循環(huán)腫瘤細(xì)胞在肺癌診斷中的研究進(jìn)展

黃 璜綜述，陳 虹審校（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，重慶400016）

循環(huán)腫瘤細(xì)胞在肺癌診斷中的研究進(jìn)展

黃 璜綜述，陳 虹△審校
（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，重慶400016）

肺腫瘤/診斷； 血液循環(huán)； 早期診斷； 預(yù)后； 綜述

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率及死亡率在惡性腫瘤中均位居前列［1-2］，約40%的肺癌患者在初診時(shí)即合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［3］，從而嚴(yán)重影響肺癌患者預(yù)后。目前肺癌診斷方法（包括篩查血清腫瘤標(biāo)志物、影像學(xué)檢查、病理活檢等）的安全性、準(zhǔn)確性等不盡如人意。因此，新型肺癌診斷方法的探索存在需要的臨床意義。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）作為“液體活檢”，有助于肺癌診斷，可能成為未來(lái)肺癌診斷的重要方法。本文主要對(duì)CTCs在肺癌診斷中的研究進(jìn)展作一綜述。

1 肺癌診斷現(xiàn)狀

肺癌是世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)性死亡的主要原因，每年有大約 1 800萬(wàn)新發(fā)病例，5年生存率大概為15%［4-5］。目前有研究表明，未發(fā)生轉(zhuǎn)移的早、中期肺癌患者的5年生存率約為發(fā)生轉(zhuǎn)移者的13倍［6］，且早期肺癌患者有接受手術(shù)的機(jī)會(huì)，從而可提高肺癌患者的5年生存率［7］，故肺癌的早期診斷對(duì)于改善肺癌患者預(yù)后尤為重要。

肺癌的診斷方法包括篩查血清腫瘤標(biāo)志物、影像學(xué)檢查及病理活檢。就目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用的肺癌腫瘤標(biāo)志物來(lái)說(shuō)，包括癌胚抗原、細(xì)胞角蛋白片段抗原21-1、鱗狀細(xì)胞癌抗原及特異性烯醇化酶等，其敏感性及特異性仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于理想值［8-9］。而影像學(xué)檢查主要評(píng)估腫瘤位置及大小，不能良好地反映肺癌的惡性程度及侵襲能力［10］。病理活檢是目前肺癌診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但病理活檢作為一項(xiàng)有創(chuàng)操作，可能出現(xiàn)出血、氣胸等并發(fā)癥，同時(shí)由于各種限制，結(jié)果可能為陰性［11］。這些均導(dǎo)致了病理活檢的應(yīng)用低于臨床期望值，制約了病理活檢的發(fā)展。從而臨床上迫切需要具備高敏感性和特異性的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)用于肺癌診斷或篩查，補(bǔ)足目前診斷方法的缺陷。

2 CTCs的檢測(cè)方法

2.1 CTCs概述 CTCs是指由原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移灶上脫落下來(lái)進(jìn)入血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，其脫落的關(guān)鍵機(jī)制包括腫瘤對(duì)血管的內(nèi)滲作用及腫瘤相關(guān)脈管系統(tǒng)軟化使細(xì)胞被動(dòng)脫落。CTCs具有與腫瘤原發(fā)灶一致的細(xì)胞學(xué)和遺傳學(xué)特征，且在早期腫瘤甚至癌前病變患者的外周血中即可檢測(cè)到CTCs。因此，CTCs作為“液體活檢”在肺癌診斷中存在極大價(jià)值［12］。CTCs的臨床應(yīng)用對(duì)于肺癌的準(zhǔn)確診斷提供了一種無(wú)創(chuàng)性的新型診斷方法，在肺癌的早期診斷中具有重要的臨床意義。

