奶牛產(chǎn)后血漿1H-NMR代謝組學(xué)分析

陶金忠，郭延生

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，銀川 750021)

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奶牛產(chǎn)后血漿1H-NMR代謝組學(xué)分析

陶金忠*，郭延生

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，銀川 750021)

摘要：為了從代謝組角度系統(tǒng)揭示奶牛分娩后能量缺乏的生理機(jī)制，采用1H-NMR 代謝組學(xué)技術(shù)，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法探討了奶牛分娩后不同階段血漿小分子代謝物的變化趨勢(shì)及其對(duì)能量代謝通路的影響。結(jié)果表明：奶牛分娩后第7天與分娩第1天之間血漿代謝輪廓無明顯差異；分娩后第14天與第1天之間血漿代謝輪廓出現(xiàn)明顯差異，其差異標(biāo)志物為不飽和脂肪酸、膽堿和氧化三甲胺；分娩后第28天與第1天之間血漿代謝輪廓也存在明顯差異，其差異標(biāo)志物為不飽和脂肪酸、膽堿、氧化三甲胺、三羧酸和葡萄糖；隨著分娩后時(shí)間的延長(zhǎng)，不飽和脂肪酸、膽堿和三羧酸表達(dá)逐漸上調(diào)，而氧化三甲胺和葡萄糖表達(dá)逐漸下調(diào)?？梢姡S著奶牛分娩后泌乳量的不斷增加，逐漸呈現(xiàn)出能量負(fù)平衡狀態(tài)，而機(jī)體應(yīng)答性的上調(diào)了脂肪分解、脂肪酸氧化、膽堿氧化、蛋氨酸再甲基化和甲基代謝途徑以緩解奶牛分娩后的能量負(fù)平衡狀態(tài)。研究結(jié)果可為進(jìn)一步闡明奶牛分娩后能量負(fù)平衡的生理機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：奶牛；圍產(chǎn)期；能量負(fù)平衡；代謝組學(xué)；1H核磁共振

圍產(chǎn)期是奶牛整個(gè)泌乳周期中最至關(guān)重要的一個(gè)時(shí)期，在這個(gè)階段，奶牛經(jīng)歷了巨大的代謝變化，主要表現(xiàn)在干物質(zhì)攝入減少而能量需求增加所致的能量負(fù)平衡(NEB)[1]。大多數(shù)研究表明，圍產(chǎn)期奶牛能量代謝特點(diǎn)是干物質(zhì)攝入減少及能量負(fù)平衡，在正常生理情況下，母牛分娩后的4～6周出現(xiàn)泌乳高峰，但其食欲恢復(fù)和采食量的高峰約在產(chǎn)犢后8～10周。因此，在產(chǎn)犢后10周內(nèi)奶牛攝入的能量不能滿足泌乳消耗的需要，如果奶牛泌乳量過高，將勢(shì)必加劇這種不平衡，繼而引發(fā)酮病、脂肪肝等圍產(chǎn)期能量代謝障礙性疾病[2]，給奶牛業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，對(duì)于奶牛產(chǎn)后NEB的發(fā)生規(guī)律的研究，已經(jīng)從最初的生理和生化水平，發(fā)展到現(xiàn)在的分子水平，但其精確的發(fā)生機(jī)制仍未完全清楚。

