基于核磁共振技術(shù)的卵巢靜止奶牛血漿代謝譜分析

許楚楚，夏　成，孫雨航，肖鑫煥，王　剛，舒　適，張洪友，徐　闖，楊　威

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319)

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基于核磁共振技術(shù)的卵巢靜止奶牛血漿代謝譜分析

許楚楚，夏成*，孫雨航，肖鑫煥，王剛，舒適，張洪友，徐闖，楊威

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319)

摘要：為研究卵巢靜止奶牛與發(fā)情奶牛體內(nèi)差異代謝物變化，選取產(chǎn)后60～90 d的年齡、胎次、體況相近的健康經(jīng)產(chǎn)高產(chǎn)奶牛作為實(shí)驗(yàn)動物。根據(jù)奶牛發(fā)情表現(xiàn)、直腸檢查和B超檢查及激素檢測的結(jié)果，選取10頭奶牛為發(fā)情組(A)，10頭奶牛為卵巢靜止組(B)，然后對兩組奶牛血漿樣品進(jìn)行無偏性的1H譜核磁共振檢測，對比其血漿代謝組學(xué)圖譜，進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，篩選及鑒定卵巢靜止奶牛血漿差異代謝產(chǎn)物，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示：相對于正常發(fā)情奶牛，卵巢靜止奶牛血漿中共12種代謝產(chǎn)物表現(xiàn)異常，包括水平增加的乙酸、檸檬酸和酪氨酸，以及水平下降的低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白、脂質(zhì)、丙氨酸、丙酮酸、肌酸、膽堿、磷酸膽堿和甘油磷酸膽堿等；這些代謝產(chǎn)物與糖代謝、氨基酸代謝、脂蛋白代謝和膽堿代謝的異常密切相關(guān)；通過參與生物合成通路調(diào)節(jié)，干擾了奶牛正常卵泡生長。并且發(fā)現(xiàn)卵巢靜止的奶牛血漿肌酸濃度降低和酪氨酸濃度升高的新變化。多種代謝異常提示奶牛卵巢靜止與泌乳早期能量負(fù)平衡有關(guān)，并有伴發(fā)酮病和脂肪肝病的風(fēng)險(xiǎn)；另外，卵巢靜止奶牛血漿肌酸、膽堿濃度降低和酪氨酸濃度升高的變化，為今后更為深入研究奶牛卵巢靜止發(fā)生機(jī)制提供了新的方向。

關(guān)鍵詞：奶牛；卵巢靜止；核磁共振技術(shù)；血漿差異代謝物

卵巢靜止是奶牛產(chǎn)后乏情的一種常見類型，是卵巢機(jī)能不全的一種表現(xiàn)，是由于卵巢機(jī)能暫時(shí)性擾亂，機(jī)能減退，處于靜止?fàn)顟B(tài)，不出現(xiàn)周期活動。卵巢靜止在奶牛卵巢疾病中約占26.3%，在奶牛乏情中發(fā)病率最高[1]。其病因主要是長期飼料不足或質(zhì)量差，特別是蛋白質(zhì)、維生素A及維生素E的缺乏，導(dǎo)致營養(yǎng)狀況較差，機(jī)體長期處于能量負(fù)平衡狀態(tài)，抑制了促性腺激素釋放激素(GnRH)和促黃體素(LH)脈沖性分泌，造成GnRH和LH分泌不足，降低了卵巢對LH刺激的反應(yīng)性，抑制了優(yōu)勢卵泡的發(fā)育，使奶牛不出現(xiàn)周期性活動[2]。飼養(yǎng)管理不善，泌乳過度，子宮、卵巢疾病，全身的嚴(yán)重疾病等會引起卵巢靜止，因此，應(yīng)把卵巢靜止看作是各種原因引起的生殖機(jī)能障礙[3]。

