葡萄相關酵母多樣性及其菌種鑒定的研究進展

李 婧,羅蘇蘇,張曉旭

(1.錦州醫(yī)科大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121000;2.大連理工大學生物科學與技術學院,遼寧大連 116024)

葡萄相關酵母多樣性及其菌種鑒定的研究進展

李 婧1,2,羅蘇蘇1,+,張曉旭1

(1.錦州醫(yī)科大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121000;2.大連理工大學生物科學與技術學院,遼寧大連 116024)

本文對葡萄相關酵母菌種的種類及其多樣性、酵母菌群在不同環(huán)境和釀造過程中的動態(tài)變化以及傳統(tǒng)和現(xiàn)代菌種鑒定方法的特點等方面進行綜合闡述,為篩選具有地域特征、發(fā)酵性能良好的野生酵母菌種提供了一定的理論依據(jù)。

葡萄相關酵母,菌種鑒定,多樣性

葡萄相關酵母是指廣泛存在于葡萄園土壤、葡萄漿果表面、葡萄酒、酒廠環(huán)境、設備表面以及發(fā)酵罐內部殘留物中的酵母[1]。研究不同產區(qū)中葡萄相關酵母多樣性,有助于酒廠篩選出具有區(qū)域特色性的優(yōu)良原生酵母,賦予葡萄酒復雜、多樣的風味,提高葡萄酒品質等目的。目前,多采用傳統(tǒng)菌株鑒定方法和現(xiàn)代分子分類學法相結合進行菌種鑒定。本文綜述了葡萄相關酵母菌種的種類及其多樣性,酵母菌群在不同環(huán)境和釀造過程中的動態(tài)變化,以及常用菌種鑒定方法的優(yōu)缺點。

1 葡萄相關酵母的種類及作用

葡萄酒釀造過程的本質是酵母菌、乳酸菌、霉菌等微生物代謝活動的過程,使葡萄酒的香氣和風味表現(xiàn)得復雜和多樣[2]。酵母菌是引起葡萄酒發(fā)酵的必備條件[3],在釀造過程中起主導作用,對葡萄酒的香味、酒度、色澤、品質等都有重要影響[4]。迄今為止,發(fā)現(xiàn)與葡萄酒相關的酵母菌共有18個屬,70多個種[5]。在這些相關酵母菌中,釀酒酵母(Saccharomyces)在葡萄酒發(fā)酵過程中起主導作用,它不僅可以通過代謝活動產生多種香氣活性化合物,如醇類、酯類、硫化物、揮發(fā)酸、揮發(fā)酚等,而且還能釋放葡萄中的一些非香型前體物質,產生揮發(fā)性香氣物質[6]。此外,釀酒酵母還可吸附葡萄汁組分[2],如吸附葡萄汁中的花色苷,從而對葡萄酒的外觀品質產生影響[7]。

除了釀酒酵母,還有非釀酒酵母屬(non-Saccharomyces),包括梅氏酵母屬(Metschnikowia)、有孢漢遜酵母屬(Hanseniaspora)、漢生酵母屬(Hansenula)、酒香酵母屬(Brettanomyces)、克勒克酵母屬(Kloeckera)、假絲酵母屬(Candida)、裂殖酵母屬(Schizosacharomyces)、德巴利酵母屬(Debaryomyces)、接合酵母屬(Zygosaccharomyces)等[8]。非釀酒酵母酒精耐受力較差,產醇能力不如釀酒酵母,但是非釀酒酵母比釀酒酵母能產生更多的甘油、琥珀酸、醋酸和酯類。其中,星形假絲酵母(Candidastellata)可以產生大量的甘油、琥珀酸和醋酸,不僅賦予葡萄酒柔和性、圓潤感和粘稠度,而且使葡萄酒具有強烈的蜂蜜、杏、和乙酸乙酯香。檸檬克勒克酵母(Kloeckeraapiculata)也可以產生大量的甘油,同時也可產生大量的酯類,產酯高的酵母還包括有孢漢遜酵母、異常漢遜酵母、畢赤酵母和異常畢赤酵母。酒香酵母既可以產生水果香和咖啡香,也可以產生鼠尿和藥的苦味,其代謝物若少量存在會增加葡萄酒的復雜感,過多則會破壞酒的風味[8]。因此,非釀酒酵母在一定程度上能夠提高葡萄酒結構、香氣和風味的復雜性。

產生高級醇、酯、有機酸、揮發(fā)性酚類的非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵不僅可以改善葡萄酒的風味、賦予葡萄酒復雜多樣的香氣與多層次的結構,而且在發(fā)酵后一起耗盡酒中的主要營養(yǎng)成分和生長因子,在一定程度上防止了進一步污染[9]。