代謝組學(xué)技術(shù)已經(jīng)逐漸成為探索代謝物質(zhì)新陳代謝過程的重要技術(shù)平臺(tái)，該技術(shù)可全面地展示機(jī)體內(nèi)所有代謝物在生理或病理狀態(tài)下的代謝變化，以及研究細(xì)胞代謝過程中最接近末端的代謝物，因此應(yīng)用代謝組學(xué)的理論和技術(shù)將有助于全面揭示奶牛產(chǎn)后NEB的發(fā)生機(jī)制、細(xì)胞代謝過程、系統(tǒng)功能聯(lián)系網(wǎng)絡(luò)，對(duì)進(jìn)一步豐富和發(fā)展奶牛產(chǎn)后NEB理論具有非常重要的科學(xué)意義。近年來已建立的代謝組學(xué)技術(shù)平臺(tái)有高分辨核磁共振(NMR)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)等[3]。NMR 技術(shù)是最早用于代謝組學(xué)的分析方法，具有分辨率高、不破壞樣品結(jié)構(gòu)和性質(zhì)且能對(duì)樣品實(shí)現(xiàn)非選擇性分析等優(yōu)點(diǎn)[4]。本試驗(yàn)采用1H-NMR代謝組學(xué)技術(shù)分析奶牛分娩后血漿代謝物的變化，尋找奶牛分娩后不同階段的差異代謝物，以期從代謝組角度闡明奶牛分娩后能量缺乏的機(jī)制，為進(jìn)一步緩解能量負(fù)平衡和預(yù)防奶牛酮病與脂肪肝等圍產(chǎn)期能量代謝障礙性疾病的發(fā)生提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1儀器和試劑

德國(guó)Bruker AVIII 600 MHz NMR 譜儀(配備超低溫探頭)，美國(guó)BECKMAN 公司OPTIME L-80 低溫高速離心機(jī)，DW-86L628海爾超低溫冰箱。100 mL 45 mmol·L-1Na+/K+緩沖液(K2HPO4·3H2O 0.830 g，NaH2PO4·2H2O 0.139 g，D2O：100 mL，NaCl 0.9 g)。

1.2動(dòng)物和樣品采集

試驗(yàn)?zāi)膛碜詫幭哪骋?guī)模化養(yǎng)殖廠，選擇9頭2～3胎的荷斯坦分娩奶牛，分別在產(chǎn)后第1、7、14和28天尾靜脈采血，3 000 r·min-1，4 ℃離心10 min制備血漿，于-80 ℃冰箱保存。血漿樣品和核磁編號(hào)見表1。

表1產(chǎn)后奶牛血漿樣品和核磁編號(hào)

Table 1Codes of plasma samples and1H-NMR form postpartum cows

1.3血漿樣品的1H-NMR分析

所有血漿樣品的一維1H-NMR譜的采集在配備有超低溫探頭的Bruker AVIII 600 MHz NMR 譜儀(Bruker Biospin，德國(guó))上完成，質(zhì)子共振頻率為600.13 MHz，實(shí)驗(yàn)溫度為298 K。每個(gè)血樣精確吸取180 μL樣品和360 μL Na+/K+緩沖液(45 mmol·L-1)，4 ℃條件下離心10 min(12 000 r·min-1)，抽取上清液500 μL至5 mm核磁管[5]，混勻后進(jìn)行核磁檢測(cè)，記錄所有檢測(cè)樣品的1H-NMR譜。

1.41H-NMR數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)預(yù)處理

使用Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)序列[RD-90°-(τ-180°-τ)n-ACQ]采集小分子信息。參數(shù)設(shè)置如下：譜寬(SW)為20 ppm，等待時(shí)間(RD)為2 s，90°脈寬為11.5 μs，采樣點(diǎn)數(shù)為32 K，自由感應(yīng)衰減(FID)累計(jì)信號(hào)采集次數(shù)為128次?；夭ㄑ莼瘯r(shí)間(d20)為350 μs，回波循環(huán)(L4)為100，總回波時(shí)間(2nτ)為70 ms[6]。

1H-NMR 譜和基線校正均使用 TopSpin 軟件人工處理，用葡萄糖(δ 5.23)的信號(hào)進(jìn)行化學(xué)位移定標(biāo)，然后對(duì)核磁譜圖(δ 8.5 ～ 0.6)進(jìn)行積分(積分區(qū)間大小為0.004 ppm)和化學(xué)位移校正。為了消除因樣品的濃度差異造成的分析誤差，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化。目前常用的歸一化方法有總面積歸一化[7]、概率熵歸一化[8]、重量歸一化[9]、向量歸一化和不歸一化[7]等。不同歸一化方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，適用的對(duì)象和條件不盡相同。其中概率熵歸一化(PQN)是在總面積歸一化的基礎(chǔ)上，通過計(jì)算譜圖中熵幅度的分布來尋找樣品的最佳熵值(即最佳稀釋因子)來還原樣品的真實(shí)濃度。當(dāng)樣品中出現(xiàn)變化劇烈的信號(hào)時(shí)，概率熵歸一化的方法比較適用，有利于分析其他容易被忽略的代謝物的變化規(guī)律。對(duì)于本項(xiàng)目的血漿樣品，葡萄糖的濃度可能發(fā)生急劇變化，因此概率熵歸一化(PQN)是合適的選擇。

