雷帕霉素對肝臟缺血再灌注中線粒體DNA聚合酶γ的調(diào)控作用

張瑩 余曦

(1.貴州省人民醫(yī)院肝膽外科；2.貴州省人民醫(yī)院急診外科，貴州 貴州 550002)

雷帕霉素對肝臟缺血再灌注中線粒體DNA聚合酶γ的調(diào)控作用

張瑩1余曦2

(1.貴州省人民醫(yī)院肝膽外科；2.貴州省人民醫(yī)院急診外科，貴州 貴州 550002)

目的 研究大鼠肝缺血再灌注損傷中mtDNA聚合酶γ的表達情況，以及雷帕霉素對其的調(diào)控作用。方法 SD大鼠60只，制作大鼠肝臟缺血再灌注模型，分四組:A組：肝臟缺血30 min無干預(yù)組；B組：缺血50 min無干預(yù)組；C組：缺血50 min雷帕霉素干預(yù)組；D組：假手術(shù)組。分別于術(shù)后24 h、第3天、第5天處死各組大鼠，取肝組織進行病理檢測；采用RT-PCR檢測mtDNA聚合酶γ mRNA的表達。結(jié)果 C組肝組織病理損害和mtDNA聚合酶γ mRNA表達明顯低于B組(P<0.01)，術(shù)后A組、B組mtDNA聚合酶γ mRNA的表達逐漸降低，C組則一直維持在同一水平。結(jié)論 雷帕霉素能夠減輕肝臟缺血再灌注損傷，抑制HIRI中mtDNA聚合酶γ mRNA的過度表達，從而對肝臟缺血再灌注損傷起保護作用。

大鼠； 肝臟； 缺血再灌注損傷； 線粒體DNA聚合酶γ； 雷帕霉素

肝臟缺血再灌注損傷(hepatic ischemia-reperfusion injur,HIRI)是臨床上肝臟外科常見的病理生理過程，如何減輕HIRI對肝細胞的損傷，保護肝功能，防止肝衰竭一直是國內(nèi)外研究者十分關(guān)注的課題[1]?，F(xiàn)有研究[2]已表明，HIRI過程中存在mtDNA損傷，在線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)損傷修復(fù)機制中，線粒體DNA聚合酶γ(mitochondrial DNA polymerase γ，mtDNA pol γ)是位于線粒體內(nèi)唯一的DNA聚合酶，對mtDNA的復(fù)制、合成、修復(fù)有著重要作用。我們通過建立大鼠HIRI模型，并給予雷帕霉素干預(yù)，了解在肝臟缺血再灌注中修復(fù)肝臟損傷時mtDNA pol γ的表達情況，并探討雷帕霉素對HIRI中mtDNA polγ的調(diào)控作用 。

1 材料與方法

1.1 材料 由第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供SPF級雄性SD大鼠(n=60)，體質(zhì)量200～250g，術(shù)前12 h禁食，自由飲水。以滅菌藥用蓖麻油配制濃度為0.345 mg/mL的雷帕霉素溶液用于灌胃?？俁NA提取及cDNA合成試劑盒由北京天根生物有限公司提供。

1.2 實驗動物與制模 60只動物隨機分為四組，乙醚氣體麻醉，無菌條件下參照Pringle’s[3]法制作大鼠肝臟缺血再灌注模型,切開腹壁后找到第一肝門，以血管夾夾閉，以肝臟表面出現(xiàn)瘀斑為缺血成功表現(xiàn)。A組(18只)：肝臟缺血30 min恢復(fù)血供；B組(18只)：肝臟缺血50 min恢復(fù)血供；C組(18只)：肝臟缺血50 min恢復(fù)血供；D組(6只)：假手術(shù)對照組：僅翻動肝臟隨即關(guān)腹。其中C組在術(shù)前3 d和術(shù)后每日用雷帕霉素[1.5 mg/(kg·d)]灌胃，而A組和B組在術(shù)前3 d和術(shù)后每日僅用滅菌藥用蓖麻油1 mL灌胃一次。各組大鼠于術(shù)后24 h、第3天、第5天三個時間點分別處死1/3。

