AGT 基因單核苷酸多態(tài)性與妊娠高血壓易感性的相關(guān)性研究

王葭，黃嫦娥（河源市婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣東517000）

AGT 基因單核苷酸多態(tài)性與妊娠高血壓易感性的相關(guān)性研究

王葭，黃嫦娥
（河源市婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣東517000）

目的觀察血管緊張素原（AGT）基因單核苷酸多態(tài)性（SNPs）與妊娠高血壓易感性的關(guān)系。方法選取2012年1月至2015年1月河源市婦幼保健院收治并確診的妊娠高血壓患者512例為研究組，對(duì)照組為同期在該院的健康體檢者502例。應(yīng)用基因組測序技術(shù)，檢測AGT基因2個(gè)SNP位點(diǎn)（rs5050和rs36218431）基因型。選取rs5050和rs36218431不同基因型妊娠高血壓患者外周血血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA法）測定不同基因型患者細(xì)胞上清液中AGT濃度。對(duì)比分析兩組調(diào)查對(duì)象SNP等位基因頻率和AGT濃度。結(jié)果兩組2個(gè)AGT基因SNP位點(diǎn)的基因型分布遵守遺傳平衡定律。其中rs5050位點(diǎn)存在GG、GA和AA基因型，研究組僅有rs2006765等位基因G頻率（91.0%，919/1 010）顯著高于對(duì)照組（83.0%，833/1 004），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。rs5050位點(diǎn)GG基因型外周血AGT濃度為（49±3）ng/L，顯著高于AA/GA基因型的（31.0±2.5）ng/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論AGT基因rs5050多態(tài)性與妊娠高血壓易感性有顯著相關(guān)性，其等位基因G是妊娠高血壓的易感基因。而兩組rs36218431比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。rs5050多態(tài)性影響宿主外周血的AGT表達(dá)水平，在妊娠高血壓過程中起重要作用。

多態(tài)性，單核苷酸；高血壓，妊娠性；腎素-血管緊張素系統(tǒng)

高血壓是一種典型的具有多基因復(fù)雜性狀疾病，其發(fā)生可能與多個(gè)基因參與有關(guān)，而遺傳因素在該疾病的發(fā)生過程中扮演著重要角色［1-2］。妊娠期高血壓疾病是高血壓中一類特殊類型，是孕婦妊娠期所特有的疾病，按臨床特點(diǎn)可分為妊娠期高血壓、子癇前期、子癇、慢性高血壓并發(fā)子癇前期及慢性高血壓［3-4］。其主要臨床特征是在孕婦孕周20周后出現(xiàn)高血壓、蛋白尿、水腫或抽搐。臨床癥狀輕者可無癥狀或輕度頭暈，血壓輕度升高，可伴水腫或輕度蛋白尿；重者孕婦可表現(xiàn)惡心、嘔吐、頭痛、眼花、持續(xù)性右上腹痛等，血壓明顯升高，蛋白尿增多，水腫明顯，甚至出現(xiàn)昏迷和抽搐［4-5］。本病可嚴(yán)重影響母嬰健康，是孕產(chǎn)婦和圍生兒發(fā)病和死亡的重要原因之一。據(jù)相關(guān)報(bào)道顯示，我國孕婦妊娠期高血壓的發(fā)病率為9.4%，而國外報(bào)道為7%～12%。然而其具體病因有多種說法［6-7］。血管緊張素原（AGT）是血管緊張素的前體物質(zhì)，經(jīng)腎素作用后產(chǎn)生血管緊張素Ⅰ（AngⅠ）即無活性十肽激素前體，前者在血管緊張素轉(zhuǎn)換酶作用下分解成AngⅡ，后者在機(jī)體的腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）中發(fā)揮著重要作用。其主要作用主要是調(diào)

節(jié)機(jī)體內(nèi)的血壓水平［8-9］。有研究表明，在俄羅斯及日本人種中AGT基因多態(tài)性與高血壓有相關(guān)性［9-11］，但該基因與妊娠高血壓易感性的關(guān)系尚不十分清楚，有關(guān)AGT基因多態(tài)性與妊娠高血壓易感性的研究鮮有報(bào)道。本研究將對(duì)AGT基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）進(jìn)行了研究，探討AGT基因多態(tài)性與我國漢族人群妊娠高血壓發(fā)病的關(guān)系，分析SNP基因型多態(tài)性對(duì)外周血中AGT表達(dá)的影響。