1.51H-NMR譜數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

將歸一化處理后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P+軟件包(V.11.0，Umetrics，Sweden)進(jìn)行主成分分析(PCA)，偏最小二乘判別分析(PLS-DA)和正交化偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)[10]。采用 PCA 的方法來評(píng)價(jià)組間樣本的總體分布狀況，觀察自然凝集狀態(tài)和確定是否存在奇異樣本；用 PLS-DA 和 OPLS-DA 鑒別區(qū)分各組間代謝物貢獻(xiàn)值，找到最相關(guān)的差異代謝物。對(duì)PLS-DA和OPLS-DA 模型使用7 層交叉驗(yàn)證(7-fold cross validation)，其中PLS-DA 使用了排列實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證(重復(fù)次數(shù)n= 200)，OPLS-DA使用交叉驗(yàn)證殘差的方差分析(CV-ANOVA)進(jìn)行驗(yàn)證。

OPLS-DA結(jié)果用得分圖和相關(guān)系數(shù)負(fù)載圖來表示，相關(guān)系數(shù)負(fù)載圖是將每一個(gè)變量的loading值與其標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行數(shù)據(jù)的回溯轉(zhuǎn)換，最后導(dǎo)入基于MATLAB的多變量分析負(fù)載作圖軟件系統(tǒng)中作圖。該圖用顏色對(duì)代謝物相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值進(jìn)行編碼，紅色表示該代謝物對(duì)組間的區(qū)分具有顯著貢獻(xiàn)，而藍(lán)色表示該代謝物對(duì)組間的區(qū)分無顯著性的貢獻(xiàn)。此外，通過皮爾森相關(guān)系數(shù)顯著性差異檢測(cè)(Pearson’s Product-moment correlation coefficient)，并綜合考慮組內(nèi)樣本數(shù)N，確定評(píng)估代謝物含量是否具有顯著性變化的閾值(P≤0.05)。由于樣本數(shù)N=9，相關(guān)系數(shù)的閾值為0.632，因此本試驗(yàn)選擇相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值|r| ≥ 0.632的代謝物作為顯著性差異代謝物。

1.6產(chǎn)后奶牛差異代謝物的代謝通路及變化趨勢(shì)

將鑒定后的生物標(biāo)志物輸入KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.kegg.com)，選擇Bos taurus (cow通路)為通路路徑庫(kù)，進(jìn)行代謝通路的查詢，并將各差異代謝物的峰面積平均值作為相對(duì)含量，繪制奶牛產(chǎn)后各差異代謝物與產(chǎn)后天數(shù)曲線圖，分析各差異代謝物的變化趨勢(shì)。

2結(jié)果

2.1產(chǎn)后奶牛血液代謝物的1H-NMR建立與指認(rèn)

通過對(duì)原始譜圖的分析，發(fā)現(xiàn)第2組24號(hào)樣品(核磁編號(hào)1 024)的水峰抑制效果(圖1中桔黃色譜圖)與其他樣品差別較大，其原因可能是由于自動(dòng)進(jìn)樣時(shí)勻場(chǎng)差異導(dǎo)致水峰壓制效果較差，因此作為異常點(diǎn)在后續(xù)分析中去除，建立奶牛血樣的代表性的1H 核磁譜圖(圖2)。根據(jù)每個(gè)代謝物的化學(xué)位移，裂峰情況及偶合常數(shù)，結(jié)合文獻(xiàn)[11-12]數(shù)據(jù)，并參照Chenomx NMR Suite(加拿大Chenomx Inc.公司)數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)所得的圖譜(圖2)進(jìn)行指認(rèn)。

