全自動固相萃取液質(zhì)聯(lián)用法測定動物源性食品中鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留

朱群英,索莉莉,朱玉玲,李 良

(南昌市疾病預(yù)防控制中心,江南南昌 330038)

朱群英,索莉莉,朱玉玲,李 良

(南昌市疾病預(yù)防控制中心,江南南昌 330038)

建立全自動固相萃取-液質(zhì)聯(lián)用同位素內(nèi)標法測定動物源性食品中13種鎮(zhèn)靜劑的方法。樣品中添加同位素內(nèi)標地西泮-d5和氯丙嗪-d6,經(jīng)乙腈提取,全自動固相萃取儀凈化,Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)不銹鋼色譜柱分離,三重四級桿質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測方式檢測,同位素內(nèi)標法定量。13種鎮(zhèn)靜劑在線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)r≥0.999,檢出限在0.030～0.113 μg/kg之間,加標回收率在88.5%～115.0%之間,相對標準偏差在2.45%～7.34%之間。該方法樣品前處理簡單,凈化過程實現(xiàn)了自動化操作,大大提高了工作效率;該方法靈敏度高、回收率好,適用于動物源性食品中多種鎮(zhèn)靜劑的同時檢測。

全自動固相萃取,液質(zhì)聯(lián)用,動物源性食品,鎮(zhèn)靜劑

鎮(zhèn)靜劑(sedative)是指能使中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生輕度抑制,減弱機能活動,從而起到消除躁動不安、恢復(fù)安靜的一類藥物。近年來,個別畜牧業(yè)飼養(yǎng)者因經(jīng)濟利益的驅(qū)使,擅自在畜禽飼養(yǎng)過程中添加鎮(zhèn)靜劑類藥物以起到鎮(zhèn)靜催眠、增重催肥、縮短出欄時間的作用;另外,在動物運輸過程中,為減少動物死亡和體重下降,防止肉品質(zhì)降低,也常使用鎮(zhèn)靜劑類藥物以減少應(yīng)激帶來的損失。非法使用此類藥物會使其原形和代謝產(chǎn)物不可避免地殘留于動物源食品中,人們食用了這些食品后會對人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)等造成不良影響,因此許多國家都將此類藥物列為禁用藥物。

目前,國內(nèi)外報道的鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留檢測的儀器方法主要有液相色譜法(LC)[1-2]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[3-4]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)[5-14]等。其中LC法靈敏度較低,無法滿足對禁用藥物檢測的要求。GC-MS有較好的靈敏度,但部分藥物的前處理需衍生化費時較長。LC-MS/MS作為目前報道較多的方法,可以進行多殘留定性定量檢測。由于動物源性樣品基質(zhì)復(fù)雜,為不干擾檢測,提取后的樣品需采用固相萃取(SPE)[1-6,13]、液一液萃取(LLE)[8,10]、分散固相萃取(QuEChERS)[14]等方法對樣品進行凈化,這些前處理方法不能自動化操作,不利于大批量樣品的快速檢測。全自動固相萃取法可自動完成活化、加樣、洗脫、收集等全過程,可以節(jié)省時間、減少交叉污染、重現(xiàn)性好。本研究采用全自動固相萃取與超高效液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同時檢測動物源性食品中的苯二氮卓類和吩噻嗪類藥物殘留。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇、甲酸 為LCMS級;乙腈 為色譜純;三氯乙酸、氨水 為分析純;超純水;標準物質(zhì):硝西泮(Nitrazepam)、氯硝西泮(Clonazepan)、地西泮(Diazepam)、氟硝西泮(Flunitrazepam)、奧沙西泮(Oxazepam)、勞拉西泮(Lorazepam)、阿普唑侖(Alprazolam)、替馬西泮(Temazepam)等8種苯二氮卓類混合標準溶液,濃度為250μg/mL,地西泮-d5(Diazepam-d5)內(nèi)標,濃度為1.0 mg/Ml 以上標準購于SIGMA-ALDRICH;異丙嗪(Promethazine hydrochloride)、甲苯噻嗪(Xylazine hydrochloride)、乙酰丙嗪(Acepromazine maleate salt)、丙酰丙嗪(propionylpromazine hydrochloride)、氯丙嗪(chlorpromazine hydrochloride)、氯丙嗪-d6(chlorpromazine-d6)內(nèi)標,純度>98% 購于Dr.Ehrenstorfer公司。