1.3 各組大鼠mtDNA pol γ mRNA的表達 采用RT-PCR方法：提取各組大鼠肝組織總RNA并合成cDNA。mtDNA pol γ mRNA引物設(shè)計：F∶5’-TCAAGGAAGTCACGATGG-3’；R∶5’-AGGCACTGGTCAATGTCTAC-3’，擴增長度480 bp；由上海生工提供內(nèi)參β-actin引物：擴增長度165 bp。PCR反應(yīng)體：dd H2O 10 μL Mix(含Mg2+)13μL 上、下游引物(0.5 μg/μL)各1 μL ，cDNA 1 μL， 94℃ 3 min；94℃ 30sec， 55℃ 30sec， 72℃ 1 min， 30個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃終止。制備2%瓊脂凝膠，點樣， 120V電泳，40 min后置凝膠成像儀下成像。用Quantity One 4.6.2軟件測定各泳道條帶面積光密度值(OD)，其mRNA相對表達量=目的條帶與其相應(yīng)β-actin的面積光密度比值；用SPSS19.0行單因素方差分析。

1.4 肝臟組織病理學(xué)檢查 在大鼠處死后快速取部分肝葉修剪為15 mm×15 mm×3 mm大小，于10%中性福爾馬林溶液中固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色，400倍光鏡下觀察、拍照。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠術(shù)后肝組織中mtDNA pol γ mRNA

的表達情況 mtDNA pol γ mRNA及β-actin PCR產(chǎn)物分別于480bp和165bp處顯示出清晰單一的條帶(圖1)，各組大鼠mtDNA pol γ mRNA相對表達量經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，術(shù)后24h及術(shù)后第3天，A組、B組和C組mtDNA pol γ mRNA表達量均有所升高，其中以B組升高最為顯著(P<0.01)，至術(shù)后第5天 A組、B組mtDNA pol γ mRNA表達量較術(shù)后第3天時明顯降低(P<0.01，P<0.05)，而C組與同組內(nèi)前一時間點比較均無明顯差異(P>0.05)。

注：M.marker.1～4：分別為術(shù)后第5天A、B、C、D 4組條帶；5～8：分別為術(shù)后第3天A、B、C、D 4組條帶；9～12：分別為術(shù)后第1天A、B、C、D 4組條帶。圖1 RT-PCR mtDNA pol γ mRNA表達凝膠成像圖

組別術(shù)后時間24h3d5dA組3．16±0．19c2．91±0．09c1．98±0．08acB組3．80±0．143．37±0．103．02±0．15bC組2．43±0．14c2．39±0．17c2．36±0．21dD組1．66±0．071．51±0．071．82±0．10

注：與組內(nèi)前一時間點比較，aP<0.01,bP<0.03;與B組比較，cP<0.01,aP<0.05。

2.2 各組大鼠術(shù)后肝臟組織病理變化 各組大鼠肝臟組織HE染色病理切片可見：A組大鼠術(shù)后24小時可見肝細胞水腫變性，并可見少許空泡樣變，少量炎性細胞浸潤，未見壞死細胞，細胞結(jié)構(gòu)完整，(圖2A)；而同一時間點B組切片可見大面積的細胞壞死，細胞形態(tài)亦消失，匯管區(qū)有較多的炎性細胞浸潤(圖2B)；C組大鼠術(shù)后24 h在靠近匯管區(qū)部分肝細胞可見多發(fā)性壞死(圖2C)，但肝細胞索尚存在，與B組比較明顯減輕；D組肝細胞結(jié)構(gòu)未見明顯異常。

圖2 術(shù)后24 h、A、B、C組大鼠肝臟組織病理變化(HE×400)

3 討 論

現(xiàn)有研究[4]表明，組織和細胞的缺血、缺氧會引起線粒體氧化磷酸化過程中的各種載體和呼吸酶的損傷，導(dǎo)致細胞內(nèi)能量代謝障礙，所產(chǎn)生的過高的氧自由基可對mtDNA帶來損害，包括點突變、缺失和插入。研究[5]顯示，腦組織缺氧時組織中mtDNA片段缺失率升高。機體對DNA損傷的修復(fù)有多條途徑，而線粒體內(nèi)，mtDNA pol γ是唯一的DNA修復(fù)酶[6]，在mtDNA修復(fù)過程中，損傷堿基位點的5’磷酸二脂鍵由核酸內(nèi)切酶切割，形成游離的DNA片段，由mtDNA pol γ來填補缺失的堿基空隙，再由DNA連接酶閉合缺口，從而完成DNA的修復(fù)[2]。氧化損傷等原因可引起mtDNA pol γ結(jié)構(gòu)、功能的改變，從而影響mtDNA的復(fù)制[7]