2.2代謝物的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

為了從代謝層面判斷奶牛產(chǎn)后機(jī)能的恢復(fù)情況，本試驗(yàn)以產(chǎn)后第1天作為對(duì)照組，分別與產(chǎn)后第7天、第14天和第28天的核磁數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P+軟件包進(jìn)行PCA、PLS-DA和OPLS-DA分析，并采用排列試驗(yàn)(permutation test)和CV-ANOVA(variance analysis of the cross-validated residuals)[12]，分別對(duì)PLS-DA 和OPLS-DA模型的有效性進(jìn)行檢驗(yàn)，各組PCA、PLS-DA和OPLS-DA得分圖見圖3。

奶牛產(chǎn)后第1天與產(chǎn)后第7天PLS-DA模型R2X=0.352，Q2=0.222，Q2<0.4，表明模型預(yù)測(cè)能力較差，并且未通過排列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，PLS-DA模型無效； OPLS-DA模型中R2X=0.352，Q2=0.452，雖然Q2>0.4，且CV-ANOVA檢驗(yàn)中P=0.100(P<0.05模型才有效)，因此OPLS-DA模型也無效，后續(xù)分析中止，這表明奶牛產(chǎn)后1天與7天血液代謝物之間無顯著差異。

奶牛產(chǎn)后第1天與產(chǎn)后第14天PLS-DA模型R2X=0.251，Q2=0.431，Q2>0.4，表明具有較好的預(yù)測(cè)能力，但未通過排列實(shí)驗(yàn)，OPLS-DA模型R2X=0.251，Q2=0.663，Q2>0.4，且CV-ANOVA驗(yàn)證模型有效(P=0.05)，表明奶牛產(chǎn)后第1天與第14天之間血液代謝物存在明顯差異。

奶牛產(chǎn)后第1天與產(chǎn)后第28天PLS-DA模型R2X=0.579，Q2=0.844，Q2>0.4，但未通過排列實(shí)驗(yàn)，OPLS-DA模型R2X=0.358，Q2=0.681，Q2>0.4，CV-ANOVA驗(yàn)證模型有效(P=0.03)，表明奶牛產(chǎn)后第1天與第28天之間血液代謝物存在明顯差異。

2.3顯著性差異代謝物的歸屬

相關(guān)系數(shù)負(fù)載圖和顯著性差異代謝物歸屬分別見圖4、表2和表3，結(jié)果顯示，奶牛分娩后第1天與第14天顯著性差異代謝物為4種不飽和脂肪酸、膽

表2奶牛產(chǎn)后第1天與第14天顯著性差異代謝物歸屬表

Table 21H-NMR signal assignments of significant differential metabolites between 1stday and 14thday after delivery

峰的多重性：s.單峰； m.多重峰，b.廣泛共鳴峰；“↓”表示分娩后第14天相對(duì)于分娩后第1天含量下降；“↑”表示分娩后第14天相對(duì)于分娩后第1天含量增加

Multiplicity：s.Singlet；m.Multiplet；b.Broad peak；TMAO.Trimethylamine-N-oxide；Compared to 1stday after delivery，“↓” denote down regulated expression，and“↑”denote up-regulated expression at 14thday after delivery

表3奶牛產(chǎn)后第1天與第28天顯著性差異代謝物歸屬表

Table 31H-NMR signal assignments of significant differential metabolites between 1stday and 28thday after delivery

峰的多重性：s.單峰； d.雙峰；dd.二聯(lián)的雙重峰；m.多重峰，b.廣泛共鳴峰；“↓”表示分娩后28天相對(duì)于分娩后第1天含量下降；“↑”表示分娩后28天相對(duì)于分娩后第1天含量增加