超高效液相色譜儀LC-30A與三重四級桿質(zhì)譜儀LCMS-8040聯(lián)用系統(tǒng) 日本島津公司:配置電噴霧離子源(ESI),Peak Scientific氮氣發(fā)生器(NM32L),LC-30A×2輸液泵,DUG-20A5在線脫氣機,SIL-30AC自動進樣器,CTO-30AC柱溫箱,CBM-20A系統(tǒng)控制器,LCMS-8040三重四級桿質(zhì)譜儀,LabSolutions色譜工作站;GX274自動固相萃取儀 美國吉爾森;Milli-Q Direct8 超純水機 默克密理博;5424臺式高速離心機 德國eppendorf;N-EVNP24氮吹儀 美國Organomation。

1.2 實驗方法

1.2.1 液相色譜條件 Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18(2.1×100 mm,1.7 μm)不銹鋼色譜柱;柱溫:40 ℃;進樣體積:5 μL;流速:0.4 mL/min;流動相:A為0.1% 甲酸水,B為甲醇,梯度洗脫程序:0～2 min,30%的B流動相;2～2.2 min,30%～50%,維持4.8 min;7～12 min,50%～80%的B流動相;12～13 min,80%～100%的B流動相;維持3 min;16～17 min,100%～30%的B流動相,維持3 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件 離子源:電噴霧離子源ESI(+);離子源接口電壓:4.5 kV;霧化氣流量:氮氣3.0 L/min;干燥氣流量:15 L/min;碰撞氣:氬氣;脫溶劑管溫度:250 ℃;加熱模塊溫度:400 ℃;掃描模式:多反應(yīng)監(jiān)測MRM;駐留時間:50 ms;延遲時間:1 ms。

1.2.3 全自動固相萃取條件 固相萃取柱:Oasis HLB柱,3 mL;吸樣品速度:3 mL/min;吸溶劑速度:5 mL/min;吸氣泡速度:0.3 mL/min;排樣品速度:2 mL/min;排溶劑速度:5 mL/min;排氣泡速度:0.3 mL/min。

Oasis HLB固相萃取柱依次用5 mL甲醇、5 mL水活化,將樣品提取液5 mL全部通過,依次用5 mL水、3 mL的15%乙腈水淋洗后抽干,5 mL 5%乙酸甲醇洗脫并接收,洗脫液用氮氣吹干后定容待測。

1.2.4 標準溶液的配制 精密稱取異丙嗪、甲苯噻嗪、乙酰丙嗪、丙酰丙嗪、氯丙嗪2.50 mg,用甲醇稀釋定容到10 m L,得到250 μg/mL的噻吩嗪類混合標準儲備溶液。分別取40 μL苯二氮卓類混合標準溶液250 μg/mL和40 μL噻吩嗪類混合標準儲備溶液,用甲醇稀釋定容到10 mL,得到13種鎮(zhèn)靜劑混合標準溶液,濃度為1 μg/mL。再稀釋成0.05 μg/mL的混合標準使用液。

精密稱取氯丙嗪-d6內(nèi)標2.50 mg,用甲醇稀釋定容到10 mL,濃度為 250 μg/mL。分別取250 μg/mL氯丙嗪-d6 40 μL和 1.0 mg/mL地西泮-d5 10 μL,用甲醇稀釋定容到10 mL,得到2種鎮(zhèn)靜劑混合內(nèi)標溶液,濃度為1 μg/mL。再稀釋成0.05 μg/mL的內(nèi)標使用液。

1.2.5 樣品溶液的制備 準確稱取2.00 g(精確到0.01 g)樣品于50 mL離心管中,加入10 mL乙腈,再加入0.05 μg/mL的混合內(nèi)標溶液200 μL,漩渦1 min,超聲提取10 min。以5000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min,取上清液5 mL,在50 ℃下用氮氣吹至近干,用20%氯化鈉溶液定容到5 mL,經(jīng)全自動固相萃取儀凈化洗脫后,洗脫液用氮氣吹干,殘渣用初始流動相溶解,渦旋混合1 min,定容到1 mL,過0.22 μm微孔濾膜,準備上機。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇 實驗比較了兩個不同規(guī)格的色譜柱1:Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)不銹鋼色譜柱,2:Waters ACQUITY UPLCTMHSSC18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)不銹鋼色譜柱,在相同的流動相和流速下,柱1的離子化效率高,且分離效果好,所以選擇柱1為本實驗用的分析柱。

2.1.2 流動相的優(yōu)化 實驗分別采用了0.1%甲酸水和甲醇、0.1%甲酸水和乙腈、0.01 mol/L乙酸銨和甲醇、0.01 mol/L乙酸銨和乙腈等四組流動相,經(jīng)比較用0.1%甲酸水和甲醇為流動相時,各組分離子化效率高,峰型好,干擾少,本實驗采用0.1%甲酸水和甲醇為流動相;由于這13種鎮(zhèn)靜劑的化學(xué)性質(zhì)差異較大,在柱子上的保留不同,實驗采用梯度洗脫。

