清熱解毒類中藥單體的體外內抗肝癌作用研究▲

胡 超 曹 雯 許立拔 巫玲玲 黃 燕 符靜泉 周婉妮 蔣偉哲 焦 楊

(廣西醫(yī)科大學藥學院，南寧市 530021，E-mail：huchao9007@163.com)

論著·桂藥研究

清熱解毒類中藥單體的體外內抗肝癌作用研究▲

胡 超 曹 雯 許立拔 巫玲玲 黃 燕 符靜泉 周婉妮 蔣偉哲 焦 楊

(廣西醫(yī)科大學藥學院，南寧市 530021，E-mail：huchao9007@163.com)

目的 探討5種清熱解毒中藥單體對SMMC-7721肝癌細胞增殖和對H22荷瘤小鼠移植瘤的抑制作用。方法 SMMC-7721人肝癌細胞分別經不同濃度的迷迭香酸、黃芩苷、橙黃決明素、綠原酸和黃連素作用48 h后，四甲基偶氮唑鹽法檢測細胞增殖抑制率并篩選出有效中藥單體。采用H22肝癌細胞建立小鼠移植性肝癌模型，給予H22荷瘤小鼠不同濃度的迷迭香酸(300 mg/kg、150 mg/kg、75 mg/kg)和黃芩苷(200 mg/kg、100 mg/kg、50 mg/kg)10 d后，剝取瘤塊、胸腺、脾臟稱重，并計算抑瘤率、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。結果 迷迭香酸500 mg/L、250 mg/L、125 mg/L 濃度組和黃芩苷500 mg/L、250 mg/L濃度組吸光度A值均明顯低于對照組(P<0.05)，且細胞增殖抑制率均達到30%以上；橙黃決明素及黃連素組的細胞增殖抑制率均低于30%，綠原酸組細胞增殖抑制率<0。各劑量迷迭香酸組的瘤重均較模型組明顯下降(P<0.05)，對H22移植瘤的抑制率分別為48.2%、43.0%和39.0%，迷迭香酸各劑量組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。300 mg/kg黃芩苷組腫瘤重均低于模型組(P<0.05)，抑瘤率達到55.7%，黃芩苷各劑量組的脾臟、胸腺指數(shù)與模型組比較無顯著性差異(P>0.05)。結論 迷迭香酸和黃芩苷體外對SMMC-7721肝癌細胞和體內對H22移植瘤均有明顯的抑制作用。

肝癌；迷迭香酸；黃芩苷；體外；體內；抑瘤率

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，世界衛(wèi)生組織最新統(tǒng)計報告指出，2012年我國約38.4萬人死于肝癌，新增肝癌患者39.5萬，分別占全世界肝癌患者的51.4%和50.5%[1]。惡性腫瘤發(fā)病率高、死亡率高，且治療效果欠佳，因此從中藥中尋找安全、可靠、高效的抗腫瘤藥物顯得更加迫切。近年來，從中藥中篩選有效且毒副作用低的抗腫瘤藥物已成為中草藥研究領域的熱點之一，已有多項研究顯示清熱解毒類中藥具有抗腫瘤及抗肝癌作用[2-4]。本實驗采用四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法檢測迷迭香酸等5種清熱解毒類中藥單體對SMMC-7721肝癌細胞增殖的影響，并以H22荷瘤小鼠為模型探討迷迭香酸和黃芩苷的抑瘤作用及其對免疫器官的影響，為進一步深入研究迷迭香酸和黃芩苷的抗腫瘤作用機制提供理論基礎和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 1450型無菌超凈工作臺(蘇州凈化設備總廠)；3111型CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司)；CKX-41型倒置顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社)；MK3型酶標儀(美國Thermo公司)；電熱恒溫水浴箱(北京市醫(yī)療設備總廠)； SS-325全自動高壓滅菌鍋(日本TOMY公司)；TDL-5低速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)； DW86L621超低溫冰箱(青島海爾集團)；AB204-N電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 主要試劑與藥物 黃芩苷(含量98.59%，批號MUST-15012813)、迷迭香酸(含量99.40%，批號MUST-14111507)、綠原酸(含量99.39%，批號MUST-14091701)、黃連素(含量98.95%，批號MUST-15010411)、橙黃決明素(含量99.82%，批號：MUST-15070714)5種中藥單體均購于成都曼思特生物科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司，批號8115189)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，批號20150810)；0.25%胰酶(杭州四季青生物工程材料有限公司，批號：20150211)；MTT(索萊寶科技有限公司，批號：303H054)；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(索萊寶科技有限公司，批號302A0325)；環(huán)磷酰胺(山西普德藥業(yè)股份有限公司，批號：31707B)。

