細(xì)胞傳代致弱的鵝細(xì)小病毒YG毒株致病性變化的研究

邵周伍林，李晨曦，劉　明，張青山，張　云

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150001)

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細(xì)胞傳代致弱的鵝細(xì)小病毒YG毒株致病性變化的研究

邵周伍林，李晨曦，劉明，張青山，張?jiān)?

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150001)

摘要：旨在觀察細(xì)胞傳代致弱的鵝細(xì)小病毒YG毒株對(duì)易感雛鵝的致病性變化。將鵝細(xì)小病毒(GPV)YG株在鵝胚成纖維細(xì)胞(GEF)和鴨胚成纖維細(xì)胞(DEF)上進(jìn)行交替?zhèn)鞔囵B(yǎng)，病毒在細(xì)胞上傳至第12代時(shí)，開始出現(xiàn)細(xì)胞病變；間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著病毒感染時(shí)間的延長(zhǎng)，感染細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)先增加隨后減少的變化趨勢(shì)，感染后96 h陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量最多；病毒的滴度隨著傳代次數(shù)的增加而逐漸升高；當(dāng)病毒傳至第50代時(shí)，細(xì)胞適應(yīng)毒株毒價(jià)為106.5TCID50·mL-1；雛鵝致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示，第50代病毒毒力明顯減弱。細(xì)胞傳代致弱的GPV YG株所感染雛鵝死亡和發(fā)病率降低，且死亡雛鵝無(wú)鵝細(xì)小病毒病的特征性病變及臨床表現(xiàn)。

關(guān)鍵詞：鵝細(xì)小病毒；病毒致弱；細(xì)胞適應(yīng)；致病性

鵝細(xì)小病毒(goose parvovirus，GPV)屬于細(xì)小病毒科(Parvoviridate)，細(xì)小病毒屬(ParvovirusGenus)成員。鵝細(xì)小病毒為單股線性DNA病毒，病毒粒子直徑20～22 nm，無(wú)囊膜，呈二十面體對(duì)稱[1]。鵝細(xì)小病毒病也稱“小鵝瘟”，是一種主要感染1月齡以內(nèi)雛鵝和雛番鴨的高發(fā)病率、高死亡率的高度接觸性傳染病[2]?；疾‰r鵝剖檢可見小腸呈卡他性或纖維素性壞死性炎癥變化，小腸中下端腸黏膜呈壞死性脫落，并與纖維素性滲出物形成栓塞[3]。該病自1961年在我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)，在全國(guó)廣泛蔓延和流行，對(duì)我國(guó)水禽養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。

鵝細(xì)小病毒宿主特異性強(qiáng)，僅能在鵝(鴨)胚或鵝(鴨)胚成纖維細(xì)胞上增殖[4]。由于鵝細(xì)小病毒病在我國(guó)廣泛流行，鵝(鴨)胚內(nèi)可能存在的母源抗體會(huì)阻礙病毒的復(fù)制和生長(zhǎng)。此外，鵝(鴨)胚供應(yīng)的持續(xù)性會(huì)受產(chǎn)蛋周期等因素的影響，使得鵝細(xì)小病毒的持續(xù)性培養(yǎng)受到限制，因此疫苗的生產(chǎn)也會(huì)受到影響。研究表明，鵝(鴨)胚成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)可連續(xù)傳代致40代而不受影響[5]。因此，鵝細(xì)小病毒的持續(xù)性培養(yǎng)可通過鵝(鴨)胚成纖維細(xì)胞大量?jī)龃婊蜻B續(xù)傳代獲得。

本研究將鵝細(xì)小病毒YG株在鵝胚和鴨胚成纖維細(xì)胞上進(jìn)行交替?zhèn)鞔囵B(yǎng)，通過觀察細(xì)胞有無(wú)出現(xiàn)特征性細(xì)胞病變(CPE)，檢測(cè)病毒在細(xì)胞中的最佳培養(yǎng)時(shí)間，病毒TCID50的測(cè)定，從而發(fā)現(xiàn)不同代次細(xì)胞適應(yīng)毒株在鵝胚和鴨胚成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)特性；動(dòng)物致病性試驗(yàn)表明，第50代細(xì)胞毒毒力明顯減弱，且病毒效價(jià)高，該細(xì)胞適應(yīng)毒株的培育為鵝細(xì)小病毒細(xì)胞適應(yīng)弱毒苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