CTCs在血液中的含量極少（1/106～1/107），因此為了將檢測(cè)CTCs的敏感性提高到滿(mǎn)意程度，富集技術(shù)便顯得尤為重要。目前的富集方法包括使用免疫分離方法選取帶有腫瘤特異性標(biāo)記的靶細(xì)胞，以及根據(jù)形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)選取相應(yīng)細(xì)胞。CTCs經(jīng)過(guò)富集技術(shù)濃縮后，即可通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)或反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）等方法進(jìn)行檢測(cè)［13］。

2.2 富集技術(shù) CTCs富集技術(shù)主要通過(guò)辨別細(xì)胞形態(tài)特征所完成，該方法使用免疫磁珠（陰性富集或陽(yáng)性富集）及通過(guò)微流體進(jìn)行免疫分離：（1）基于形態(tài)學(xué)的富集技術(shù)。對(duì)大于白細(xì)胞（＞8 μm）的細(xì)胞進(jìn)行過(guò)濾，但目前鮮有研究證實(shí)所有的CTCs均大于8μm，故此種方法尚缺乏說(shuō)服力［14］。（2）免疫磁珠。免疫磁性分選系統(tǒng)是用于捕獲由磁珠所標(biāo)記細(xì)胞的專(zhuān)門(mén)工具，通過(guò)細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)染色達(dá)到目的，其后續(xù)步驟為透化及固定。例如CD326，其是參與細(xì)胞黏附的細(xì)胞表面分子，在大多數(shù)上皮癌中呈高度表達(dá)，以及腫瘤細(xì)胞抗原表皮生長(zhǎng)因子受體2均可與用單克隆抗體所包被的磁珠結(jié)合，從而使CTCs的富集順利進(jìn)行［15］。（3）干細(xì)胞技術(shù)。干細(xì)胞技術(shù)是一種陰性富集技術(shù)，其原理為CD45+細(xì)胞和多個(gè)紅細(xì)胞通過(guò)雙特異性四聚體抗體復(fù)合物交叉結(jié)合成細(xì)胞團(tuán)，隨著這類(lèi)非檢測(cè)需要的細(xì)胞密度增加，密度梯度離心后，CD陽(yáng)性的細(xì)胞聚集在下層，而CD陰性的單核細(xì)胞則被隔離在介質(zhì)和等離子體之間，從而達(dá)到富集目的［16］。

2.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)法 細(xì)胞計(jì)數(shù)法基于抗原表達(dá)的原理分離和計(jì)數(shù)單個(gè)細(xì)胞，其中作用于特異性上皮抗原的單克隆抗體得到廣泛應(yīng)用。與核酸檢測(cè)法比較，細(xì)胞計(jì)數(shù)法可保持細(xì)胞的完整性，從而可更加深入地描述CTCs，同時(shí)以便進(jìn)一步對(duì)CTCs進(jìn)行形態(tài)及分子鑒別。但是細(xì)胞計(jì)數(shù)法的主要特點(diǎn)是當(dāng)前特異性抗體的缺乏，但這個(gè)問(wèn)題可通過(guò)對(duì)CD45進(jìn)行復(fù)染彌補(bǔ)一部分。在提高敏感性和特異性方面，則可通過(guò)多標(biāo)志物的應(yīng)用來(lái)處理，這能夠在一定程度上克服由于腫瘤的異質(zhì)性帶來(lái)的檢測(cè)難題［17］。

