原料乳中玉米赤霉烯酮膠體金免疫試紙條檢測方法的建立

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（1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院乳品科學教育部重點實驗室哈爾濱150030；2.國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，哈爾濱150028）

原料乳中玉米赤霉烯酮膠體金免疫試紙條檢測方法的建立

丁木1，姜霞1，王蕊1，孫露宏1，周文琦1，趙玥明1，滿朝新2，姜毓君1,2

（1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院乳品科學教育部重點實驗室哈爾濱150030；2.國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，哈爾濱150028）

采用檸檬酸三鈉法合成膠體金，與抗玉米赤霉烯酮單抗（ZEA-mAb）制成抗體-膠體金標記物，包被于膠體金結(jié)合墊上。玉米赤霉烯酮半抗原和蛋白的偶聯(lián)物（ZEA-BSA）和羊抗鼠IgG分別噴涂于硝酸纖維素膜作為檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線），建立原料乳中玉米赤霉烯酮（ZEA）的膠體金免疫試紙條檢測法。結(jié)果顯示，試紙條的靈敏度為30n g/mL，與其他毒素無交叉反應，10 min內(nèi)即可肉眼觀察結(jié)果。檢測添加有玉米赤霉烯酮的原料乳樣品，該試紙條的檢測限為50 ng/mL。方法可用于原料乳中玉米赤霉烯酮的快速檢測。

玉米赤霉烯酮；試紙條；原料乳

0 引言

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEA)是由多種鐮刀真菌產(chǎn)生，易導致不孕、流產(chǎn)[1]；此外，還具有細胞毒性、免疫毒性[2-3]，嚴重威脅人類健康。ZEA主要存在于作物中[4-5]，會嚴重影響以谷物為飼料的反芻動物生產(chǎn)，影響乳的品質(zhì)。我國飼料衛(wèi)生標準中規(guī)定玉米類飼料中ZEA質(zhì)量分數(shù)不準超過500 μg/kg，GB 2761中規(guī)定谷物及其制品中ZEA不超過60 μg/kg。

目前用于測定ZEA的方法，如：薄層層析（thin-layer chromatography，TLC)、氣相色譜法(gas chromatography，GC)[6-8]，通常需要大型設(shè)備、復雜的前處理及專業(yè)的操作人員。而膠體金免疫層析技術(shù)(Colloidal gold immunochromatographic assay，GICA)[9-10]具有方便操作、檢測快速、不需特殊設(shè)備和人員培訓等優(yōu)點，特別適合于大批量的檢測。本研究旨在建立一種簡便、快速檢驗原料乳中ZEA的膠體金免疫試紙條檢測方法。

1 實驗

1.1主要儀器

高速冷凍離心機，紫外分光光度計，恒溫磁力攪拌器，恒溫鼓風干燥箱，點膜儀，切割機。

1.2試劑與耗材

玉米赤霉烯酮，嘔吐毒素、黃曲霉毒素M1，伏馬毒素，玉米赤霉烯酮半抗原和蛋白的偶聯(lián)物(ZEA-BSA)，抗玉米赤霉烯酮單抗，羊抗鼠IgG，氯金酸(HAuCl4·4H2O)，檸檬酸三鈉，乙腈，硝酸纖維素膜（NC膜Sartorius CN140），玻璃纖維膜，吸水紙，PVC板。

1.3方法

1.3.1 膠體金的制備及鑒定

用檸檬酸三鈉還原氯金酸制備膠體金[11]，通過控制檸檬酸三鈉的添加量（分別2.5,1.5,1 mL），制備不同粒徑大小的膠體金溶液。利用透射電鏡的照射對膠體金顆粒進行評價。

1.3.2 膠體金標記抗體的條件

采用Mey氏穩(wěn)定化實驗[12]，取16個2 mL EP管，每管加入1 mL膠體金，分為四組做正交實驗。用濃度為2 mol/L的K2CO3調(diào)節(jié)pH值。其中A組不加K2CO3，B組中加入1 μL的K2CO3，C組中加入2 μL的K2CO3，D組中加入3 μL的K2CO3。將抗玉米赤霉烯酮單抗稀釋至0.9 mg/mL,每組1號管標記1 μL抗體，2號管標記2 μL抗體，3號管標記3 μL抗體，4號管標記4 μL抗體，混勻后避光靜置15 min。各管中加入20 μL質(zhì)量分數(shù)為10%的NaCl，震蕩混勻，于避光處靜置15 min。保持紅色的最低添加組為最少蛋白添加量，在這個基礎(chǔ)上的1.2倍為最適蛋白標記量。