鵝細(xì)小病毒YG株由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存；鵝(鴨)胚成纖維細(xì)胞(GEF/DEF)按照常規(guī)方法制備[4-6]；抗鵝細(xì)小病毒VP3蛋白單克隆抗體為本實(shí)驗(yàn)室制備[6]；無(wú)母源抗體的1日齡雛鵝及11日齡鵝胚均購(gòu)自哈爾濱新立養(yǎng)殖場(chǎng)；11日齡SPF鴨胚購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2試劑和主要儀器

胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；DMEM購(gòu)自Hyclone公司；FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體購(gòu)自中杉金橋生物技術(shù)有限公司；EVOS F1熒光倒置顯微鏡為美國(guó)AMG公司產(chǎn)品。

1.3鵝細(xì)小病毒在細(xì)胞上的傳代培養(yǎng)

原代GEF 制備好后傳至次代，將鵝細(xì)小病毒YG株鴨胚尿囊液按1∶100的比例加入到細(xì)胞懸液中，培養(yǎng)至第7天時(shí)，置于-20 ℃，反復(fù)凍融3次，收集細(xì)胞培養(yǎng)液。將收集的細(xì)胞培養(yǎng)液按1∶150的比例加入到次代GEF細(xì)胞懸液中，培養(yǎng)至第4天時(shí)，按上述方法收集細(xì)胞培養(yǎng)液。在GEF上連續(xù)傳代培養(yǎng)12代后，將收獲的細(xì)胞適應(yīng)毒在DEF上傳代5次，之后回傳至GEF，如此在GEF與DEF上交替?zhèn)鞔囵B(yǎng)直至細(xì)胞適應(yīng)毒株第50代。

1.4間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測(cè)感染病毒的細(xì)胞數(shù)量

將鵝細(xì)小病毒按“1.3”所述方法感染GEF和DEF，感染5 d后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞用4%多聚甲醛室溫固定30 min后，PBS洗3次。加入含有1% Triton X-100的PBS，置于4 ℃ 10 min后，用PBS洗3次后，加入含4% BSA的PBS置于37 ℃ 30 min。PBS洗1次后，加入1∶5 000倍稀釋的抗鵝細(xì)小病毒VP3蛋白單克隆抗體，37 ℃ 孵育2 h。PBS洗3次后，加入1∶50倍稀釋的FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體，37 ℃ 孵育1 h后，PBS洗3次[6-7]。同時(shí)設(shè)立未感染GPV的GEF、DEF作為陰性對(duì)照，并在熒光顯微鏡下觀察有無(wú)特異性綠色熒光。

環(huán)保節(jié)能方面，五建依托自身優(yōu)勢(shì)，在2011年開始試水土壤污染治理工程項(xiàng)目。至今已完成了北京廣華新城、北京焦化廠等兩個(gè)大型土壤修復(fù)項(xiàng)目，合同額近10億。今年，五建正在執(zhí)行天津石化土壤修復(fù)項(xiàng)目，合同額近2億元。近期五建還應(yīng)業(yè)主要求，快速應(yīng)對(duì)、妥善處置了數(shù)起惡性突發(fā)土壤污染事件。與此同時(shí)，五建與清華大學(xué)、華南理工、華東理工等高校和中科院南京土壤所、中石化大連院、中石化上海院、SEG技術(shù)研發(fā)中心等眾多科研機(jī)構(gòu)合作，聯(lián)合開發(fā)技術(shù)，探索“人才不為所有但為所用”的高端人才使用方式，不斷提升能力，已成為國(guó)內(nèi)領(lǐng)先的“技術(shù)集成、市場(chǎng)開發(fā)、項(xiàng)目執(zhí)行”土壤修復(fù)企業(yè)。環(huán)保節(jié)能業(yè)務(wù)也即將成為五建新的利潤(rùn)增長(zhǎng)點(diǎn)。