近幾年，隨著代謝組學(xué)技術(shù)逐漸成熟和完善，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜和NMR等三大代謝組學(xué)平臺技術(shù)已被應(yīng)用于篩選奶牛乳熱診斷生物標(biāo)志物[4]、篩選奶牛酮病生物標(biāo)志物[5]以及比較奶牛Ⅰ型、Ⅱ型酮病致病機(jī)制[6]等。奶牛產(chǎn)后發(fā)生卵巢靜止受到多種因素的影響，并且生物體的新陳代謝活動比較復(fù)雜，且具有動態(tài)性，而上述研究和臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)往往因其單一性和片面性無法系統(tǒng)、客觀地描述奶牛卵巢靜止時(shí)體內(nèi)代謝的變化。因此，作者通過運(yùn)用代謝組學(xué)中的無偏性的1H譜核磁共振(1H nuclear magnetic resonance，1H NMR)技術(shù)對卵巢靜止的奶牛和正常發(fā)情的奶牛的差異代謝物進(jìn)行分析，旨在闡明奶牛乏情時(shí)體內(nèi)整體代謝的差異變化，為今后較為深入地研究奶牛產(chǎn)后發(fā)生卵巢靜止的發(fā)生機(jī)制和防治新策略提供理論依據(jù)和方法學(xué)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物

試驗(yàn)在黑龍江省某集約化牛場進(jìn)行，該牛場按照中國泌乳奶牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行規(guī)范管理，散欄式飼養(yǎng)，自由采食全混合日糧(TMR)。隨機(jī)選取產(chǎn)后60～90 d的年齡、胎次、體況相近的上年度年產(chǎn)10 t左右的健康經(jīng)產(chǎn)奶牛共206頭，作為備選動物。

正常發(fā)情奶牛：產(chǎn)后60～90 d自然發(fā)情，發(fā)情癥狀明顯，直腸檢查和B超檢查子宮無異常，卵巢無異常且有成熟的排卵卵泡，處于排卵期的奶牛；同時(shí)，F(xiàn)SH、LH、E2、P4等四種激素水平符合正常奶牛發(fā)情模式[7]，即E2較高，P4較低，F(xiàn)SH和LH也較高。

卵巢靜止奶牛：產(chǎn)后60～90 d不發(fā)情，無發(fā)情癥狀，直腸檢查子宮無異常，卵巢無異常且無成熟的卵泡，雙側(cè)卵泡處于靜止?fàn)顟B(tài)的奶牛；同時(shí)，F(xiàn)SH、LH、E2、P4等四種激素水平符合雙側(cè)卵巢靜止類型的奶牛乏情模式[7]，即E2、P4、FSH和LH都較低，且E2和P4明顯降低。

根據(jù)奶牛發(fā)情和卵巢靜止判定標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)排除異常樣本，本試驗(yàn)共選取10頭表現(xiàn)發(fā)情且臨床檢查無其他疾病的健康奶牛為發(fā)情組(A)。10頭卵巢靜止且臨床檢查無其他疾病的奶牛為卵巢靜止組(B)。

1.2血液樣品采集及奶牛資料收集

所有奶牛分別于上午8點(diǎn)至11點(diǎn)之間進(jìn)行尾根靜脈采集血液，每頭奶牛采集10 mL全血，置于加有3～5滴肝素鈉的抗凝管中，倒置一次充分將抗凝劑和血液混勻后靜止放置。然后迅速低速(4 000 r·min-1)離心5 min，用移液槍吸出上清液，每600 μL置于一個(gè)1.5 mL的EP管中，然后進(jìn)行高速離心，以12 000 r·min-1的速度離心5 min，再分別提取500 μL上清液置于1.5 mL的EP管中，然后-80 ℃冷凍保存，待測。

1.3試驗(yàn)?zāi)膛Ｑ獫{1H NMR試驗(yàn)

對采集樣品進(jìn)行血漿樣品制備后進(jìn)行1H NMR檢測，1H NMR圖譜數(shù)據(jù)處理，化合物指認(rèn)，多元統(tǒng)計(jì)分析包括主成分分析(principal component analysis，PCA)和偏正交最小二乘法分析 (orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)，并對相應(yīng)模型進(jìn)行驗(yàn)證。之后進(jìn)行差異代謝物代謝通路歸屬分析，采用KEGG數(shù)據(jù)庫對兩組奶牛血漿樣本進(jìn)行代謝組學(xué)差異代謝產(chǎn)物的互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析[8]。