1.3.3 膠體金標記抗體

取已制備好的膠體金溶液，按照上述的最佳條件標記抗體,振蕩混勻后避光靜置15 min。加入質(zhì)量濃度為100 g/L的BSA溶液100 μL，振蕩混勻，避光靜置15 min。4℃離心（10 000 r/min，15 min）后棄上清，去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)，將沉淀用質(zhì)量濃度為10 g/L的BSA溶液、體積分數(shù)為0.5%的Tween 20、質(zhì)量濃度50 g/L海藻糖、濃度20 mmol/L硼酸緩沖液(pH=8.0)溶解，4℃保存?zhèn)溆?。?00 μL金標抗溶液于長6 mm，寬4 mm的金標墊上，37℃烘干60 min。

1.3.4 檢測線及質(zhì)控線標記條件的確定

將ZEA-BSA分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.5，1，2，4，8 mg/mL，噴涂于NC膜上（常規(guī)噴量1.0 μL/cm），將羊抗鼠IgG稀釋成1 mg/mL噴涂于NC膜上（常規(guī)噴量1.0 μL/cm）；上述NC膜組裝成試紙條后用PBS（pH=7.4）滴定，選擇T線顯色能達到肉眼觀察要求的最小用量為最佳標記量。

根據(jù)T線工作濃度,將羊抗鼠IgG稀釋質(zhì)量濃度為1 mg/mL；按噴量0.2、0.4、0.6、0.8、1 μL/cm包被到NC膜上作為C線,同樣與金標墊組裝成試紙條后用PBS滴定，根據(jù)C線的顯色深淺及與T線顯色差異程度確定最佳噴量。

1.3.5 試紙條的組裝

將樣品墊、結(jié)合墊、NC膜、吸水墊依次黏在PVC底板上，用切割機將組裝好的大卡割成4 mm寬的試紙條，干燥保存。其中吸水墊與NC膜、膠體金結(jié)合墊和NC膜、樣品墊和膠體金結(jié)合墊分別交疊3 ～4 mm。

1.3.6 試紙條檢測限的確定

取空白奶樣，在樣品中加入等體積的乙腈，將提取液進行離心（5 000 r/min，5 min）處理，吸取上清液用于檢測。在處理液中添加玉米赤霉烯酮至終質(zhì)量濃度為0，10，20，30，50，100 ng/mL，用試紙條檢測。每個濃度設(shè)3個重復，確定檢測限。

1.3.7 試紙條的穩(wěn)定性實驗

將試紙條密封存放于37℃、25℃和4℃，觀察對試紙條穩(wěn)定性的影響。每天取出37℃保存的試紙條分別檢測0，50，100 ng/mL的ZEA標品溶液；每3天取出25℃保存的試紙條分別檢測0、50、100 ng/ml的ZEA標品溶液；每周取出4℃保存的試紙條分別檢測0，50，100 ng/mL的ZEA標品溶液，通過檢測結(jié)果判斷試紙條的保質(zhì)期。

1.3.8 試紙條的特異性實驗

通過與結(jié)構(gòu)類似物及其他霉菌毒素的交叉反應試驗來研究試劑條的特異性，選用黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素、伏馬毒素為交叉反應物。

2 結(jié)果與分析

2.1膠體金的制備及鑒定

通過電鏡掃描，根據(jù)顆粒大小、形狀是否均一等對膠體金溶液進行掃描鑒定。圖1為加入1.5 mL檸檬酸三鈉制備的膠體金溶液。膠體金顆粒的大小在25 nm左右，大小均一，且外觀純凈、透亮、無沉淀和漂浮物，符合制備試紙條對膠體金顆粒的要求。

