1 000頭荷斯坦成年奶牛(除此之外無(wú)其他奶牛)，采用人工授精方式進(jìn)行配種繁育。2014年6月至2014年12月對(duì)該場(chǎng)隨機(jī)經(jīng)直腸采集507頭奶牛新鮮糞便樣品，每份10～30 g，裝入潔凈自封袋中，記錄信息，帶回實(shí)驗(yàn)室，置4 ℃保存。奶牛年齡劃分參照中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部《奶牛標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)模養(yǎng)殖生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范(試行)》，60 d以下為斷奶前犢牛，61～180 d為斷奶后犢牛，181～450 d為育成牛，450 d以上為成年牛。

1.2DNA提取

每份糞便樣品取約200 mg，用美國(guó)OMEGA Bio-Tek公司生產(chǎn)的糞便DNA提取試劑盒(E.Z.N.A.?Stool DNA Kit，D4015-02)，購(gòu)于鄭州科貿(mào)生物技術(shù)有限公司，按說(shuō)明書步驟操作，提取的DNA置-20 ℃保存。

1.3PCR擴(kuò)增

基于小亞單位rRNA (SSU rRNA)基因?qū)λ袠悠愤M(jìn)行賈第蟲(chóng)檢測(cè)，引物及反應(yīng)程序參照A.J.Appelbee等[8]的方法，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反應(yīng)體系：2 μL DNA (第2輪模板為第1輪PCR產(chǎn)物)，0.4 μL上游引物(25 μmol·L-1)，0.4 μL上游引物(25 μmol·L-1)，4 μL dNTPs (2.5 mmol·L-1)，12.5 μL 2×GC buffer II，0.25 μL LA rTaq 酶(5 U·μL-1)，加蒸餾水至25 μL?；赟SU rRNA基因鑒定出的陽(yáng)性樣品，用磷酸丙糖異構(gòu)酶(tpi)、谷氨酸脫氫酶(gdh)和β-賈第素(bg)位點(diǎn)進(jìn)行基因亞型鑒定，引物及反應(yīng)程序分別參照I.M.Sulaiman等[9]、S.M.Cacciò等[10]和M.Lalle等[11]的方法。反應(yīng)體系：2 μL DNA，0.4 μL上游引物(25 μmol·L-1)，0.4 μL上游引物(25 μmol·L-1)，2 μL dNTPs (2.5 mmol·L-1)，2.5 μL 10 × Taq buffer，0.2 μL rTaq 酶(5 U·μL-1)，加蒸餾水至25 μL。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，置紫外凝膠成像儀內(nèi)觀察并拍照。

1.4測(cè)序

PCR產(chǎn)物測(cè)序委托北京諾賽基因有限公司完成，采用雙脫氧終止法進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序儀為ABI PRISMTM 3730 XL DNA Analyzer (Applied Biosystems，USA)。

1.5集聚體和基因亞型鑒定

序列經(jīng)拼接后，在GenBank上用Blast進(jìn)行同源序列搜索，下載相應(yīng)的參考序列應(yīng)用Clustal X V2.0進(jìn)行比對(duì)分析進(jìn)而確定十二指腸賈第蟲(chóng)集聚體的類型、基因亞型及不同序列間的堿基差異。

1.6種系發(fā)育分析

應(yīng)用MEGA 6 (http：//www.megasoftware.net/) 軟件進(jìn)行序列比對(duì)，在GenBank上用Blast進(jìn)行同源序列搜索，采用鄰接法構(gòu)建種系進(jìn)化樹(shù)，用bootstrap對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行可靠性分析，1 000個(gè)重復(fù)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用χ2檢驗(yàn)比較不同年齡段牛十二指腸賈第蟲(chóng)感染率差異，P<0.05時(shí)為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。

2結(jié)果

2.1十二指腸賈第蟲(chóng)感染情況

基于SSU rRNA基因位點(diǎn)，奶牛糞便樣品中十二指腸賈第蟲(chóng)感染率為9.5% (48/507)，其部分電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。斷奶前犢牛、斷奶后犢牛和育成牛感染率分別為10.3% (17/165)、和20.7% (28/135)和2.9% (3/105)，成年牛未見(jiàn)感染。不同年齡段奶牛十二指腸賈第蟲(chóng)感染率統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著(P<0.01)。