1.3 動物與瘤株 SPF級昆明種小鼠，雄性，5～6周齡，體質量(20±2)g，購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK桂2014-0002；SMMC-7721人肝癌細胞和H22小鼠肝癌細胞由廣西醫(yī)科大學藥理學教研室提供并傳代培養(yǎng)。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養(yǎng)及藥物配制：SMMC-7721和H22細胞分別培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。以上5種中藥單體用RPMI 1640培養(yǎng)基溶解后，均配制成1 g/L的儲備液，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?，使用時用RPMI 1640培養(yǎng)基將5種中藥單藥分別稀釋至3個濃度：黃芩苷、迷迭香酸及橙黃決明素為500 mg/L、250 mg/L、125 mg/L，綠原酸和黃連素為80 mg/L、40 mg/L及20 mg/L。

1.4.2 MTT法檢測細胞增殖狀況：取對數(shù)生長期的SMMC-7721肝癌細胞，以5×104個/ml的細胞密度接種于96孔板中，每孔100 μl。將接種后的培養(yǎng)板移入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將細胞分為對照組和5個給藥組，每組3個平行復孔。給藥組分別加入100 μl不同濃度的藥物，空白對照組加入100 μl培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)44 h后每孔加入5 g/L的MTT 20 μl，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，棄上清液，每孔加入100 μl DMSO溶解MTT產物，振蕩，使紫色結晶物充分溶解，采用酶標儀在490 nm波長處檢測各孔吸光度A值，計算細胞增殖抑制率。抑制率(%) =(1-給藥組平均A值/對照組平均A值)×100%。

1.4.3 黃芩苷、迷迭香酸對H22荷瘤小鼠的影響：由于實驗結果顯示迷迭香酸和黃芩苷在體外對肝癌細胞的增殖有較強的抑制作用，因此我們以H22荷瘤小鼠為模型進一步探討迷迭香酸和黃芩苷的體內抗腫瘤作用。(1)H22荷瘤小鼠模型的建立。按常規(guī)方法，無菌抽取傳代8 d的H22細胞腹水，加入生理鹽水調整細胞濃度為1.5×107個/ml，于每只小鼠右側腋部皮下接種0.2 ml(即細胞數(shù)3×106個/只)。接種腫瘤24 h后，用Excel 軟件按分層隨機分組法將小鼠隨機分為模型組、陽性對照組(環(huán)磷酰胺組)、黃芩苷高、中、低劑量組與迷迭香酸高、中、低劑量組，每組6只。(2)給藥方法及觀察指標。模型組灌胃給予生理鹽水 20 ml/kg，1次/d；陽性對照組腹腔注射環(huán)磷酰胺20 mg/kg，注射體積為20 ml/kg，隔日一次；黃芩苷高、中、低劑量組分別給黃芩苷200 mg/kg、100 mg/kg、50 mg/kg，迷迭香酸高、中、低劑量組分別給迷迭香酸300 mg/kg、150 mg/kg、75 mg/kg，各組灌胃量均為20 ml/kg，1次/d，連續(xù)10 d。末次給藥24 h后，頸椎脫臼處死，剝離腫瘤、胸腺、脾臟，稱質量，分別計算抑瘤率、胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)。腫瘤抑制率=[(對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/對照組平均瘤重]×100%；胸腺指數(shù)=胸腺重量(mg)/體重(g)；脾臟指數(shù)=脾臟重量(mg)/體重(g)。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 16.0軟件進行分析，計量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 5種中藥單體對SMMC-7721人肝癌細胞增殖的影響 各組A值比較，差異有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。迷迭香酸各濃度組和500 mg/L、250 mg/L的黃芩苷A值均明顯低于對照組(P<0.05)，且細胞增殖抑制率均大于30%。250 mg/L、125 mg/L橙黃決明素及40 mg/L、80 mg/L黃連素A值也低于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，細胞增殖抑制率均低于30%。綠原酸各濃度組A值均高于對照組，其中20 mg/L的綠原酸A值明顯高于對照組(P<0.05)，且綠原酸的細胞增殖抑制率均<0，提示綠原酸可能有促進7721肝癌細胞增殖的作用。見表1。