Multiplicity：s.Singlet；d.Doublet；dd.Doublet of doublets；m.Multiplet；b.Broad peak；TMAO.Trimethylamine-N-oxide；Compared to 1stday after delivery，“↓” denote down regulated expression，and“↑”denote up-regulated expression at 28thday after delivery

堿和氧化三甲胺，其中4種不飽和脂肪酸和膽堿表達(dá)上調(diào)，氧化三甲胺表達(dá)下調(diào)；與分娩后第28天差異代謝物為4種不飽和脂肪酸、膽堿、氧化三甲胺、三羧酸和葡萄糖，其中4種不飽和脂肪酸、膽堿和三羧酸表達(dá)上調(diào)，氧化三甲胺和葡萄糖表達(dá)下調(diào)。

2.4產(chǎn)后奶牛差異代謝物變化趨勢(shì)

從表4和圖5可以看出，奶牛產(chǎn)后4種不飽和脂肪酸(UFAs1、UFAs2、UFAs3和UFAs4)、三羧酸、膽堿、氧化三甲胺和葡萄糖含量隨產(chǎn)后時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生了不同程度變化，其中4種不飽和脂肪酸(UFAs1、UFAs2、UFAs3和UFAs4)、三羧酸和膽堿呈逐漸升高趨勢(shì)，而氧化三甲胺和葡萄糖呈逐漸降低趨勢(shì)。從相關(guān)系數(shù)負(fù)載圖可知，4種不飽和脂肪酸、氧化三甲胺和葡萄糖在產(chǎn)后第14天已經(jīng)出現(xiàn)了顯著性變化，至第28天，三羧酸和葡萄糖含量也相繼出現(xiàn)顯著性變化。

表4奶牛產(chǎn)后第1、7、14和28天差異代謝物相對(duì)含量

Table 4Relative content of differential metabolites at 1st，7th，14thand 28thday after delivery

3討論

血糖含量變化是機(jī)體對(duì)糖的吸收、運(yùn)轉(zhuǎn)和代謝的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)的反映，循環(huán)血液中葡萄糖的濃度體現(xiàn)奶牛的能量代謝水平。奶牛產(chǎn)后葡萄糖主要用于合成乳糖，隨著產(chǎn)后泌乳量的持續(xù)增高，機(jī)體對(duì)葡萄糖的需要量也不斷增加，奶牛在這個(gè)階段容易發(fā)生能量負(fù)平衡[13]。奶牛分娩后4～6 周出現(xiàn)泌乳高峰，但其食欲恢復(fù)和采食量的高峰在8～10 周，食欲恢復(fù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于能量的需要，如果此階段泌乳量過高，將勢(shì)必加劇這種能量負(fù)平衡，血糖急劇下降。本試驗(yàn)結(jié)果也顯示奶牛產(chǎn)后血糖呈下降趨勢(shì)，產(chǎn)后第28天血糖含量顯著低于產(chǎn)后第1天，這表明奶牛在產(chǎn)后4周左右出現(xiàn)泌乳高峰，從而加劇了能量的負(fù)平衡狀態(tài)。

血液中血糖濃度急劇下降，為了滿足泌乳頭幾周的能量需要，奶牛從脂肪組織中動(dòng)員大量的脂肪酸，結(jié)果導(dǎo)致循環(huán)中游離脂肪酸濃度(NEFA)急劇升高，被動(dòng)員的體脂通過血液進(jìn)入其他組織，20%被乳腺利用，其余大部分被肝吸收[14]，本試驗(yàn)結(jié)果也顯示奶牛產(chǎn)后第28天內(nèi)不飽和游離脂肪酸濃度持續(xù)升高，且產(chǎn)后第14天后顯著升高，這說明奶牛產(chǎn)后隨著泌乳量的逐漸升高而體脂大量動(dòng)員。