表1 13種鎮(zhèn)靜劑和2種內(nèi)標物的MRM參數(shù)

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1 母離子的優(yōu)化 苯二氮卓類鎮(zhèn)靜劑藥物屬于中性或弱堿性藥物,噻吩嗪類鎮(zhèn)靜劑藥物也是弱堿性藥物,他們均更適合在ESI源的正離子模式下離子化,產(chǎn)生的母離子為[M+H]+,峰響應(yīng)高。將1 μg/mL的各鎮(zhèn)靜劑標準溶液,在不接色譜柱的情況下進樣1 μL,ESI(+)模式下進行Q3 Scan,確定各鎮(zhèn)靜劑的母離子質(zhì)荷比。

2.2.2 子離子的選擇以及碰撞能的優(yōu)化 在優(yōu)化好的母離子情況下,將1 μg/mL的各鎮(zhèn)靜劑標準溶液,在不接色譜柱的情況下,選取響應(yīng)較高的兩對子離子,同時對Q1 Pre Bias電壓、碰撞能量、Q3 Pre Bias電壓進行優(yōu)化,優(yōu)化好的子離子以響應(yīng)值最高的為定量離子,響應(yīng)其次的為定性離子。MRM參數(shù)見表1,其多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)見圖1。

圖1 13種鎮(zhèn)靜劑標準品及2種同位素內(nèi)標物的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)色譜圖Fig.1 The MRM chromatogram of 13 kinds of sedative standards and 2 kinds of isotope internal standards注:1:甲苯噻嗪;2:硝西泮;3:氯硝西泮;4:氟硝西泮;5:奧沙西泮;6:勞拉西泮;7:阿普唑侖;8:替馬西泮;9:異丙嗪;10:乙酰丙嗪;11:地西泮;12:丙酰丙嗪;13:氯丙嗪;14:地西泮-d5;15:氯丙嗪-d6。

表2 13種鎮(zhèn)靜劑的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量下限

2.3 全自動固相萃取條件的優(yōu)化

2.3.1 固相萃取柱的選擇 對于固相萃取實驗,固相萃取柱的選擇至關(guān)重要,分別采用HLB柱、C18柱和 MCX柱進行實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)C18柱對苯二氮卓類鎮(zhèn)靜劑藥物有較高的回收,但對噻吩嗪類鎮(zhèn)靜劑藥物回收率低;MCX柱對噻吩嗪類鎮(zhèn)靜劑藥物回收率較高,但對苯二氮卓類鎮(zhèn)靜劑藥物回收率低;HLB柱對這兩類13種藥物殘留均有較好的回收率,故選HLB柱為本實驗的固相萃取柱。

2.3.2 全自動固相萃取儀參數(shù)的優(yōu)化 由于樣品溶液粘度較大,吸樣速度過快會產(chǎn)生氣泡,定量不準確,吸樣速度慢又影響工作效率,我們對吸樣速度進行優(yōu)化,結(jié)果表明當(dāng)吸樣速度為3 mL/min時,不會產(chǎn)生氣泡,故選3 mL/min為吸樣速度;同時為了讓樣品能更好的保留在固相萃取柱中,我們對排樣速度進行優(yōu)化,為2 mL/min。其他全自動固相萃取儀參數(shù)參考廠家推薦的參數(shù)進行實驗。

為了減少干擾,需采用盡可能大比例的有機相除雜,但有機相比例過大,被測物也會被洗脫下來。分別采用了3 mL的10%乙腈水、15%乙腈水、20%乙腈水實驗,實驗結(jié)果表明,當(dāng)使用20%乙腈水除雜時,替馬西泮在洗脫液中被檢出,15%乙腈水洗脫液中未發(fā)現(xiàn)分析物,故選用3 mL的15%乙腈水為除雜溶劑。

分別采用2%乙酸甲醇、5%乙酸甲醇為洗脫溶劑洗脫樣品,當(dāng)使用2%乙酸甲醇為洗脫溶劑時,苯二氮卓類化合物回收率高,但吩噻嗪類化合物回收率低,當(dāng)使用2%乙酸甲醇為洗脫溶劑時13種化合物都有較好的回收率,故選用5 mL 5%乙酸甲醇為洗脫溶劑。