2結(jié)果

如圖1所示，A、B分別為發(fā)情和乏情組奶牛血漿樣本中有代表性的兩個(gè)樣品的1H NMR一維譜圖，圖中所有信號峰包含在0.5～8.5 ppm內(nèi)(ppm表示化合物的化學(xué)位移)，為了便于觀察，將5.5～8.5 ppm部分圖譜擴(kuò)大32倍，其中22種匹配較好的化合物信號峰被一一指出。

對數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(PCA)，獲得了組間差異的大致模型，但是PCA的結(jié)果不能明顯地將兩組分離開，所以建立了偏正交二乘法分析(OPLS-DA)模型(圖2)，OPLS-DA模型使兩組樣本有較好的分離，并且揭示了兩組之間的差異代謝物。在OPLS-DA模型中，兩組樣本有較好的分離(R2Y=0.35，Q2Y=0.563)。通過評估OPLS-DA 得分圖的系數(shù)和載荷圖，得出了兩組之間差異較大的代謝物，兩組分離出的主要代謝物在表1中體現(xiàn)。共篩選出12種卵巢靜止組和健康組有差異的代謝物。由表1可知：卵巢靜止組(B組)奶牛相對于發(fā)情組(A組)奶牛血漿中乙酸(acetic acid)、檸檬酸(citric acid)和酪氨酸(tyrosine)等3種代謝物含量顯著增多，而脂類：低密度脂蛋白(L1：LDL)、極低密度脂蛋白(L2：VLDL)、脂質(zhì)(L6/L9：Lipid)、丙氨酸(alanine)、丙酮酸(pyruvic acid)、肌酸(creatine)、膽堿(choline)、磷酸膽堿(phosphorylcholine)和甘油磷酸膽堿(glycerophosphoryl choline)9種代謝物含量顯著減少。

如圖3所示，圖中紅色和綠色標(biāo)注的是試驗(yàn)檢測到的差異代謝產(chǎn)物，其他的代表該代謝產(chǎn)物的上下游代謝產(chǎn)物，9種代謝產(chǎn)物之間形成一個(gè)互作網(wǎng)絡(luò)，通過甘油磷脂代謝和甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路(glycine，serine and threonine metabolism pathway)、三羧酸循環(huán)通路(citrate cycle pathway)和甘油磷脂代謝通路(glycerophospholipid metabolism pathway)共同發(fā)揮作用。差異代謝產(chǎn)物通路歸屬結(jié)果如表2所示，共9種差異代謝產(chǎn)物在數(shù)據(jù)庫中得以匹配。

表1發(fā)情組和卵巢靜止組奶牛血漿12種差異代謝產(chǎn)物

Table 112 differential metabolites in plasma of dairy cows with oestrus and ovarian inactivity

a相關(guān)系數(shù)(r)：正負(fù)號分別表示代謝物濃度的正負(fù)相關(guān)性；P值等于0.05和自由度等于10共同決定差異顯著性水平，依以此為基礎(chǔ)，相關(guān)系數(shù)(r)的絕對值大于0.602作為統(tǒng)計(jì)分析代謝物的臨界值；b峰的多重性：s.單峰；d.雙峰；t.三重峰；q.四重峰；dd.雙二重峰；m.多重峰；br.廣泛的共鳴?！啊贝砩仙厔??！啊贝硐陆第厔?/p>

aCorrelation coefficients，positive and negative signs indicate positive and negative correlation in the concentrations，respectively；The correlation coefficient of│r│> 0.602 was used as the cutoff value for the statistical significance based on the discrimination significance at the level ofP=0.05 anddf(degree of free-dom) = 10 (A vs.B)；bMultiplicity：s.Singlet；d.Doublet；t.Triplet；q.Quartet；dd.Doublet of doublets；m.Multiplet；br.Broad resonance

表2九種差異代謝產(chǎn)物代謝通路歸屬

Table 2Metabolic pathways of 9 differential metabolites

NA表示此代謝物在HMDB數(shù)據(jù)庫中未匹配到，HMDB和KEGG兩列中的數(shù)字分別代表代謝物在其數(shù)據(jù)庫中的身份編號

NA means the metabolite is not matched to HMDB database，and the number in two columns of HMDB and KEGG is respectivey the number (ID) of metabolites in its database