1　資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料選取2012年1月至2015年1月河源市婦幼保健院收治并確診的妊娠高血壓患者502例為研究組，均為單胎妊娠；年齡19～37歲，平均（26±1.2）歲；所有病例均符合妊娠高血壓的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合病史、臨床表現(xiàn)、影像學(xué)、實(shí)驗(yàn)室檢查和病理檢查等確診，且抗高血壓治療結(jié)果支持臨床診斷［12］。對(duì)照組為同時(shí)期在該醫(yī)院的健康體檢者502例，其中有生育史472例，無生育史的30例；年齡21～40歲，平均（27.0±1.0）歲。入組標(biāo)準(zhǔn)：無高血壓臨床表現(xiàn)、無高血壓病史、無高血壓遺傳史。兩組研究對(duì)象均為漢族，均來自河源地區(qū)，無合并其他傳染病、慢性病和自身免疫性疾病史。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.1.2試劑和儀器外周血DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）熱啟動(dòng)Taq酶購自德泰生物科技（南京）有限公司，AGT酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購自上海瑞齊生物科技有限公司，瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)購自韓國BIONEER，多功能酶標(biāo)儀購自寶特科技，96孔梯度PCR儀購自寧波新藝超聲設(shè)備有限公司。

1.2方法

1.2.1收集標(biāo)本用肝素鋰抗凝管收集參與者的外周靜脈血5mL，及時(shí)分離血細(xì)胞及血漿，血漿凍存于-80℃冰箱，全血用于提取基因組DNA從而進(jìn)行基因SNP分析。1.2.2提取DNA用外周血DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，提取操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，提取出DNA經(jīng)驗(yàn)證后置于-80℃冰箱保存為下一步實(shí)驗(yàn)備用。提取DNA質(zhì)量控制方案：取DNA樣本1μL，使用超微量分光光度計(jì)（美國Agilent公司）測定DNA純度及濃度，若A260nm/A280nm為1.80～1.85，則認(rèn)定所提取的DNA純度合格，否則重新提取DNA。

1.2.3SNP選擇從NCBI數(shù)據(jù)庫中選取AGT基因的SNPs標(biāo)簽，選取原則：（1）文獻(xiàn)報(bào)道中所選基因明確的與疾病有關(guān)；（2）上述基因序列經(jīng)生物信息學(xué)分析后有確定的與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)的SNP；（3）SNP位于啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、5′非編碼區(qū)域等。共挑選2個(gè)AGT基因SNP，分別為rs5050和rs36218431。

1.2.4引物設(shè)計(jì)采用Primer5軟件包進(jìn)行引物設(shè)計(jì)擴(kuò)增或延伸引物。每個(gè)選取的SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)1對(duì)PCR擴(kuò)增引物（均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成），引物序列如下rs5050（正向序列）GCAGCAGGGTCAGAAGTG，（反向序列）TGCCAGAAGCGACACTCAC和rs36218431（正向序列）TGGTCTGGCCAAGTGATG，（反向序列）AGAGACAAGACCGAGAAG。

1.2.5SNP測定及分型將DNA樣本稀釋為500μg/L，使用PCR熱啟動(dòng)Taq酶，在96孔板常規(guī)擴(kuò)增，PCR反應(yīng)所設(shè)置的條件：95℃、10min，95℃、10 s，58℃、30 s，72℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)，最終72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行確認(rèn)后收集產(chǎn)物提供給測序公司進(jìn)行測序處理。將測序公司所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.6AGT濃度檢測選取30例妊娠高血壓患者rs2006765不同基因型外周血，分離出血清并在96孔板上每孔接種50μL血清，在體外使用雙抗體夾心方法，應(yīng)用ELISA試劑盒測定AGT濃度，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對(duì)SNPs位點(diǎn)基因型進(jìn)行Hardy-Weiberg平衡檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1AGT基因SNP位點(diǎn)基因型分布（1）rs5050：研究組505例患者中GG基因型433例，GA基因型53例，AA基因型19例；對(duì)照組502例參與者中GG基因型387例，GA基因型59例，AA基因型56例。（2）rs36218431：研究組505例患者中GG基因型402例，GA基因型59例，AA基因型44例；對(duì)照組502例參與者中GG基因型403例，GA基因型57例，AA基因型42例。