2.4 方法學(xué)實驗

2.4.1 標準曲線及方法的檢出限和定量限 用移液器吸取混標溶液和內(nèi)標溶液適量,用甲醇0.1%甲酸水溶液(30∶70,V∶V)配成含各鎮(zhèn)靜劑0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL的標準系列,每份溶液含同位素內(nèi)標5 ng/mL,其中苯二氮卓類以d5-地西泮為內(nèi)標計算,噻吩嗪類以d6-氯丙嗪為內(nèi)標計算,以待測化合物和內(nèi)標的峰面積比值為縱坐標,待測化合物的濃度為橫坐標進行回歸分析,得到線性回歸方程、及相關(guān)系數(shù)(見表2)。

用空白豬瘦肉作為基質(zhì),添加不同量的鎮(zhèn)靜劑標準品,按1.2.5樣品前處理方法進行處理后測定,以S/N=3為檢出限,S/N=10為定量限(見表2)。

由表2可知,采用同位素內(nèi)標法定量,各化合物的線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)r值均大于0.999。

2.4.2 方法的回收率和精密度 稱取豬瘦肉空白樣品,分別加入高中低三個濃度的各鎮(zhèn)靜劑的混合標準溶液,按1.2.5樣品前處理方法進行處理,每個加標水平平行測定6次,計算13種鎮(zhèn)靜劑的回收率和相對標準偏差,結(jié)果見表3。

由表3可知,采用同位素內(nèi)標法計算,13種鎮(zhèn)靜劑回收率在88.5%～115.0%之間。

2.4.3 穩(wěn)定性實驗 準確吸取高、中、低三個濃度的混合標準溶液,在最優(yōu)化的色譜質(zhì)譜條件下每隔1 h進樣一次,連續(xù)6次,各組分峰面積的RSD在0.63%～3.49%之間;每隔5 d進樣一次,連續(xù)6次,各組分峰面積的RSD在2.12%～7.33%之間;由此可知,在一個月內(nèi)各標準溶液具有良好的穩(wěn)定性。

2.4.4 樣品檢測 隨機抽取了市場上的豬瘦肉、豬肝、豬肺、豬血、豬腎、牛肉、羊肉樣品各10份進行檢測,均未檢測出鎮(zhèn)靜劑藥物殘留。分別取每類樣品中的一個進行加標進行基質(zhì)干擾實驗,實驗結(jié)果證明,豬肺基質(zhì)干擾最大,但不影響樣品的檢測。

表3 13種鎮(zhèn)靜劑的回收率和精密度(n=6)

3 結(jié)論

本文采用同位素內(nèi)標液質(zhì)聯(lián)用法同時測定動物源性食品中鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留。采用全自動固相萃取儀對樣品進行凈化,實現(xiàn)樣品前處理的自動化操作,可以提高工作效率。該方法樣品前處理簡單、交叉污染少;在線性范圍內(nèi),有良好的線性相關(guān)性,回收率高,重現(xiàn)性好。三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用多反應(yīng)監(jiān)測模式進行檢測,同位素內(nèi)標法定量,可以實現(xiàn)對組分多殘留的同時檢測。

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Determination of sedative drug residues in animal derived food by automatic SPE combined with ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

ZHU Qun-ying,SUO Li-li,ZHU Yu-ling,LI Liang

(Nanchang Center for Disease Prevetion and Control,Nanchang 330038,China)

A new approach for determination of 13 kinds of sedatives in animal derived food by automatic solid phase extration combined with ultra performance liquid chromatography-tandemmass spectrometry using isotope internal standard was described. The homogenized sample was spiked with diazepam-d5and chlorpromazine-d6,and extracted with acetonitrile,then purified by automatic solid phase extration. After the analytes were separated by Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)column. All sedatives were detected by MS/MS system with eletrospray ion ization(ESI+)under multiple reaction monitoring(MRM)mode and quantified by the isotope internal standard technique. The result indicated that the LOD of 13 kinds of sedatives ranged from 0.030 μg/kg to 0.113 μg/kg. Meanwhile,the high correlation coefficents(r≥0.999)of 13 kinds of sedatives were obtained within their respective linear ranges. The average recoveries at low,intermediate and high spiked levels ranged from 88.5% to 115.0% with relative standard deviations(RSD)of 2.45%～7.34%. The method with simple sample preparation achieved the automated purification process which then improved considerably the work efficiency. This method was suitable for simultaneous determination of multiple sedatives in animal derived food with simple pretreatment,high sensitivity,good recovery.

automatic solid phase extration;LC-MS/MS;animal derived food;sedatives

2016-05-27

朱群英(1980-)，女，碩士，主管技師；研究方向：食品理化檢驗，E-mail：zqy0797@163.com。

南昌市科技局(洪科發(fā)計字【2013】210號第61項)。

TS

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000