NEFA 進(jìn)入肝后首先在脂酰輔酶A合成酶作用下活化為脂酰脂酰輔酶A，進(jìn)一步代謝包括3種途徑：一是 NEFA 被徹底氧化成二氧化碳，所產(chǎn)生的能量被肝利用；二是部分氧化生成酮體，被肝外組織利用；三是再酯化形成甘油三酯、磷酯或膽固醇酯，用于極低密度脂蛋白的組裝，轉(zhuǎn)運(yùn)到肝外組織利用或在肝中蓄積。反芻動(dòng)物肝脂肪酸氧化或以VLDL的形式輸出甘油三酯的能力是有限的[15]，因此，如果肝攝入過多的脂肪酸，超過了肝輸出或氧化脂肪酸的能力，那么脂肪酸就會(huì)以甘油三酯的形式在肝中蓄積形成脂肪肝，而且脂肪酸的不完全氧化產(chǎn)物形成酮體，可能導(dǎo)致酮病發(fā)生[16]。而本試驗(yàn)中奶牛產(chǎn)后血液中三羧酸含量逐漸升高，而酮體和甘油三脂未見明顯變化，這表明奶牛產(chǎn)后在28 d內(nèi)體脂動(dòng)員生成的NEFA除一小部分合成乳脂外，大部分NEFA經(jīng)過β-氧化途徑被徹底氧化，釋放出大量能量以緩解產(chǎn)后能量的負(fù)平衡。

膽堿是動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的水溶性維生素，其在動(dòng)物脂肪沉積的調(diào)控中起非常重要的作用。膽堿在膽堿脫氫酶和甜菜醛脫氫酶作用下氧化生成甜菜堿，高半胱氨酸在甜菜堿高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶作用下，可由甜菜堿提供活性甲基轉(zhuǎn)變?yōu)榈鞍彼?，繼而在甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶作用下轉(zhuǎn)變?yōu)镾-腺苷甲硫氨酸，S-腺苷甲硫氨酸是體內(nèi)重要的活性甲基供體，其參與了機(jī)體內(nèi)眾多的甲基代謝過程，在脂肪酸分解代謝過程中，肉堿是長(zhǎng)鏈脂肪酸進(jìn)入細(xì)胞線粒體內(nèi)進(jìn)行脂肪酸氧化的重要跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)載體，在脂肪酸氧化中起關(guān)鍵作用。1 分子肉堿的合成需要 3 分子 S-腺苷甲硫氨酸提供活性甲基供體。由此可見膽堿可通過膽堿氧化途徑生成甜菜堿，繼而通過蛋氨酸再甲基化途徑間接參與S-腺苷甲硫氨酸的合成，進(jìn)而通過以S-腺苷甲硫氨酸為活性甲基供體的甲基代謝促進(jìn)肉堿合成，增強(qiáng)組織中脂肪酸的氧化，提高組織對(duì)脂肪酸的降解[17-19]。增加飼料膽堿水平可明顯增強(qiáng)動(dòng)物體內(nèi)脂肪酸的氧化分解[20]。據(jù)此可以推測(cè)，奶牛產(chǎn)后血液中膽堿含量持續(xù)升高提示脂肪酸氧化分解持續(xù)增強(qiáng)。

已有研究表明，膽堿在腸道內(nèi)細(xì)菌的作用下，代謝生成三甲胺(TMA)[21]，后者在黃素單加氧酶(flavine monooxygenase)的作用下在肝被氧化生成氧化三甲胺(TMAO)，因此膽堿水平升高并伴隨氧化三甲胺水平降低提示腸道菌群失調(diào)[22]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，奶牛在產(chǎn)后血液中膽堿持續(xù)升高，TMAO含量持續(xù)下降，且在14 d后出現(xiàn)明顯改變，可能與瘤胃微生物菌群失調(diào)有關(guān)，而瘤胃微生物對(duì)葡萄糖的異生具有重要的生物學(xué)意義，產(chǎn)后瘤胃微生物菌群的失調(diào)可進(jìn)一步加劇能量的負(fù)平衡。

