磷酸二酯酶5基因在腎癌組織中表達(dá)情況的研究

潘曉波，王雪，任雨，翁國(guó)斌

磷酸二酯酶5基因在腎癌組織中表達(dá)情況的研究

潘曉波，王雪，任雨，翁國(guó)斌

目的探討磷酸二酯酶5（PDE5）基因在腎癌組織中的表達(dá)情況。方法采用RT-qPCR和Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)45例腎癌及其癌旁組織中PDE5基因的表達(dá)水平。結(jié)果腎癌PDE5/癌旁PDE5的mRNA陽(yáng)性表達(dá)相對(duì)Ct值為（1.65±0.1189），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；腎癌PDE5/癌旁PDE5的蛋白陽(yáng)性表達(dá)的相對(duì)灰度值為（2.664±0.3419），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）。結(jié)論P(yáng)DE5基因在腎癌的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用。

磷酸二酯酶5；腎腫瘤；癌

腎癌是泌尿系統(tǒng)較常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，目前手術(shù)切除仍是主要的治療手段。近些年分析腎癌的生物學(xué)特性，探索其治療的新途徑成為了臨床關(guān)注的熱點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)磷酸二酯酶5（PDE5）在某些腫瘤如結(jié)腸癌、膀胱癌及乳腺癌等腫瘤中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)且活性明顯增加進(jìn)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡，由此推測(cè)PDE5在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。然而，PDE5在腎癌中的表達(dá)情況還不清楚，因此，本研究采用RT-qPCR、Western blot實(shí)驗(yàn)研究PDE5基因在腎癌組織中的表達(dá)情況，為今后腎癌的臨床治療尋找新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料收集寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鄞州醫(yī)院2011—2015年手術(shù)切除的腎癌組織45例，術(shù)前均未行放化療，標(biāo)本均于術(shù)后立即取材并保存在液氮中。選取距腫瘤邊緣2 cm以上的癌旁組織作對(duì)照。其中男27例，女18例；年齡28～82歲，平均（56.99±4.98）歲；按AJCC標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分期：T1～T2 32例，T3～T4 13例；按TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ～Ⅱ期29例，Ⅲ～Ⅳ期16例；分化程度：高分化9例，中分化31例，低（未）分化5例；腫瘤直徑：≥4cm者19例，＜4cm者26例。

1.2檢測(cè)方法

1.2.1RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PDE5mRNA在不同組織中的表達(dá)。分別取腎癌組織及癌旁組織，采用TrizolReagent試劑盒（Invitrogen，美國(guó)）提取細(xì)胞總RNA，測(cè)量RNA濃度，然后應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Toyobo，日本）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。合成后的cDNA進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（Toyobo，日本），肌動(dòng)蛋白（B-actin）作內(nèi)參對(duì)照。根據(jù)PDE5及B-actin基因序列設(shè)計(jì)引物為：PDE-5正向5’-CACACCGAATCTTGCTCTTG-3’，反向5’-TCAGAATCCTTGACAACAATGG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物134 bp；B-actin正向5’-AATCGTGCGTGACATTAAG-3’，反向5’-GAAGGAAGGCTGGAAGAG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物178bp。定量的方法參照文獻(xiàn)［1］，以Ct法表示基因的表達(dá)量。

1.2.2Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PDE5蛋白在不同組織中的表達(dá)量。將腎癌組織及癌旁正常組織用組織蛋白提取液勻漿后，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗，溶解于冰浴PBS緩沖液（0.lmol/LTris-HCl，pH 8.0、100 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1％乙基苯基聚乙二醇、0.5％脫氧膽酸鈉、0.1％SDS、0.1％蛋白酶抑制劑混合物、10mmol/LPMSF），30 min。4℃下21 000 r/min離心30min，離心收集上清液，Bradford法檢測(cè)蛋白濃度，取溶于緩沖液中的20 mg蛋白質(zhì)行12％SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜上，加入相應(yīng)抗體進(jìn)行免疫印記。由ECL試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）完成檢測(cè)，應(yīng)用Quantity One 4.4軟件處理分析。

1.3統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較用檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較用2檢驗(yàn)。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1PDE5 mRNA在腎癌及癌旁組織中的表達(dá)情況134 bp（PDE5）及178 bp （B-actin）處均有單一特異性條帶，134bp處的條帶腎癌組較癌旁組織組明顯（封三彩圖2A），腎癌組織中的PDE5 mRNA表達(dá)明顯高于癌旁組織（封三彩圖2B），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=5.323，＜0.05）。

2.2PDE5蛋白在腎癌及癌旁組織中的表達(dá)情況腎癌及癌旁組織組織內(nèi)均有PDE5蛋白表達(dá)，蛋白條帶位置為105 kDa（封三彩圖3A）。蛋白條帶灰度值分析表明，PDE5蛋白在腎癌組織中表達(dá)較癌旁組織明顯增高（封三彩圖3B），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=4.869，＜0.05）。

3　討論

PDE5是環(huán)核苷酸水解酶超家族的成員之一，可以特異性水解細(xì)胞內(nèi)第二信使cGMP［2］，最早從大鼠的肺中提純出來(lái)［3］，后在1993年首次被克?。?］。PDE5主要分布于大腦、陰莖海綿體、血管平滑肌細(xì)胞、肺及血小板等［5］，主要是調(diào)節(jié)平滑肌的收縮，同時(shí)在大腦內(nèi)cGMP信號(hào)傳遞上起到重要的作用［6］。

國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)，PDE5在結(jié)腸癌、膀胱癌及乳腺癌中高表達(dá)且活性增加［7-8］，但其在人腎癌組織中的表達(dá)情況如何，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究顯示PDE5在腎癌組織中的表達(dá)較癌旁組織高（＜0.05），提示其可能在腎癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)PDE5抑制劑對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，有研究發(fā)現(xiàn)PDE5在甲狀腺腫瘤中高表達(dá)，應(yīng)用西地那非阻止了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移［9-10］。Kwon等［11］報(bào)道，PDE5抑制劑提高了結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)cGMP濃度，激活了下游的PKG，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Ren等［12］通過(guò)轉(zhuǎn)染表達(dá)PDE5特異性的反義序列的載體于人腎癌OSRC2細(xì)胞，PDE5基因表達(dá)減少，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，研究表明cGMP/PKG信號(hào)傳導(dǎo)通路在調(diào)節(jié)腎癌細(xì)胞的增殖和存活方面起著重要的作用。由此可見(jiàn)，PDE5抑制劑可以抑制細(xì)胞內(nèi)cGMP的特異性水解，提高腫瘤細(xì)胞內(nèi)濃度，激活下游PKG，使細(xì)胞增殖抑制，發(fā)揮抗凋亡作用。本研究發(fā)現(xiàn)PDE5在腎癌組織中也呈高表達(dá)，因此推測(cè)cGMP/PKG信號(hào)傳導(dǎo)通路在腎癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，但具體作用機(jī)制尚需研究，為進(jìn)一步研究腎癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供理論依據(jù)，同時(shí)為探索腎癌治療新途徑提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.08.009

R737.11

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1671-0800（2016）08-0997-02

2016-01-25

（本文編輯：孫海兒）

315040寧波，寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鄞州醫(yī)院

潘曉波，Email：179571095 @qq.com