表1 5種中藥單體對人肝癌 細胞SMMC-7721增殖的影響(x±s，n=3)

注：與對照組相比，P<0.05。

2.2 迷迭香酸對H22荷瘤小鼠的抑瘤率、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)影響 環(huán)磷酰胺組和迷迭香酸各劑量組的瘤重與模型組相比均有明顯的下降(P<0.05)，迷迭香各劑量組的抑瘤率均高于30%，其中高劑量組最高。見表2。迷迭香酸各劑量組的脾臟、胸腺指數(shù)與模型組相比無差異(P>0.05)，環(huán)磷酰胺組的脾臟、胸腺指數(shù)均低于模型組(P<0.05)，見表3。

表2 迷迭香酸對H22移植瘤 小鼠體重及瘤重的影響(x±s，n=6)

注：與模型組比較，*P<0.05。

表3 迷迭香酸對H22移植瘤 小鼠脾臟、胸腺指數(shù)的影響(x±s，n=6)

注：與模型組比較，*P<0.05。

2.3 黃芩苷對H22荷瘤小鼠的抑瘤率、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)影響 環(huán)磷酰胺組及黃芩苷高劑量組腫瘤重均低于模型組 (P<0.05)，黃芩苷高劑量組抑瘤率為55.7%，見表4。黃芩苷各劑量組的脾臟、胸腺指數(shù)與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，環(huán)磷酰胺組的脾臟、胸腺指數(shù)均低于模型組(P<0.05)，見表5。

表4 黃芩苷對H22移植瘤 小鼠體重及瘤重的影響(x±s，n=6)

注：與模型組比較，*P<0.05。

表5 黃芩苷對H22移植瘤 小鼠脾臟、胸腺指數(shù)的影響(x±s，n=6)

注：與模型組比較，*P<0.05。

3 討 論

惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展是多種因素影響的結果，炎癥與腫瘤的發(fā)生密切相關，長期慢性炎癥是肝癌、胃癌、肺癌等的重要致病因素[5-6]。清熱解毒藥是具有寒涼特性、能夠消除熱毒或火毒的一類中藥，具有抗炎、抗內毒素、提高機體免疫能力等多種功效，且在一定程度上能控制腫瘤的發(fā)展，在惡性腫瘤防治過程中起著不可替代的作用[7-8]。從傳統(tǒng)中草藥中發(fā)現(xiàn)并證實抗腫瘤藥物的作用，已成為目前國內中草藥研究領域的熱點。本實驗采用MTT檢測法比較迷迭香酸等5種清熱解毒中藥單體對肝癌細胞SMMC-7721體外增殖的抑制作用，結果表明迷迭香酸各濃度組及黃芩苷250和500 mg/L濃度組對肝癌細胞增殖有明顯抑制作用，抑制率均達到30%以上，提示迷迭香酸和黃芩苷在體外對肝癌細胞的增殖有較強的抑制作用，因此我們以H22荷瘤小鼠為模型進一步探討迷迭香酸和黃芩苷的體內抗腫瘤作用。

迷迭香酸是一種天然抗氧化劑，具有抗炎、免疫調節(jié)、抑制細胞增殖、抗腫瘤等作用[9]，能夠減輕氧化應激和長期炎癥引起的癌變，有效地預防和治療癌癥[10]。黃芩苷是一種具有抗炎、抗氧化、增強機體免疫功能等多種藥理作用黃酮類化合物，臨床上許多清熱解毒、抗菌消炎的中成藥都含有黃芩苷[11]。體內抗腫瘤研究結果顯示，迷迭香酸各劑量組的瘤重與模型組相比均明顯下降(P<0.05)，中、高劑量組的抑瘤率均達40%以上，提示迷迭香酸在體內具有較明顯的抗肝癌作用，此結果與Lin等[12]報告的迷迭香酸能夠有效地抑制肝癌細胞增殖的結果相似。而黃芩苷高劑量組瘤重明顯低于模型組(P<0.05)，且抑瘤率達到55.7%，這一結果與黃芩苷具有抑制肝癌細胞增殖和抗腫瘤作用的研究報道一致[13-15]。此外，環(huán)磷酰胺組的瘤重均明顯低于模型組(P<0.05)，提示抗腫瘤效果顯著，但表現(xiàn)出較大的毒副作用，其脾臟及胸腺指數(shù)均明顯低于模型組(P<0.05)，提示對小鼠機體胸腺和脾臟等免疫器官造成的損害較大，可能使小鼠的免疫功能下降。與其相比，迷迭香酸和黃芩苷對小鼠的胸腺、脾臟指數(shù)無較大影響，提示迷迭香酸和黃芩苷在實驗劑量范圍內對機體的正常生長沒有抑制作用。