綜上所述，奶牛分娩后28 d，隨著乳量的不斷增加，血糖含量降低趨勢(shì)，呈現(xiàn)出能量負(fù)平衡狀態(tài)，與此同時(shí)血液中不飽和脂肪酸、三羧酸、膽堿的含量逐漸升高，TMAO逐漸降低，說明機(jī)體應(yīng)答性的上調(diào)了脂肪分解、脂肪酸氧化、膽堿氧化、蛋氨酸再甲基化和甲基代謝途徑以緩解奶牛分娩后的能量負(fù)平衡狀態(tài)。

4結(jié)論

采用1H-NMR代謝組學(xué)技術(shù)分析奶牛分娩后不同階段血漿小分子代謝物的變化趨勢(shì)及其對(duì)能量代謝通路的影響，篩選出8種差異標(biāo)志物，代謝通路分析顯示奶牛分娩后逐漸呈現(xiàn)出能量負(fù)平衡狀態(tài)，機(jī)體通過上調(diào)脂肪分解、脂肪酸氧化、膽堿氧化、蛋氨酸再甲基化和甲基代謝途徑來進(jìn)行調(diào)節(jié)。研究結(jié)果有望為奶牛的產(chǎn)后保健和預(yù)防奶牛酮病與脂肪肝等圍產(chǎn)期能量代謝障礙性疾病的發(fā)生提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1]FATIMA A，WATERS S，O’BOYLE P，et al.Alterations in hepatic miRNA expression during negative energy balance in postpartum dairy cattle[J].BMCGenomics，2014，15：28.

[2]McCARTHY S D，WATERS S M，KENNY D A，et al.Negative energy balance and hepatic gene expression patterns in high-yielding dairy cows during the early postpartum period：a global approach[J].PhysiolGenomics，2010，42(3)：188-199.

[3]WU H，XUE R Y，DONG L，et al.Metabolomic profiling of human urine in hepatocellular carcinoma patients using gas chromatography/mass spectrometry[J].AnalChimActa，2009，648(1)：98-104.

[4]張艷花，王東琴，李曉偉，等.基于1H-NMR代謝組學(xué)技術(shù)尋找CCl4致大鼠急性肝損傷的代謝標(biāo)志物[J].藥物評(píng)價(jià)研究，2014，37(1)：11-16.

ZHANG Y H，WANG D Q，LI X W，et al.Searching for biomarkers of CCl4-induced acute liver injury in rats based on1H-NMR metabonomic approach[J].DrugEvaluationResearch，2014，37(1)：11-16.(in Chinese)

[5]HUANG C Y，LEI H H，ZHAO X J，et al.Metabolic influence of acute cyadox exposure on Kunming mice[J].JProteomeRes，2013，12(1)：537-545.

[6]ZHAO X J，HAO F H，HUANG C Y，et al.Systems responses of rats to mequindox revealed by metabolic and transcriptomic profiling[J].JProteomeRes，2012，11(9)：4712-4721.

[7]DAI H，XIAO C N，LIU H B，et al.Combined NMR and LC-MS analysis reveals the metabonomic changes in salvia miltiorrhiza bunge induced by water depletion[J].JProteomeRes，2010，9(3)：1460-1475.

[8]ZHANG J，ZHANG Y，DU Y，et al.Dynamic metabonomic responses of tobacco (nicotiana tabacum) plants to salt stress[J].JProteomeRes， 2011，10 (4)：1904-1914.

[9]CHEN F，ZHANG J，SONG X，et al.Combined metabonomic and quantitative real-time PCR analyses reveal systems metabolic changes of Fusarium graminearum induced by Tri5 gene deletion[J].JProteomeRes，2011，10(5)：2273-2285.

[10]BYLESJO M，RANTALAINEN M，CLOAREC O，et al.OPLS discriminant analysis：combining the strengths of PLS-DA and SIMCA classification[J].JChemometr，2006，20(8-10)：341-351.

[11]TRYGG J，HOLMES E，LUNDSTEDT T.Chemometrics in metabonomics[J].JProteomeRes， 2007，6 (2)：469-479.

[12]FONVILLE J M，RICHARDS S E，BARTON R H，et al.The evolution of partial least squares models and related chemometric approaches in metabonomics and metabolic phenotyping[J].JChemometr，2010，24 (11-12)：636-649.