2.2集聚體和基因亞型鑒定

48條SSU rRNA序列經(jīng)比對(duì)鑒定，均為集聚體E?；趖pi、gdh和bg基因位點(diǎn)，對(duì)48份陽(yáng)性樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別擴(kuò)增出19、28和34個(gè)。其中1份呈混合感染，在SSU rRNA基因位點(diǎn)鑒定為集聚體E，而在tpi基因位點(diǎn)為集聚體A。

基于tpi基因位點(diǎn)，18條集聚體E序列形成8個(gè)基因亞型，命名為E1～E8。E1 (n=7)是最主要的基因亞型，其序列與孟加拉奶牛源十二指腸賈第蟲(chóng)分離株集聚體E序列一致(GenBank：KJ363351)；E2 (n=5) 序列與河南奶牛源(KF843945)、綿羊源(KP635102)和黑龍江奶牛源(JN162349)十二指腸賈第蟲(chóng)分離株集聚體E序列一致；E8 (n=1) 序列與河南綿羊源(KP635101)和黑龍江綿羊源(JQ928713)十二指腸賈第蟲(chóng)分離株集聚體E序列一致；E3 (n=1) 序列與河南綿羊源(KP635105)和澳大利亞綿羊源(GQ444457)十二指腸賈第蟲(chóng)分離株集聚體E序列相比，分別有4和5個(gè)堿基的差異；E4 (n=1) 序列與吉林奶牛源(KM434077) 十二指腸賈第蟲(chóng)分離株集聚體E序列有1個(gè)堿基差異，E5 (n=1) 序列與斯里蘭卡牛源(KF891310) 十二指腸賈第蟲(chóng)分離株集聚體E序列有2個(gè)堿基差異，E6 (n=1) 序列與澳大利亞綿羊源(GQ444456) 十二指腸賈第蟲(chóng)分離株集聚體E序列有1個(gè)堿基差異，E7(n=1) 序列與澳大利亞綿羊源(GQ444457)十二指腸賈第蟲(chóng)分離株集聚體E序列有2個(gè)堿基差異。E1 (n=7)、E2 (n=5)、E3 (n=1)、E4 (n=1)、E5 (n=1)、E6 (n=1)、 E7(n=1)和E8 (n=1)分別和澳大利亞牛源(KF019197)十二指腸賈第蟲(chóng)分離株集聚體E序列分別有4、3、6、3、5、5、3和3個(gè)堿基差異，見(jiàn)表1。本研究鑒定出的十二指腸賈第蟲(chóng)集聚體A序列與河南牛源(KF843947)、澳大利亞牛源(GQ444447) 十二指腸賈第蟲(chóng)分離株集聚體A序列一致。

基于gdh基因位點(diǎn)，28條集聚體E序列形成7個(gè)基因亞型，分別命名為E1～E7。E1 (n=17)是最主要的基因亞型，其序列與河南奶牛源(KF843925)、澳大利亞牛源(AY178740)十二指腸賈第蟲(chóng)分離株集聚體E序列一致；E2 (n=1)序列與河南奶牛源(KF843924)+二指腸賈第蟲(chóng)分離株集聚體E序列一致； E3 (n=6)序列河南奶牛源(KF843923) 十二指腸賈第蟲(chóng)分離株集聚體E序列一致；E4 (n=1)、E5 (n=1)、E6 (n=1)和E7 (n=1)序列分別與河南奶牛源(KF843925)十二指腸賈第蟲(chóng)分離株集聚體E序列有1、1、2和2個(gè)堿基差異，見(jiàn)表1。

基于bg基因位點(diǎn)，34條集聚體E序列形成7個(gè)基因亞型，分別命名為E1～E7。E1 (n=18)是最主要的基因亞型，其序列與河南綿羊源(KP635114)十二指腸賈第蟲(chóng)分離株集聚體E序列一致；E2 (n=5)、E3 (n=6)、 E4 (n=1)、E5 (n=2)、E6 (n=1)和E7 (n=1)序列分別與上述序列有2、1、1、1、3和2個(gè)堿基差異，見(jiàn)表1。