2.4 核酸檢測(cè)法 CTCs也可通過(guò)檢測(cè)具有特定基因序列的腫瘤細(xì)胞來(lái)測(cè)定，如原癌基因或腫瘤抑制基因的DNA突變、致癌病毒序列的檢測(cè)均可用于CTCs的鑒定。但由于DNA的變異僅僅發(fā)生在發(fā)育異常的病變或成熟的腫瘤中，故循環(huán)游離DNA可能僅僅反映了核酸的存在，而非腫瘤細(xì)胞的存在，故目前檢測(cè)游離DNA并未用于臨床實(shí)踐。在臨床實(shí)踐中，更多使用的是通過(guò)檢測(cè)mRNA來(lái)反映CTCs的存在，常用方法包括PCR、RT-PCR等。有研究表明，RT-PCR的敏感性?xún)?yōu)于免疫細(xì)胞化學(xué)，但遺憾的是，該研究無(wú)對(duì)照組的數(shù)據(jù)［18］。其中定量RT-PCR增加了正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的mRNA區(qū)分度的表達(dá)，但與細(xì)胞計(jì)數(shù)法相似，RT-PCR也存在缺少特異性組織標(biāo)記的問(wèn)題。由于正常細(xì)胞的標(biāo)記有時(shí)難以與腫瘤細(xì)胞的標(biāo)記相區(qū)分，導(dǎo)致核酸檢測(cè)法具有較高的敏感性，但特異性卻難以達(dá)到令人滿(mǎn)意的程度，同時(shí)核酸檢測(cè)法操作相對(duì)復(fù)雜，易受污染，應(yīng)用也受到限制。

2.5 CellSearch系統(tǒng) 該系統(tǒng)是目前美國(guó)食品藥物管理局唯一批準(zhǔn)的CTCs檢測(cè)方法。CellSearch系統(tǒng)是一種將富集和檢測(cè)結(jié)合起來(lái)的半自動(dòng)技術(shù)，分析檢測(cè)的快速性及樣本的可回收性是CellSearch系統(tǒng)的一大特色。CellSearch的檢測(cè)原理是因?yàn)閬?lái)源于中胚層的白細(xì)胞可表達(dá)CD45，而來(lái)源于外胚層的腫瘤細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞角蛋白（CK）及上皮細(xì)胞黏附分子（EpCAM），但不表達(dá)CD45，故在富集過(guò)程中，采用CK和苯基吲哚（DAPI）進(jìn)行熒光染色，造血細(xì)胞則由CD45進(jìn)行對(duì)比染色，然后使用自動(dòng)熒光顯微鏡篩選出EpCAM+/CK+/DAPI+/ CD45-的細(xì)胞，可將其界定為CTCs。國(guó)外有研究者證實(shí)，在使用CK、EpCAM及DAPI標(biāo)記時(shí)，特異度可達(dá)100%［19］，但該項(xiàng)研究樣本數(shù)較少，故CellSearch系統(tǒng)的在檢測(cè)CTCs中的敏感性和特異性可能需要更多研究證實(shí)。

2.6 CTC-chip法 該法與CellSearch系統(tǒng)原理基本相同，在芯片上約有78 000個(gè)顯微位點(diǎn)，每一個(gè)顯微位點(diǎn)均包埋有EpCAM抗體，當(dāng)檢測(cè)樣本通過(guò)芯片時(shí)，CTCs即可被位點(diǎn)捕獲，該方法以CKs和DAPI為陽(yáng)性，以CD45為陰性為標(biāo)準(zhǔn)［20］，從目前研究來(lái)看，CTC-chip具有更高的敏感性，可在1 mL血液中檢測(cè)出CTCs，其分離純度約為CellSearch的100倍，但因其局限于使用EpCAM檢測(cè)CTCs，故CTC-chip法在應(yīng)用過(guò)程中可能出現(xiàn)假陽(yáng)性［21］。

2.7 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法（ELISPOT） ELISPOT可使用黏蛋白-1和CK19作為標(biāo)記，去除CD45+的細(xì)胞，富集得到腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白（CXCR4）陽(yáng)性的細(xì)胞，檢測(cè)CTCs釋放的特定蛋白質(zhì)，因此可取得較高的敏感性和特異性［22］。目前還不存在CTCs檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，仍需通過(guò)不斷努力研究提高上述方法的可靠性。