綜上所述，迷迭香酸和黃芩苷對腫瘤細胞均表現(xiàn)出較明顯的抑制作用，其抗腫瘤作用可能與其抑制腫瘤細胞生長有關，具體的抗腫瘤作用機制有待于進一步的研究。

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In vitro and vivo anti-hepatoma effects of heat-clearing and detoxicificating Chinese medicine monomers

HUChao,CAOWen,XULi-ba,WULing-ling,HUANGYan,FUJing-quan,ZHOUWan-ni,JIANGWei-zhe,JIAOYang

(SchoolofPharmacology,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To explore the inhibitory effects of five heat-clearing and detoxicificating Chinese medicine monomers on the proliferation of human hepatoma SMMC-7721 cells and the implanted tumor of H22 tumor-bearing mice.Methods The human hepatoma SMMC-7721 cells were treated with different concentrations of rosmarinic acid,baicalin,aurantio-obtusin,chlorogenic acid and berberine for 48 hours.The inhibitory rate of cell proliferation was detected by methylthiazolyl tetrazolium assay to screen the Chinese medicine effective monomers.The implanted hepatoma mouse models were established using hepatoma H22 cells.The H22 tumor-bearing mice were treated with different concentrations of rosmarinic acid(300,150 and 75 mg/kg) and baicalin(200,100 and 50 mg/kg) for 10 days.Then the tumor,thymus and spleen were taken out and weighted,and the tumor-inhibitory rates,spleen index and thymus index of the mice were calculated.Results In the rosmarinic acid groups with concentrations of 500 mg/L,250 mg/L and 125 mg/L,and baicalin groups with concentrations of 500 mg/L and 250 mg/L,Avalues were significantly lower than those in the control group(P<0.05),and the inhibitory rates of cell proliferation were more than 30%.The inhibitory rates of cell proliferation were less than 30% in the aurantio-obtusin and berberine groups,and the rate was less than zero in the chlorogenic acid group.The tumor weights in the rosmarinic acid groups with different doses were less than those in the model group(P<0.05).And the inhibitory rates in the rosmarinic acid groups with different doses on H22 implanted tumor were 48.2%,43.0% and 39.0%,respectively.No significant differences in the thymus index or spleen index were observed between rosmarinic acid groups with different doses and model group(P>0.05).In the baicalin group with the dose of 300 mg/kg,the tumor weight was less than that in the model group(P<0.05),and the tumor-inhibitory rate reached 55.7%.No significant differences in the spleen index or thymus index were observed between baicalin acid groups with different doses and model group(P<0.05).Conclusion Rosmarinic acid and baicalin have markedly inhibitory effects on hepatoma SMMC-7721 cell in vitro and H22 implanted tumor in vivo.

Liver cancer,Rosmarinic acid,Baicalin,In vitro,In vivo,Tumor-inhibitory rate

廣西教育廳校地校企共建科技創(chuàng)新平臺項目(桂教科研2013-8號-3)

胡超(1990～)，男，在讀碩士研究生，研究方向：新藥研究開發(fā)。

蔣偉哲(1968～)，男，博士，教授，研究方向：新藥研究開發(fā)，E-mail：jiangweizhe6812@163.com。

通信作者：焦楊(1969～)，女，博士，副教授，研究方向：生化藥理學，E-mail：jiaoyanggx@163.com。

R 735.7

A

0253-4304(2016)01-0085-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.01.26

2015-11-19

2015-12-22)