2.3種系發(fā)育分析

基于tpi基因序列建立種系發(fā)育系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，分為兩個(gè)系群，集聚體A和集聚體E，見(jiàn)圖2。如圖所示，確定分離到的集聚體A1亞型屬AI亞群。優(yōu)勢(shì)基因亞型E1和E2與孟加拉奶牛源、河南省奶牛源和綿羊源十二指腸賈第蟲(chóng)序列在一個(gè)進(jìn)化支上，形成一個(gè)亞群；E3和E6各形成一個(gè)亞群；E4和E8與河南奶牛源、吉林奶牛源和黑龍江綿羊源十二指腸賈第蟲(chóng)序列形成一個(gè)亞群；E5與吉林奶牛源和斯里蘭卡牛源十二指腸賈第蟲(chóng)序列形成一個(gè)亞群；E7與澳大利亞綿羊源和澳大利亞牛源十二指腸賈第蟲(chóng)序列形成一個(gè)亞群。在gdh和bg基因位點(diǎn)，十二指腸賈第蟲(chóng)核酸序列變異較小，未作種系發(fā)育分析。

表1十二指腸賈第蟲(chóng)集聚體E在gdh、tpi和bg位點(diǎn)的核苷酸序列變異

Table 1Mutations in thegdh，tpiandbggenes amongG.duodenalisassemblage E isolates from cattle

堿基位置標(biāo)號(hào)分別以參考序列KJ363351、KF843925和KP635114來(lái)確定，堿基位置1表示參考序列第1個(gè)核酸；“-”表示堿基相同

The sequence of KJ363351，KF843925 and KP635114 is regarded as reference sequence respectively，for example，the number one of base positions is the first nucleic acid；“-” represent the same as reference sequence

3討論

賈第蟲(chóng)的流行病學(xué)調(diào)查常采用的標(biāo)記基因有SSU rRNA、tpi、gdh、bg和延伸因子1-α (el1-α)等，其中tpi基因序列多態(tài)性變異較大，廣泛用于賈第蟲(chóng)集聚體和基因亞型的分類研究[12]。本次調(diào)查，河南省某規(guī)?；瘓?chǎng)進(jìn)口奶牛十二指腸賈第蟲(chóng)感染率為9.5%，略高于河南省(7.2%，128/1 777)、黑龍江省(6.4%，41/643)和寧夏回族自治區(qū)(2.12%，29/1 366)奶牛的感染率[6-7，13]。J.Ng等[14]報(bào)道澳大利亞西部和新南威爾士州小于4月齡犢牛十二指腸賈第蟲(chóng)總感染率為26.9%(98/364)，而K.A.Becher等[15]報(bào)道澳大利亞西部犢牛感染率高達(dá)89% (48/54)。感染率差異往往受多種因素影響，如樣本采集量、檢測(cè)方法、地理環(huán)境、不同的管理方式和季節(jié)等。此次調(diào)查采用PCR方法檢測(cè)，奶牛十二指腸賈第蟲(chóng)感染率高于國(guó)內(nèi)采用顯微鏡檢測(cè)法的報(bào)道[6，16-17]，低于澳大利亞采用PCR方法檢測(cè)的報(bào)道，表明不同檢測(cè)方法和不同地域奶牛十二指腸賈第蟲(chóng)感染率存在差異。

資料顯示，不同年齡段奶牛十二指腸賈第蟲(chóng)感染率存在著較大差異。R.M.O’Handley等[18]報(bào)道澳大利亞2～3月齡斷奶后犢牛十二指腸賈第蟲(chóng)感染率最高為16%，而M.P.Mark-Carew等[19]調(diào)查發(fā)現(xiàn)紐約市31～60日齡斷奶前犢牛感染率較高，為2.5%。本研究發(fā)現(xiàn)斷奶后犢牛十二指腸賈第蟲(chóng)感染率最高，成年牛未發(fā)現(xiàn)十二指腸賈第蟲(chóng)感染，與R.M.O’Handley等[18]報(bào)道相一致，而與國(guó)內(nèi)河南省斷奶前犢牛十二指腸賈第蟲(chóng)感染率(22.7%)和黑龍江省調(diào)查發(fā)現(xiàn)斷奶前犢牛十二指腸賈第蟲(chóng)感染率(16.1%，22/131)最高存在差異[6-7]。分析其原因，可能與管理方法、動(dòng)物健康狀態(tài)和飼喂環(huán)境等因素相關(guān)。