2.2ATGSNP位點(diǎn)等位基因頻率與妊娠高血壓易感性的關(guān)系經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)后，研究組和對(duì)照組AGT基因2個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型分布均遵守遺傳平衡定律，兩組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在2個(gè)SNP位點(diǎn)中。僅rs2006765等位基因G頻率在病例組（91.0%，919/1 010）高于對(duì)照組（83.0%，833/1 004），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3rs5050基因多態(tài)性對(duì)AGT分泌水平的影響研究組rs5050的GG基因型外周血中AGT分泌水平為（49±3）ng/L，顯著高于AA+GA基因型的（31.0±2.5）n/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3　討論

妊娠高血壓是妊娠期婦女所特有的疾病之一，其特征性的臨床病理特征就是在孕周20周后出現(xiàn)血壓升高伴蛋白尿。雖然以往有很多的研究對(duì)該病進(jìn)行過一系列研究，但迄今為止其病因仍不是很明確。流行病學(xué)資料顯示妊娠高血壓與基因遺傳有密切關(guān)系，大量的研究數(shù)據(jù)表明遺傳性因素在各種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，妊娠高血壓也不例外［3-5］。隨著該病相關(guān)的遺傳易感基因研究的不斷展開，已發(fā)現(xiàn)有一批相關(guān)的基因SNPs與妊娠高血壓病易感性存在明顯相關(guān)性［13-14］。本研究將圍繞著AGT單核苷酸多態(tài)性與妊娠高血壓之間的關(guān)系進(jìn)行相關(guān)研究，試圖闡明AGT單核苷酸多態(tài)性在妊娠高血壓中的作用。

盡管妊娠高血壓的具體病因還不清楚，但越來越多的證據(jù)表明RAS系統(tǒng)在妊娠高血壓中發(fā)揮著重要作用［9-10］。而AGT是RAS系統(tǒng)中重要的一類分子，AGT是腎素作用的前底物。在血液循環(huán)中，其被腎素水解生成無活性的AngⅠ，后者在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）作用下轉(zhuǎn)化成AngⅡ。RAS系統(tǒng)主要通過Ansll發(fā)揮收縮血管、增加心輸出量、促進(jìn)血壓升高［10］。本研究采用病例對(duì)照研究方法，探討AGTSNPs在妊娠期高血壓中的作用，為有針對(duì)性地做好孕前及孕期保健、提高監(jiān)測和干預(yù)效果、減少妊娠期高血壓的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)提供科學(xué)依據(jù)。從本研究的數(shù)據(jù)來看，AGT中的rs5050位點(diǎn)存在GG、GA和AA 3種基因型，其中研究組等位基因G頻率（91.0%，919/1 010）顯著高于對(duì)照組（83.0%，833/1 004），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這一數(shù)據(jù)表明AGT在妊娠高血壓這一病例過程中有可能發(fā)揮著潛在的作用。本研究根據(jù)AGT是RAS系統(tǒng)中重要的一員這一特性，檢測不同基因型患者血清中的AGT水平看是否與之有關(guān)系。本研究結(jié)果顯示rs5050位點(diǎn)GG基因型外周血AGT濃度為（49±3）ng/L，顯著高于AA/GA基因型的（31.0± 2.5）ng/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。提示AGT基因rs5050多態(tài)性與妊娠高血壓易感性有顯著相關(guān)性，其等位基因G是妊娠高血壓的易感基因。rs5050多態(tài)性影響宿主外周血的AGT表達(dá)水平，在妊娠高血壓過程中起重要作用。而兩組另一位點(diǎn)rs36218431比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

總之，AGT作為RAS系統(tǒng)中重要的一員，其在妊娠高血壓發(fā)展中有著重要作用，而從基因水平出發(fā)檢測該基因在rs5050的多態(tài)性后發(fā)現(xiàn)，GG型有助于妊娠高血壓的發(fā)展，其可能是通過影響AGT在外周血中的表達(dá)水平發(fā)揮重要作用。這為臨床更好地了解AGT在妊娠高血壓中的作用提供了新的觀點(diǎn)，同時(shí)也為臨床提供潛在的治療靶點(diǎn)。

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