1.5不同代次細(xì)胞毒TCID50的測(cè)定

將不同代次的細(xì)胞適應(yīng)毒用DMEM作10倍倍比稀釋后，接種于單層GEF，每個(gè)稀釋度做4個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)至第5天時(shí)觀察CPE，并按照Reed-Muench法[8]計(jì)算其TCID50。

1.6IFA檢測(cè)不同時(shí)間內(nèi)GEF感染病毒的情況

將鵝細(xì)小病毒細(xì)胞適應(yīng)毒按“1.3”所述方法感染GEF，并且在感染后24、48、72、96、120和144 h，按“1.4”的方法，利用IFA檢測(cè)不同時(shí)間細(xì)胞感染病毒的情況，并設(shè)立未感染鵝細(xì)小病毒的GEF作為陰性對(duì)照。

1.7鵝細(xì)小病毒細(xì)胞適應(yīng)毒對(duì)易感雛鵝的致病性變化

45只1日齡雛鵝適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d后，隨機(jī)分為3組，腿部肌肉分別注射鵝細(xì)小病毒YG株親代毒株0.1 mL·只-1記為F0組，另一組注射第50代細(xì)胞適應(yīng)毒株0.1 mL·只-1(約105.7TCID50)記為F50組，剩余1組注射PBS設(shè)為對(duì)照。隔離飼養(yǎng)3周，記錄各組的體重變化、發(fā)病及死亡情況。無(wú)菌采集死亡雛鵝的肝、脾、腸道及其內(nèi)容物，將病料剪碎后，使用玻璃勻漿器研磨制成組織勻漿。病毒基因組DNA采用SDS和蛋白酶K的方法提取[9]，并利用本實(shí)驗(yàn)室建立起來(lái)的GPV PCR檢測(cè)方法[10]對(duì)死亡雛鵝進(jìn)行確診。

2結(jié)果

2.1鵝細(xì)小病毒在細(xì)胞上的適應(yīng)性生長(zhǎng)

將鵝細(xì)小病毒YG株在GEF上連續(xù)傳代培養(yǎng)，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞病變。

培養(yǎng)F1至F11代，感染細(xì)胞均未見明顯的細(xì)胞病變；當(dāng)細(xì)胞適應(yīng)毒株傳至第F12代時(shí)，感染細(xì)胞發(fā)生皺縮、變圓，其間隙增寬，細(xì)胞膜邊緣不整齊，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)顆粒樣變化及出現(xiàn)空泡，病變細(xì)胞聚集成團(tuán)，但并未融合；病變嚴(yán)重的細(xì)胞甚至從培養(yǎng)瓶壁上脫落(圖1)。將感染鵝細(xì)小病毒的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定后，采用IFA進(jìn)行檢測(cè)，熒光顯微鏡下可見兩種細(xì)胞細(xì)胞核處出現(xiàn)特異性綠色熒光，部分細(xì)胞核內(nèi)存在有顆粒樣熒光。Reed-Muench法計(jì)算獲得的不同代次細(xì)胞毒的TCID50隨著傳代次數(shù)的增加，病毒滴度逐漸升高(圖2)。結(jié)果表明，鵝細(xì)小病毒YG株能夠在GEF、DEF上適應(yīng)性生長(zhǎng)。

2.2GEF培養(yǎng)病毒的最佳時(shí)間段

選取2個(gè)代次(F40和F50)的YG細(xì)胞毒接種于單層GEF，在感染后24、48、72、96、120和144 h，采用IFA法，檢測(cè)不同時(shí)間段內(nèi)病毒感染細(xì)胞的情況。

免疫熒光結(jié)果顯示，F(xiàn)40和F50代次毒細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72和96 h時(shí)，熒光數(shù)量(即陽(yáng)性細(xì)胞數(shù))隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而逐漸增多；病毒培養(yǎng)超過96 h后，熒光數(shù)量隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而逐漸減少。確定感染后96 h的熒光最多(圖3)，建議在病毒的傳代培養(yǎng)過程中，接毒后96 h，收獲病毒。