在東北地區(qū)的研究顯示，奶牛主要感染十二指腸賈第蟲(chóng)集聚體E[12]；河南省奶牛除了感染集聚體E，人獸共患集聚體A亦常見(jiàn)[6]；而在黑龍江省則發(fā)現(xiàn)奶牛更常見(jiàn)感染人獸共患集聚體B，集聚體E次之[7]。在澳大利亞的調(diào)查顯示，奶牛最常見(jiàn)感染十二指腸賈第蟲(chóng)集聚體E，偶見(jiàn)人獸共患集聚體A和集聚體B[14-15，18]。本研究基于SSU rRNA基因位點(diǎn)檢測(cè)到48份十二指腸賈第蟲(chóng)均為集聚體E，基于tpi基因位點(diǎn)鑒定1份為集聚體E和A混合感染，表明該場(chǎng)奶牛感染的十二指腸賈第蟲(chóng)人獸共患風(fēng)險(xiǎn)較低。

本研究基于多位點(diǎn)序列分析和種系進(jìn)化樹(shù)分析，該場(chǎng)奶牛所感染的十二指腸賈第蟲(chóng)主要基因亞型與澳大利亞牛源和綿羊源基因亞型差異較大，與河南省當(dāng)?shù)啬膛Ｔ春途d羊源基因亞型序列差異較小，提示進(jìn)口奶牛應(yīng)為引進(jìn)后感染十二指腸賈第蟲(chóng)。此外，十二指腸賈第蟲(chóng)常呈混合感染，應(yīng)采用不同基因位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行鑒定，以確定其基因型及序列多態(tài)性。

4結(jié)論

不同檢測(cè)方法和不同地域奶牛十二指腸賈第蟲(chóng)感染率存在差異，所檢測(cè)進(jìn)口成年奶牛不易攜帶人獸共患十二指腸賈第蟲(chóng)，引種場(chǎng)奶牛傳播人獸共患十二指腸賈第蟲(chóng)風(fēng)險(xiǎn)較低。

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(編輯白永平)

The Investigation of Infection and Multilocus Sequence ofGiardiaduodenalisin Dairy Cattle from an Imported Farm

WANG Chen-rong，ZHANG Zhen-jie，LI Jun-qiang，YU Fu-chang，CAO Jian-ke，ZHANG Long-xian*

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，HenanAgriculturalUniversity，InternationalJointResearchLaboratoryforZoonoticDiseasesofHenanProvince，Zhengzhou450002，China)

Key words:Giardiaduodenalis；assemble；genotypes；dairy cattle

Abstract:We investigated the infection ofGiardiaduodenalisin dairy cattle from an imported farm，and then we analyzed the distribution of the genotypes and assemblage ofG.duodenalis.The detection ofG.duodenalisin dairy cattle base on the locus of SSU rRNA，tpi，gdhandbgby PCR. Results indicated that the prevalence ofG.duodenalisin dairy cattle is 9.8% (48/507) based on SSU rRNA by PCR，and 48 positive samples were identified assemblage E.The prevalence ofG.duodenalisin post-weaning calves was the highest (20.70%)，the difference of the prevalence ofG.duodenalisin cattle in different ages was significant.The 48 positive samples were amplified 19，28 and 34 base ontpi，gdhandbglocus respectively，one sample was mixed infection (assemblage A and assemblage E).Multilocus sequence and phylogenetic analysis indicated thatG.duodenalisinfecting dairy cattle from an imported farm may be from the local area. The results indicate that imported adult dairy cattle is not ease to carry ZoonoticG.duodenalis，dairy cattle from an imported farm have a lower risk to transmite ZoonoticG.duodenalis.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.022

收稿日期：2015-06-20

基金項(xiàng)目：十二五國(guó)家重大科技專項(xiàng)課題(2012ZX10004220)；河南省科技創(chuàng)新杰出人才計(jì)劃(134200510012)；河南省高?？蒲袆?chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(012IRTSTHN005)

作者簡(jiǎn)介：王臣榮(1985-)，男，河南南陽(yáng)人，碩士生，主要從事人獸共患寄生蟲(chóng)學(xué)研究，E-mail：1203431811@qq.com *通信作者：張龍現(xiàn)，教授，E-mail：zhanglx8999@henau.edu.cn

中圖分類號(hào)：S855.99

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)01-0165-07