本研究中我們發(fā)現(xiàn)，在再灌注后24 h各組大鼠mtDNA polγmRNA表達升高，其表達強度與肝臟病理損傷程度呈正相關(guān)，表明mtDNA pol γ在mtDNA受損早期就已經(jīng)啟動修復(fù)，mtDNA pol γ mRNA表達水平及病理損害程度也隨著時間延長而逐漸下降。實驗中我們還發(fā)現(xiàn)，B組大鼠術(shù)后24 h mtDNA pol γ mRNA雖然較其它組的表達量明顯增高，但病理損害卻較重，原因可能是因細胞能量代謝障礙導(dǎo)致其存在較高濃度的氧自由基，影響mtDNA pol γ的活性；另外研究[8]還顯示，若mtDNA修復(fù)酶表達過高反而會引起惡性病理改變，所以本實驗中，我們推測B組大鼠由于其mtDNA pol γ的表達過度升高，影響mtDNA修復(fù)系統(tǒng)的動態(tài)平衡，從而導(dǎo)致mtDNA進一步的損傷，同時肝臟病理損害重這一現(xiàn)象。

雷帕霉素目前作為免疫抑制劑廣泛應(yīng)用于臨床，其可抑制淋巴細胞的增殖[9]，并且對線粒體的損傷具有保護作用[10]，Y.Dai等[11]發(fā)現(xiàn)雷帕霉素可用于治療mtDNA突變的相關(guān)疾病，但在缺血再灌注損傷中是否存在保護機制尚有爭論。

本研究中，雷帕霉素干預(yù)組肝臟的病理損傷程度明顯較輕，表明雷帕霉素能夠減輕HIRI損傷。A組、B組及C組術(shù)后mtDNA pol γ mRNA表達量較對照組均升高，表明在HIRI后，mtDNA的損傷可直接調(diào)控mtDNA pol γ的表達，從而修復(fù)受損的mtDNA，而C組始終較B組表達量低，說明雷帕霉素可降低HIRI后mtDNA pol γ mRNA的過度表達，避免產(chǎn)生更嚴(yán)重的病理損害，促進受損mtDNA的修復(fù)，維持線粒體的正常功能，減輕HIR的損傷。

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Regulation & control roles of rapamycin to mitochondrial DNA polymerase γ in hepatic ischemia reperfusion

ZhangYing1,YuXi2.

1.DepartmentofHepatobiliarySurgery; 2.DepartmentofEmergencySurgery,GuizhouProvincialPeople'sHospital,Guiyang,550002,China.

Objective To investigate the regulation & control effects of rapamycin on mitochondrial DNA polymerase γ in hepatic ischemia-reperfusion injury in rats. Methods 60 SD rats were divided into 4 groups for the preparation of whole liver ischemia-reperfusion injury rats model: group A (30min hepatic ischemia without any intervention), group B(50min hepatic ischemia without any intervention), group C (50min hepatic ischemia with preoperative rapamycin lavage), and group D (control group). The execution of rats in each group was done 24h, 3d, and 5d respectively after the operation,then pathological examination of partial liver tissues was performed and RT-PCR was used to detect liver mitochondria DNA polymerase γ mRNA in the specimen. Results The pathological injury of liver tissue and mitochondrial DNA polymerase γ mRNA in group C was evidently lower than that in group B (P< 0.01). After the operation, mitochondrial DNA polymerase γ mRNA decreased gradually in group A and group B and maintained at the same level in group C. Conclusion Rapamycin can alleviate liver ischemia-reperfusion injury, inhibit the excessive expression of mitochondrial DNA polymerase γ mRNA in HIRI, and protect oxidative damage

Rats； Liver； Ischemia-reperfusion injury； Mitochondrial DNA polymerase γ； Rapamycin

貴州省科技廳專項基金[黔科合J(2008)-2302]；貴州省優(yōu)秀青年科技人才基金[黔科合人字(2011)29]

R-332，R575

A

1000-744X(2016)01-0013-03

2015-10-17)