2.3鵝細(xì)小病毒 F50對(duì)雛鵝的致病性

2.3.1臨床表現(xiàn)、發(fā)病率、死亡率及體重變化F0組雛鵝在感染后第3天開始出現(xiàn)死亡，臨床表現(xiàn)為病雛突然倒地，雙腿麻痹或抽搐，兩肢亂劃，死亡前并無(wú)明顯臨診癥狀，發(fā)現(xiàn)癥狀后極度衰弱，不久后死亡。F0組未死亡雛鵝隨后均出現(xiàn)精神不振，雖多有飲水但食欲減退，排灰白及淡黃綠色稀糞，肛周不潔，鼻孔有分泌物流出，喙端色澤變暗，羽毛松亂等癥狀。F0組感染雛鵝均有發(fā)病，發(fā)病率為100%，死亡率為73.3%。F50組分別在感染后第6天和第9天各死亡一只雛鵝，死亡雛鵝在采食、飲水、精神狀態(tài)及排便等方面均無(wú)異常，該組發(fā)病率為0，死亡率為13.3%。對(duì)照組雛鵝未出現(xiàn)臨診癥狀和死亡(圖4)。

試驗(yàn)雛鵝感染后每周稱量體重，隨著飼養(yǎng)時(shí)間的增加，F(xiàn)0和F50組雛鵝陸續(xù)出現(xiàn)死亡，稱量各組存活雛鵝的體重。結(jié)果顯示F0組雛鵝與F50組及對(duì)照組相比，生長(zhǎng)受到抑制，體重增加緩慢(圖5)；F50組與對(duì)照組相比，體重?zé)o明顯差異。

上述結(jié)果表明，GPV經(jīng)過在DEF與GEF上交替?zhèn)鞔囵B(yǎng)，第50代細(xì)胞適應(yīng)毒F50與其親代毒F0相比，毒力明顯減弱，主要表現(xiàn)為F50所感染雛鵝無(wú)明顯臨診癥狀，并且發(fā)病率和死亡率大幅降低。此外，F(xiàn)0所感染雛鵝生長(zhǎng)受到抑制，而F50所感染雛鵝體重變化與對(duì)照組并無(wú)差異，生長(zhǎng)良好。

2.3.2剖檢變化經(jīng)剖檢后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)0組中約有85%的病死雛鵝存在GPV感染的特征性病變。死亡雛鵝的肝淤血、腫大，且質(zhì)脆；腎腫大出血，呈暗紅色；病死雛鵝的小腸中下段特別是靠近卵黃柄和回盲部極度腫大，質(zhì)地堅(jiān)實(shí)，體積是正常腸段的2倍以上，空腸和回腸出現(xiàn)急性卡他性—纖維素性壞死性腸炎，將腫大腸段剪開后，可見整片腸黏膜壞死脫落，與凝固的纖維素性滲出物形成淡灰色栓塞，堵塞腸腔。F50組死亡雛鵝經(jīng)過剖檢后發(fā)現(xiàn)，肝和小腸并無(wú)上述病理變化，腎輕微腫大但未見出血(圖6)。病理變化的結(jié)果進(jìn)一步說明GPV細(xì)胞適應(yīng)毒F50與其親代毒F0相比，毒力明顯減弱，F(xiàn)50所感染雛鵝，剖檢后并未出現(xiàn)GPV感染的特征性病變。

2.3.3死亡雛鵝實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果 利用本實(shí)驗(yàn)室建立的GPV PCR檢測(cè)方法對(duì)病毒DNA模板進(jìn)行檢測(cè)，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，出現(xiàn)

GPV特有的長(zhǎng)度約700 bp的特異性條帶，與預(yù)期目標(biāo)條帶大小一致(圖7)，結(jié)果表明F0和F50組雛鵝的死亡是由GPV感染所引起。