2 葡萄相關酵母的多樣性

2.1 不同來源釀酒葡萄相關酵母多樣性

目前,從葡萄漿果表面分離出的酵母菌主要有隱球酵母屬(Cryptococcus)和畢赤酵母屬(Pichia)。盧君[10]對沙城產區(qū)龍眼葡萄進行了研究,從成熟的葡萄漿果表面分離出了假絲酵母、隱球酵母、紅酵母(Rhodutorula)和少量的類似酵母菌的出芽短梗霉,還分離出了畢赤酵母和克勒克酵母。Cédric Grangeteau等[11]人對法國勃艮第地區(qū)霞多麗葡萄種植區(qū)進行了研究,從葡萄漿果上面分離出8個屬140種酵母,主要為隱球酵母,還有少量畢赤酵母和絲孢酵母屬(Trichosporon),釀酒酵母很稀少。研究表明,葡萄漿果上面的酵母組成由很多因素決定,與葡萄園的地理位置、土壤的種類、葡萄品種等有關,一些酵母能非常適宜特定的氣候條件,在一年又一年的自然選擇中逐漸成為該葡萄園的優(yōu)勢菌種[12]。土壤種類、葡萄品種和產地對酵母菌的具體影響還需進一步研究。

葡萄汁中的酵母種類與漿果表皮不一樣,從葡萄汁中分離出的酵母菌主要屬于有孢漢遜酵母屬和梅氏酵母屬。Martin Seidel[13]對德國兩個葡萄酒產區(qū)酵母菌多樣性進行了研究,結果表明從葡萄汁中分離出的酵母菌株主要屬于有孢漢遜酵母和梅氏酵母。Cédric Grangeteau等[11]人從葡萄汁里面分離出來4個屬的酵母,主要為有孢漢遜酵母、梅氏酵母和畢赤酵母,8%為釀酒酵母。葡萄汁中的酵母種類與漿果表面的酵母種類有很大差異,漿果表面富含的隱球酵母并未在葡萄汁中分離出,說明隱球酵母不能在葡萄汁中存活,可能因為有孢漢遜酵母和梅氏酵母抑制其生長,也可能因為它不能適應葡萄汁的pH,這需要進一步研究。

從釀酒設備上面也能分離出酵母菌,主要屬于有孢漢遜酵母屬。徐艷文等[14]人對甘肅莫高葡萄酒廠釀酒設備表面的酵母菌進行了研究,分離出的酵母菌主要屬于有孢漢遜酵母屬和紅酵母屬。Cédric Grangeteau等[11]人對法國勃艮第地區(qū)霞多麗葡萄種植區(qū)進行了研究,從釀酒設備上共分離出了7個屬的酵母,主要為有孢漢遜酵母和隱球酵母。從釀酒設備上面分離出的酵母都可以從葡萄漿果表面和葡萄汁中分離,這說明釀酒設備上面的酵母來源于葡萄漿果表面和葡萄汁。

2.2 不同發(fā)酵時期酵母菌種群的變化

發(fā)酵前期,非釀酒酵母占據(jù)主導地位,主要為梅氏酵母、有孢漢遜酵母、假絲酵母和畢赤酵母,釀酒酵母極少。郭晶晶等[15]人對楊凌赤霞珠葡萄自然發(fā)酵酵母菌的動態(tài)變化進行了研究,從發(fā)酵前期的葡萄汁中分離出的酵母菌,以有孢漢遜酵母和梅氏酵母為主,還有少量的畢赤克魯維酵母(Pichiakluyvori)和釀酒酵母。Cecile Miot-Sertier等[16]人對波爾多地區(qū)葡萄酒釀造初始階段中非釀酒酵母的動態(tài)與多樣性進行了研究,葡萄酒發(fā)酵前4 d中都是非釀酒酵母居于主導地位,第5 d釀酒酵母才開始增長,發(fā)酵前期以有孢漢遜酵母和梅氏酵母為主,假絲酵母、畢赤酵母、克魯維酵母和伊薩酵母(Issatchenkia)也大量存在,而釀酒酵母極少。Cédric Grangeteau等[11]人對法國勃艮第地區(qū)霞多麗葡萄種植區(qū)進行了研究,從發(fā)酵初期的葡萄汁中分離出的酵母,主要為梅氏酵母和有孢漢遜酵母,少量的畢赤酵母,釀酒酵母只占8%;在發(fā)酵初始階段,有孢漢遜酵母數(shù)量逐漸增加,但當酒精含量快達到5.1%時,其數(shù)量減少,菌株比例很低。隨著發(fā)酵的進行,酒精耐受力更強的釀酒酵母大量增加并且?guī)缀跸拗屏怂械姆轻劸平湍傅纳L與活性[17]。發(fā)酵前期分離出的釀酒酵母極少,非釀酒酵母大量存在,酒精發(fā)酵可能是由非釀酒酵母啟動,這還需進一步研究確定。