[13]MULLIGAN F J，DOHERTY M L.Production disease of the transition cow[J].VetJ，2008，176(1)：3-9.[14]EMERY R S，LIESMAN J S，HERDT T H.Metabolism of long chain fatty acids by ruminant liver[J].JNutr，1992，122(3 Suppl)：832-837.

[15]GERLOFF B J，HERDT T H，EMERY R S.Relationship of hepatic lipidosis to health and performance in dairy cattle[J].JAmVetMedAssoc，1986，188(8)：845-850.

[16]GRUMMER R R.Etiology of lipid-related metabolic disorders in periparturient dairy cows[J].JDairySci，1993，76(12)：3882-3896.

[17]CARTER A L，F(xiàn)RENKEL R.The relationship of choline and carnitine in the choline deficient rat[J].JNutr，1978，108(11)：1748-1754.

[18]DAILY III J W，HONGU N，MYNATT R L，et al.Choline supplementation increases tissue concentrations of carnitine and lowers body fat in guinea pigs[J].JNutrBiochem，1998，9(8)：464-470.

[19]SHEARD N F，KRASIN B.Restricting food intake does not exacerbate the effects of a choline-deficient diet on tissue carnitine concentrations in rats[J].JNutr，1994，124(5)：738-747.

[20]馬維英，王爽，沈軍達(dá)，等.飼糧膽堿水平對(duì)紹興鴨脂質(zhì)代謝的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，45(2)：233-242.

MA W Y，WANG S，SHEN J D，et al.Effect of choline level in diet on lipid metabolism in Shaoxing ducks during the initial egg-laying period[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2014，45(2)：233-242.(in Chinese)

[21]AL-WAIZ M，MIKOV M，MITCHELL S C，et al.The exogenous origin of trimethylamine in the mouse[J].Metabolism，1992，41(2)：135-136.

[22]WANG Z，KLIPFELL E，BENNETT B J，et al.Gut flora metabolism of phosphatidylcholine promotes cardiovascular disease[J].Nature，2011，472(7341)：57-63.

(編輯白永平)

Study on the Plasma Metabolism Using1H-NMR in Postpartum Cows

TAO Jin-zhong*，GUO Yan-sheng

(CollegeofAgriculture，NingxiaUniversity，Yinchuan750021，China)

Key words:cow；periparturition；negative energy balance；metabolomics；1H nuclear magnetic resonance

Abstract:In postpartum，cows often suffer from negative energy balance，resulting in physical dysfunction.The aim of this study was to define the physiological mechanism of cows exercising metabolic energy shortage after calving.1H-NMR technology was used for measurement of metabolites.Results were analyzed in multivariate statistical methods to find out the trend of plasma metabolites changing after calving and the influence on energy metabolism pathway.Results showed that：the biomarkers profile of plasma was not significantly different in Day 7 from Day 1 after calving；but a significant difference were found between Day 14 and Day 1 after calving.The biomarkers are unsaturated fatty acid，choline and trimethylamine oxide；There were significant differences in biomarkers profile between Day 28 and Day 1 after calving with different markers of unsaturated fatty acid，choline，trimethylamine oxide，citric acid and glucose.After calving，unsaturated fatty acid，choline and tricarboxylic acid expression gradually increased，whereas trimethylamine oxide and glucose expression gradually decreased.With the increasing lactating yield after calving，cows showed a negative energy balance.In response，the lipolysis and fatty acid oxidation，the oxidation of choline，re-methylation methionine and methyl metabolic pathways were increased，relieving the negative energy balance.This study could provide a scientific basis for the physiological mechanism of the negative energy balance after calving for dairy cows.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.027

收稿日期：2015-06-20

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(31160523)

作者簡(jiǎn)介：陶金忠(1977-)，男，甘肅天水人，博士后，副教授，主要從事家畜繁殖及繁殖障礙的研究，E-mail：tao_jz@nxu.edu.cn

*通信作者：陶金忠

中圖分類號(hào)：S857.21

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)01-0198-09