3討論

本試驗(yàn)應(yīng)用1H NMR技術(shù)篩選卵巢靜止奶牛血漿差異代謝產(chǎn)物，結(jié)果顯示相對于正常發(fā)情奶牛，卵巢靜止奶牛血漿中共12種代謝產(chǎn)物含量表現(xiàn)異常。這些代謝產(chǎn)物濃度的異常可被歸納為糖代謝異常、氨基酸代謝異常、脂蛋白代謝異常和膽堿代謝異常四類，結(jié)合通路分析，對其逐一進(jìn)行討論。

3.1糖代謝異常

糖代謝異常包括乙酸、丙酮酸和檸檬酸的代謝異常。丙酮酸本身是一種較弱的有機(jī)酸，是動物機(jī)體代謝的重要樞紐，承擔(dān)著糖、脂肪和蛋白質(zhì)三大物質(zhì)之間相互轉(zhuǎn)換的任務(wù)[9]。乙酸多主要是機(jī)體脂肪分解代謝增強(qiáng)，進(jìn)入肝細(xì)胞后代謝成乙酰CoA，消耗肝細(xì)胞內(nèi)ATP[10]，乙酸和丙酮酸生成的乙酰CoA進(jìn)入三羧酸循環(huán)后生成檸檬酸，氧化供能[11]。在三羧酸循環(huán)通路中，糖酵解的終產(chǎn)物——丙酮酸，脫羧生成乙酰CoA而后進(jìn)入此通路，產(chǎn)生檸檬酸；乙酸與乙酰CoA相互轉(zhuǎn)化，從而進(jìn)入到三羧酸循環(huán)通路中，產(chǎn)生檸檬酸。另外，丙酮酸的另一個(gè)去路是轉(zhuǎn)換成氨基酸，如絲氨酸和丙氨酸等，從而進(jìn)入到甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸代謝通路[12]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示丙氨酸含量顯著減少，說明丙酮酸主要偏向于另一個(gè)去路——氧化供能，以滿足機(jī)體對能量的需要，這提示發(fā)生卵巢靜止的奶牛需要更多的能量。提示卵巢靜止奶牛很可能經(jīng)歷或正處于能量負(fù)平衡狀態(tài)，這與很多文獻(xiàn)報(bào)道能量負(fù)平衡導(dǎo)致奶牛發(fā)生卵巢靜止的觀點(diǎn)相一致[13-15]。

3.2氨基酸代謝異常

氨基酸代謝異常包括丙氨酸代謝異常、肌酐(肌氨酸)代謝異常和酪氨酸代謝異常。丙氨酸是一種非必需氨基酸，通過丙酮酸的轉(zhuǎn)氨基作用轉(zhuǎn)化而成[12]。丙酮酸含量降低，轉(zhuǎn)化得到的丙氨酸含量也會降低，即丙酮酸增加對檸檬酸的生成，而降低了轉(zhuǎn)化的丙氨酸含量。丙氨酸作為一種生糖氨基酸，在卵巢靜止奶牛血漿濃度表現(xiàn)出降低趨勢，將導(dǎo)致機(jī)體糖異生作用減弱，會加劇奶牛能量負(fù)平衡[16]。肌酐又叫做肌酸，60%～70%肌酸常以磷酸肌酸形式存在于肌肉中，使肌原纖維產(chǎn)生足夠的能量形成肌肉收縮力[17]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示肌酸含量降低，提示卵巢靜止奶牛體內(nèi)肌酸含量下降可能與能量消耗多以供能有關(guān)。酪氨酸是一種必需氨基酸，奶牛體內(nèi)不能合成，必須從體外攝取。根據(jù)本試驗(yàn)中酪氨酸含量增加可知，奶牛體內(nèi)酪氨酸的代謝發(fā)生異常，可能利用和轉(zhuǎn)化受阻，導(dǎo)致其在奶牛體內(nèi)蓄積。而酪氨酸作為一種生酮氨基酸，其在血漿內(nèi)升高說明生酮過程正?；蚴茏?。酪氨酸利用或代謝受阻的問題值得關(guān)注。因?yàn)檫@不僅浪費(fèi)了日糧酪氨酸，而且提示酪氨酸未發(fā)揮應(yīng)有的作用。