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)病毒在細(xì)胞培育連續(xù)培養(yǎng)過程中，病毒傳至第12代后出現(xiàn)細(xì)胞病變；細(xì)胞病變多發(fā)生在接毒后的72～96 h。隨著在細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞病變愈發(fā)明顯，且毒價(jià)也在持續(xù)升高；當(dāng)病毒傳至第50代時(shí)，毒價(jià)可達(dá)106.5TCID50·mL-1。利用IFA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間后病毒的感染情況，結(jié)果顯示，病毒的生長(zhǎng)隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增加隨后又減少的變化趨勢(shì)；在接毒后96 h，感染病毒的細(xì)胞數(shù)量最多。在接毒96 h后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，細(xì)胞特異性熒光數(shù)量逐漸減少，原因是由于感染后期大量細(xì)胞死亡脫落所引起的。致病性試驗(yàn)結(jié)果表明，病毒經(jīng)過體外的連續(xù)傳代培養(yǎng)，第50代細(xì)胞適應(yīng)毒與其親本毒相比，毒力明顯減弱，主要表現(xiàn)為其所感染的雛鵝發(fā)病率和死亡率降低，并且死亡雛鵝無(wú)鵝細(xì)小病毒病的特征性病變及臨床表現(xiàn)。

本研究結(jié)果顯示鵝細(xì)小病毒在GEF和DEF上交替?zhèn)鞔囵B(yǎng)與其毒力的減弱有著重要關(guān)系。隨著病毒在細(xì)胞上的連續(xù)傳代培養(yǎng)，宿主細(xì)胞與病毒的不斷相互作用，使得病毒的毒力相關(guān)基因受到修飾而發(fā)生改變，使其毒力減弱甚至失去對(duì)宿主動(dòng)物的致病能力，這一結(jié)論與以往的研究結(jié)果相一致[5，12-13]。本研究獲得的毒力明顯減弱的鵝細(xì)小病毒細(xì)胞適應(yīng)毒株為今后弱毒苗的研制奠定了基礎(chǔ)，國(guó)際上對(duì)于鵝細(xì)小病毒的致弱機(jī)制國(guó)內(nèi)外未有報(bào)道，這為我們今后的研究提供了新的方向。

4結(jié)論

鵝細(xì)小病毒YG株在鵝胚成纖維細(xì)胞和鴨胚成纖維細(xì)胞上交替?zhèn)鞔囵B(yǎng)，至第50代時(shí)毒力減弱，感染雛鵝后死亡率和發(fā)病率降低，且死亡雛鵝無(wú)鵝細(xì)小病毒病的特征性病變及臨床表現(xiàn)。

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(編輯白永平)

Pathogenicity Changes of Cell Attenuated Goose Parvovirus YG Strain

SHAOZHOU Wu-lin，LI Chen-xi，LIU Ming，ZHANG Qing-shan，ZHANG Yun*

(StateKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology，HarbinVeterinaryResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Harbin150001，China)

Key words:goose parvovirus；virus attenuation；cell adaptation；pathogenicity change

Abstract:This experiment was conducted to study pathogenicity changes in susceptible goslings of cell attenuated goose parvovirus YG strain.To obtain attenuated vaccine strain，goose parvovirus(GPV) YG strain was propagated alternately in goose embryo fibroblasts(GEF) and duck embryo fibroblasts(DEF).Cells infected with YG strain began to induce cytopathogenic effect after 12 passages.Results of indirect immunofluorescence assay(IFA) showed that the numbers of infected cells with green fluorescence increased with the time of infection，and the highest number of positive cells were obtained at 96 h post-infection.Virus titers increased with serial passages going and virus titer reached 106.5TCID50·mL-1after passage 50.Compared to parental virus，the mortality and morbidity of goslings decreased obviously after challenged with virus passage 50.There were no observed characterized pathogenic changes or clinical symptoms of Derzsy’s disease in goslings after challenged with passage 50 YG virus.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.018

收稿日期：2015-03-30

基金項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)水禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系崗位科學(xué)家專項(xiàng)(CARS-43-10)；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31072132)

作者簡(jiǎn)介：邵周伍林(1990-)，男，云南昆明人，碩士生，主要從事水禽病毒病的研究 *通信作者：張?jiān)?，副研究員，碩士生導(dǎo)師，E-mail：yunzhang01@126.com

中圖分類號(hào)：S852.659.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)01-0135-06