圖1 膠體金顆粒的投射電鏡結(jié)果

2.2抗體的標記

實驗結(jié)果顯示，K2CO3添加量為2 μL組及抗體添加量為3 μL組金標抗整體能保持紅色不變，表明加入的抗體量可與膠體金在此條件下得到最大程度的結(jié)合。取1.2倍，即3.6 μL為最適的抗體添加量。同時，紫外檢測結(jié)果顯示該條件下吸光值最高，與原有膠體金溶液最高吸收峰處的偏離較小。

2.3檢測線和質(zhì)控線標記條件的確定

由圖2可以看出，當T線質(zhì)量濃度為2 mg/mL時，檢測線顯色清晰。由圖3中T線、C線顯色強度，可以看出標記量為0.8 μL/cm時，控制線顯色清晰。

圖2 檢測線標記條件的確定

圖2中，左到右T線標記量為0.5，1，2，4，8 mg/mL。

圖3 質(zhì)控線標記條件的確定

圖3中，從左到右C線標記量為1，0.8，0.6，0.4，0.2 μL/cm。

2.4試紙條檢測限的確定

試紙條檢測限的判定結(jié)果如圖4，隨著玉米赤霉烯酮含量升高，T線的顯色強度逐漸變淡。玉米赤霉烯酮質(zhì)量濃度為0和10 ng/mL時，T線和C線均顯色；玉米赤霉烯酮質(zhì)量濃度大于等于30 ng/mL時，T線不顯色。因此確定試紙條的檢測限為30 ng/mL。同樣，根據(jù)T線和C線顯色確定該試紙條對原料乳的最低檢測限為50 ng/mL。

圖4 檢測線的確定

圖4中，1 ～6分別代表加標樣品中玉米赤霉烯酮質(zhì)量濃度為0，10，20，30，50，100 ng/mL。

2.5試紙條的穩(wěn)定性實驗

該試紙條在4℃和25℃密封保存3個月，仍可以用于檢測陽性樣品，并且靈敏度沒有降低；37℃條件下密封保存的試紙條在15 d內(nèi)靈敏度保持不變，可滿足市場需求，穩(wěn)定性好。

2.6試紙條的特異性實驗

將本試紙條用于黃曲霉毒素M1、嘔吐毒素、伏馬毒素檢測時，C線和T線均顯色，呈陰性，說明本試紙條特異性好。

表1 試紙條的特異性

3 結(jié)論

通過上述的實驗可知，該玉米赤霉烯酮膠體金免疫試紙條的檢測時間為10 min，可以通過肉眼值得進行判定。另外，該試紙條靈敏度為30 ng/mL，能滿足國標要求。利用試紙條對陰性原料乳和陽性加標樣品的檢測，結(jié)果及重復性好，對于其他毒素無交叉反應，特異性好。同時，由于試紙條檢測的操作簡單，非專業(yè)的技術(shù)人員也可以使用，因此非常適用于對于乳品進行初級篩查。

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Development on detection card for determination of Zearalenone in raw milk

DING Mu1，JIANG Xia1，WANG Rui1，SUN Lu-hong1，ZHOU Wen-qi1，ZHAO Yue-ming1，MAN Chao-xin2，JIANG Yu-jun1,2
（1.Northeast Agricultural University Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,College of Food Science and Engineering Harbin 150030,China；2.National Research Center for Dairy Engineering and Technology，Harbin 150028,China）

Gold colloid nanoparticles were prepared with chloroauric acid and sodium Citrate.The colloidal gold nanoparticles labeled with zearalenone monoclonal antibody were coated on the conjugated pad.The artificial antigen ZEA-BSA and goat anti-mouse IgG were jetted on the nitrocellulose membrane,respectively,as test line and control line.The results showed the limit of detection was 30 ng/ml,and the whole test time was about 10 min.None cross activity were observed with other mycotoxins.The method based on the dipstick can be ap?plied to rapid detection of zearelenone residues in raw milk.

Zearalenone;gold immunochromatographic assay;raw milk

TS252.7

A

1001-2230（2016）11-0059-03

2016-01-07

國家科技支撐計劃課題（2013BAD18B11）；黑龍江省杰出青年科學基金（JC201415）；黑龍江省科研機構(gòu)創(chuàng)新能力提升專項計劃項目（YC13D005）。

丁木（1990-），女，碩士研究生，研究方向為食品科學。

姜毓君