3.3脂蛋白代謝異常

脂蛋白代謝異常包括低密度脂蛋白(LDL)代謝異常、極低密度脂蛋白(VLDL)代謝異常和脂質(zhì)代謝異常。以往的研究指出：在奶牛發(fā)生酮病時(shí)，由于得不到足夠的葡萄糖，機(jī)體將加速動員脂肪和體蛋白來維持能量需要，造成血漿中的LDL和VLDL均降低[18-19]；另外，VLDL是奶牛肝的重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，具有轉(zhuǎn)移甘油三酯的作用，血漿中VLDL的降低說明肝合成VLDL的能力降低。本試驗(yàn)中卵巢靜止奶牛血漿中多種脂蛋白的同時(shí)降低，意味著奶牛可能發(fā)生酮病，并且繼發(fā)脂肪肝病[20]。這與前面提到的卵巢靜止奶?？赡芑加型?，并且更顯肥胖的討論結(jié)果相一致，再次證明卵巢靜止奶牛的能量負(fù)平衡狀態(tài)。

3.4膽堿代謝異常

膽堿代謝異常包括膽堿、磷酸膽堿和甘油磷酸膽堿的代謝異常。膽堿是一種B族維生素，是合成乙酰膽堿的前體，具有降低血清膽固醇，促進(jìn)肝脂肪代謝(抗脂肪肝)的作用[21]。膽堿缺乏影響脂肪運(yùn)輸，加速脂肪在肝內(nèi)蓄積，誘發(fā)脂肪肝[22]；在甘油磷脂代謝通路中，磷酸膽堿和甘油磷酸膽堿都可以轉(zhuǎn)化為膽堿；膽堿作為奶牛重要的能源物質(zhì)，可以通過增高葡萄糖濃度進(jìn)而提供能量[23]；肌酸作為直接能源物質(zhì)可以直接為機(jī)體供能；網(wǎng)絡(luò)結(jié)果圖顯示：肌酸和膽堿共同作用于肌氨酸，但是兩者的降低并未影響到肌氨酸，一方面說明肌氨酸不是卵巢靜止奶牛血液的主要差異代謝物；另一方面說明肌酸和膽堿的代謝異?？赡軆H為合成代謝異常，并非分解代謝異常，因?yàn)榉纸獯x的產(chǎn)物并未表現(xiàn)異常。這提示，卵巢靜止奶牛采食的肌酸和膽堿含量可能不足，或者其體內(nèi)的肌酸和膽堿合成障礙；但是膽堿和肌酸合成障礙應(yīng)該只能是個(gè)體差異，因?yàn)槟憠A和肌酸采食量減少這樣的情況不可能同時(shí)發(fā)生在較多奶牛身上，所以得到了“卵巢靜止奶牛體內(nèi)同時(shí)調(diào)節(jié)膽堿和肌酸合成代謝的某種物質(zhì)或者某種通路發(fā)生了變化”的猜想。這一設(shè)想在上文中得到驗(yàn)證：膽堿是奶牛體內(nèi)所有類固醇激素的合成原料，也就是說，膽堿合成障礙將直接導(dǎo)致奶牛體內(nèi)雌激素(主要是E2)下降，使奶牛無法正常發(fā)情。因此，膽堿將是研究奶牛卵巢靜止發(fā)生機(jī)制的重要節(jié)點(diǎn)，這需要在今后進(jìn)一步對調(diào)節(jié)膽堿和肌酸代謝的代謝網(wǎng)絡(luò)前段進(jìn)行查找，以期能夠找到發(fā)生變化的最終切點(diǎn)，為研究奶牛卵巢靜止發(fā)生的機(jī)制提供新方向。

4結(jié)論

應(yīng)用1H NMR技術(shù)成功地篩選出卵巢靜止奶牛血漿差異代謝產(chǎn)物；相對于正常發(fā)情奶牛，卵巢靜止奶牛血漿共12種代謝物表現(xiàn)異常。這些代謝產(chǎn)物濃度的差異體現(xiàn)了卵巢靜止奶牛體內(nèi)多種代謝異常，多種代謝異常提示奶牛卵巢靜止與泌乳早期能量負(fù)平衡有關(guān)，并有伴發(fā)酮病和脂肪肝病的風(fēng)險(xiǎn)；另外，卵巢靜止奶牛血漿肌酸、膽堿濃度降低和酪氨酸濃度升高的變化，為今后更為深入研究奶牛卵巢靜止發(fā)生機(jī)制提供了新的方向。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1]富宏騫.中藥治療奶牛卵巢靜止的研究[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

FU H Q.Studies on Chinese Herbal medicine to treat ovarian quiescence in dairy cows[D].Harbin：Northeast Agricultural University，2008.(in Chinese)

[2]武海玉，趙冬琴，王梁，等.奶牛卵巢機(jī)能障礙研究進(jìn)展[J].黑龍江動物繁殖，2014，22(3)：3-7.