3 CTCs在肺癌診斷中的價(jià)值

肺癌的早期診斷對(duì)于選擇治療方式及提高肺癌患者的5年生存率至關(guān)重要，是改善肺癌預(yù)后的關(guān)鍵步驟之一。目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)CTCs在肺癌中的診斷價(jià)值都進(jìn)行了較多的研究。有研究結(jié)果顯示，CTCs在肺癌診斷中的敏感性為30.4%～89.0%，特異性為84.1%～100.0%［23-27］。其中Lou等［24］和Yu等［27］在2013年均設(shè)計(jì)了以PCR檢測(cè)CTCs的研究，設(shè)計(jì)的臨界值分別為8.64 CTCs單位及8.5 CTCs單位，對(duì)共計(jì)225例非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行了診斷，結(jié)果顯示敏感度分別為73.20%和81.80%，特異度分別為84.10%和93.20%，其中Yu等［27］報(bào)道的曲線(xiàn)下面積（AUC）為0.823。Chen等［23］則在2014年應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)（FISH）對(duì)50例非小細(xì)胞肺癌患者外血清內(nèi)的CTCs進(jìn)行了檢測(cè)，臨界值為每3.2毫升2個(gè)細(xì)胞單位，敏感度和特異度分別為84.00%、97.60%。而Fiorelli等［25］在2015年設(shè)計(jì)了以免疫組織化學(xué)為檢測(cè)方法的相關(guān)研究，限定臨界值為CTCs計(jì)數(shù)大于25個(gè)，對(duì)60例平均年齡為65.5歲的肺癌患者進(jìn)行了CTCs篩查，得到的敏感度和特異度分別為89.00%、100.00%。上述4項(xiàng)研究均顯示，CTCs具有較好的敏感性及特異性，但Tanaka等［26］于2009年報(bào)道的CTCs在肺癌中的應(yīng)用數(shù)據(jù)顯示（臨界值為CTCs計(jì)數(shù)大于1個(gè)），125例肺癌患者中，真陽(yáng)性、假陽(yáng)性、真陰性及假陰性患者分別為38、3、22、87例，從而得到敏感度和特異度分別為30.40%、88.00%，AUC為0.598。

上述研究結(jié)果提示，CTCs在肺癌診斷的應(yīng)用中雖具備較好的敏感性及特異性，但可能存在不足：（1）不同研究樣本數(shù)的影響，在5篇文獻(xiàn)中，樣本數(shù)均偏小，可能是造成其敏感性波動(dòng)范圍較大的原因［23-27］；（2）研究對(duì)象中肺癌不同病理類(lèi)型對(duì)于診斷結(jié)果的影響，如Lou等［24］和 Yu等［27］所報(bào)道的肺癌類(lèi)型為非小細(xì)胞肺癌，其敏感性及特異性相對(duì)接近；（3）CTCs檢測(cè)方法的不同，在上述文獻(xiàn)中，其檢測(cè)方法包括PCR、FISH、免疫細(xì)胞化學(xué)等，在進(jìn)行CTCs檢測(cè)時(shí)即可出現(xiàn)誤差；（4）不同研究者對(duì)于臨界值定義的不同，5位研究者其研究設(shè)計(jì)的臨界值分別為8.64、2、8.5、25、1個(gè)CTCs單位，而臨界值的設(shè)定直接關(guān)系到敏感性和特異性的計(jì)算，由此可見(jiàn)，在目前研究中，臨界值差異可能是造成誤差的主要原因之一；（5）納入的肺癌患者分期的不同，目前研究表明，不同分期的肺癌可造成外周血中CTCs計(jì)數(shù)的不同，故在比較過(guò)程中，亞組分析是關(guān)鍵的一步，但Chen等［23］及 Fiorellli等［25］并未進(jìn)行亞組分析。因此為確定CTCs在肺癌診斷中是否存在較大優(yōu)勢(shì)，可能需要更多、大型、前瞻性的研究證實(shí)。

綜上所述，作為潛在的新型肺癌腫瘤標(biāo)志物，CTCs具有較好的敏感性及特異性，是一種快速、無(wú)創(chuàng)的診斷方法，因此CTCs是一種有潛力的外周血腫瘤標(biāo)志物，但仍需更多的研究評(píng)估其臨床意義，從而指導(dǎo)臨床應(yīng)用。

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