WU H Y，ZHAO D Q，WANG L，et al.Research progress of ovarian dysfunction of dairy cows[J].HeilongjiangJournalofAnimalReproduction，2014，22(3)：3-7.(in Chinese)

[3]侯樂樂，代永聯(lián)，郝小靜，等.奶牛卵巢靜止及其中西療法的療效比較[J].北方牧業(yè)，2014(11)：27.

HOU L L，DAI Y L，HAO X J，et al.Comparison of Chinese and Western therapy of ovarian inactivity of dairy cows[J].NorthernPastoral， 2014(11)：27.(in Chinese)

[4]SUN Y，XU C，LI C，et al.Characterization of the serum metabolic profile of dairy cows with milk fever using 1H-NMR spectroscopy[J].VetQ，2014，34(3)：159-163.

[5]LI Y，XU C，XIA C，et al.Plasma metabolic profiling of dairy cows affected with clinical ketosis using LC/MS technology[J].VetQ， 2014，34(3)：153-158.

[6]SUN L W，ZHANG H Y，WU L，et al.1H-Nuclear magnetic resonance-based plasma metabolic profiling of dairy cows with clinical and subclinical ketosis[J].JDairySci，2014，97(3)：1552-1562.

[7]趙興緒.獸醫(yī)產(chǎn)科學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2008.

ZHAO X X.Veterinary obstetrics[M].Beijing：China Agriculture Press，2008.(in Chinese)

[8]孫雨航，許楚楚，李昌盛，等.基于1H NMR技術(shù)的乳熱奶牛血清代謝組學(xué)分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，48(2)：362-369.

SUN Y H，XU C C，LI C S，et al.1H NMR-based Serum Metabolomics analysis of dairy cows with milk fever[J].ScientiaAgriculturaSinica，2015，48(2)：362-369.(in Chinese)

[9]干懿潔，丁樹哲.丙酮酸的抗氧化作用[J].中國臨床康復(fù)，2006，10(8)：141-143.

GAN Y J，DING S Z.Anti-oxidation of pyruvate[J].ChineseJournalofClinicalRehabilitation，2006，10(8)：141-143.(in Chinese)

[10]李心慰.乙酸、非酯化脂肪酸、生長激素和催乳素調(diào)控奶牛肝細(xì)胞脂代謝的信號機(jī)制[D].長春：吉林大學(xué)，2013.

LI X W.The signaling mechanism of acetic acid，non-esterified fatty acids，growth hormone and prolactin on the regulation of lipid metabolism in the hepatocytes of dairy cows[D].Changchun：Jilin University，2013.(in Chinese)

[11]NOTTON B A，BLANKE M M.Phosphoenolpyruvate carboxylase in avocado fruit：purification and properties[J].Phytochemistry，1993，33(6)：1333-1337.

[12]汪玉松，鄒思湘，張玉靜.現(xiàn)代動物生物化學(xué)[M].北京：高等教育出版社，2005.

WANG Y S，ZOU S X，ZHANG Y J.Modern animal biochemistry[M].Beijing：Higher Education Press，2005.(in Chinese)

[13]ALLENSTEIN L C.Reproductive problems in the management of dairy cattle[J].CanVetJ，1981，22(6)：184-188.

[14]PETER A T，VOS P L，AMBROSE D J.Postpartum anestrus in dairy cattle[J].Theriogenology，2009，71(9)：1333-1342.

[15]SAKAGUCHI M.Practical aspects of the fertility of dairy cattle[J].JReprodDev，2011，57(1)：17-33.

[16]孫玲偉.基于1H NMR和GC/MS技術(shù)的奶牛酮病血漿代謝組學(xué)分析[D].大慶：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，2014.

SUN L W.1H NMR and GC/MS based plasma metabolic profiling of dairy cows with ketosis[D].Daqing：Heilongjiang Bayi Agricultural University，2014.(in Chinese)

[17]FELDMAN E B.Creatine：A dietary supplement and ergogenic aid[J].NutrRev，1999，57(2)：45-50.

[18]XU C，WANG Z，LIU G，et al.Metabolic characteristic of the liver of dairy cows during ketosis based on comparative proteomics[J].AsianAustJAnim，2008，21(7)：1003-1010.

[19]DRACKLEY J K，RICHARD M J，BEITZ D C，et al.Metabolic changes in dairy cows with ketonemia in response to feed restriction and dietary 1，3-butanediol[J].JDairySci，1992，75(6)：1622-1634.

[20]LOOR J J，EVERTS R E，BIONAZ M，et al.Nutrition-induced ketosis alters metabolic and signaling gene networks in liver of periparturient dairy cows[J].PhysiolGenomics，2007，32(1)：105-116.

[21]GAO H，DONG B，LIU X，et al.Metabonomic profiling of renal cell carcinoma：high-resolution proton nuclear magnetic resonance spectroscopy of human serum with multivariate data analysis[J].AnalChimActa，2008，624(2)：269-277.

[22]郭定宗.獸醫(yī)內(nèi)科學(xué)[M].北京：高等教育出版社，2010.

GUO D Z.Veterinary internal medicine[M].Beijing：Higher Education Press，2010.(in Chinese)

[23]XU G，YE J，LIU J，et al.Effect of rumen-protected choline addition on milk performance and blood metabolic parameters in transition dairy cows[J].AsianAuatralJAnim，2006，19(3)：390.

(編輯白永平)

1H-NMR-based Plasma Metabolic Profiling of Postpartum Dairy Cows with Ovarian Inactivity

XU Chu-chu，XIA Cheng*，SUN Yu-hang，XIAO Xin-huan，WANG Gang，SHU Shi，ZHANG Hong-you，XU Chuang，YANG Wei

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，HeilongjiangBayiAgriculturalUniversity，Daqing163319，China)

Key words:dairy cows；ovarian inactivity；nuclear magnetic resonance technology；plasma differential metabolites

Abstract:To understand the differences in metabolic changes between cows with ovarian inactivity and estrus cows，we selected cows at 60-90 d postpartum，which had similar age，parity，body condition score and milk yield.According to clinical manifestations，B-ultrasound scan，rectal examination and hormone tests，10 cows were assigned to the estrus group (A) and 10 to the ovarian inactivity group (B).All plasma samples were analyzed by1H NMR spectroscopy to compare plasma metabolomic profiles between the groups.We used multivariate pattern recognition，to screen for different metabolites in plasma of anestrus cows.Compared with normal estrous cows，there were abnormalities in 12 kinds of metabolites in postpartum cows with ovarian inactivity，including an increase in acetic acid，citric acid and tyrosine，and a decrease in low-density lipoprotein，very low density lipoprotein，lipids，alanine，pyruvate，creatine，choline，phosphorylcholine and glycerophosphorylcholine.These metabolites were closely related to abnormality of glucose，amino acid，lipoprotein and choline metabolism，which may disturb the normal estrus.The decrease in plasma creatine and the increase in tyrosine were new changes for ovarian inactivity of postpartum cows.In conclusion，a variety of metabolic disorders indicate that ovarian inactivity is related to negative energy balance in early lactation，and has the risk of ketosis and fatty liver.The decrease of creatine and choline concentration and increase of p-hydroxyphenylalanine concentration in cows with ovarian inactivity provide a new direction for research on the mechanism of ovarian inactivity in cows.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.026

收稿日期：2015-06-10

基金項(xiàng)目：國家自然基金面上項(xiàng)目(31372488)；國家科技支撐計(jì)劃課題(2013BAD21B01-2；2012BAD12B05；2013BAD21B00)；黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目(YJSCX2015-Y22)

作者簡介：許楚楚(1990-)，女，黑龍江鶴崗人，碩士，主要從事動物營養(yǎng)代謝病的研究，E-mail：cc15845951639@163.com *通信作者：夏成，E-mail：xcwlxyf2014@163.com

中圖分類號：S857.22

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)01-0190-08