發(fā)酵中期,釀酒酵母占據(jù)主導地位,非釀酒酵母少量存在,如有孢漢遜酵母、梅氏酵母和克魯維酵母。郭晶晶等[15]人對楊凌赤霞珠葡萄自然發(fā)酵酵母菌的動態(tài)變化進行了研究,從發(fā)酵中期的葡萄汁中分離出了釀酒酵母、有孢漢遜酵母、美極梅氏酵母、東方伊薩酵母和佛羅倫薩接合酵母,分別占該時期篩選酵母的81.86%、16.27%、0.93%、0.47%、0.47%。宋育陽等[18]人對寧夏御馬葡萄酒廠的神索葡萄自然發(fā)酵酵母菌群進行了研究,從發(fā)酵中期分離出來釀酒酵母和有孢漢遜酵母,分別占該時期的96.1%和3.9%。Cédric Grangeteau等[11]人從發(fā)酵中期的葡萄酒中分離出了釀酒酵母和克魯維酵母,而克魯維酵母占比低于9%。發(fā)酵中期,葡萄酒的酒精濃度上升,大部分非釀酒酵母已經不能存活了,而有孢漢遜酵母、梅氏酵母和克魯維酵母仍可分離出,說明它們的酒精耐受力比較好。

在發(fā)酵后期,只能分離出釀酒酵母[7,15,18]。此時,酒精濃度高,只有酒精耐受力好的釀酒酵母存活下來,其他的非釀酒酵母沒有分離出,這可能是因為非釀酒酵母都不能在此時的酒精濃度條件下存活,也可能是釀酒酵母完全抑制了非釀酒酵母的生長,這需要對發(fā)酵中期分離出的非釀酒酵母進行酒精耐受力實驗,進而確定。

3 酵母菌株的鑒定方法

3.1 傳統(tǒng)菌株鑒定方法

傳統(tǒng)的酵母菌分類方法主要建立在常規(guī)分類基礎上,根據(jù)表型性狀來鑒定;研究表明酵母菌的某些表型性狀穩(wěn)定性差,在長期保藏菌株或經多次轉接后某些性狀會有所改變[7]。而且,經過形態(tài)觀察和生理生化實驗,還需要再查索引表來確定所測菌株的種屬,這需要大量的重復性實驗,操作繁瑣、工作量大、周期較長。不僅如此,只要實驗條件稍有變化,就會影響實驗的重現(xiàn)性,大多數(shù)菌株的形態(tài)特征簡單,但其種類很多、分類較廣,所以難以精確判定[19]。

3.2 現(xiàn)代分子分類鑒定法

傳統(tǒng)的釀酒葡萄相關酵母的研究主要采用常規(guī)的培養(yǎng)方法,通過表型和生理生化特征來鑒定酵母菌的種類,但是一些酵母菌是不可培養(yǎng)的,因此,常規(guī)培養(yǎng)方法缺乏對酵母菌的系統(tǒng)和全面的研究。而現(xiàn)代分子技術不需要對樣品中微生物進行分離培養(yǎng),能夠快速檢測大量的不能培養(yǎng)的微生物且工作量小、重現(xiàn)性高[20]。近年來,隨著分子生物學的發(fā)展而產生了很多鑒定酵母菌的新方法,其中,主要有:宏基因組學[20]、高通量測序技術[21-22]、26S rDNA D1/D2 區(qū)序列分析[7,11,23-27]、5.8S-ITS rDNA區(qū)域序列分析[7,10,24,28-30]、26S rDNA-RFLP分析[31]、Interdelta指紋圖譜分析[32-35]、傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)[11,32]、變性梯度凝膠電泳(DGGE)[22,36]等。

隨著現(xiàn)代核酸自動化擴增技術的發(fā)展,DNA序列分析廣泛應用于葡萄酒相關酵母菌的鑒定。研究表明,26S rDNA D1/D2區(qū)域具有比較高的變異性,不同種的菌株26S rDNA D1/D2區(qū)核苷酸替換率很大,而同種內不同菌株之間核苷酸替換率一般不會超過1%,所以,26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析能夠鑒定到種級水平[7,26-27]。轉錄間區(qū)(ITS區(qū))也具有較高的變異性,可以用于親緣關系比較近的菌株之間的分析,5.8S-ITS rDNA區(qū)域序列分析法鑒定葡萄相關酵母的快速準確性已被驗證[7,24]。目前,大多數(shù)酵母菌的26S rDNA的D1/D2區(qū)、5.8S rDNA和ITS的序列已經被提交在國際核酸序列數(shù)據(jù)庫中,通過對特定基因區(qū)域的查找和序列比對能夠準確地對葡萄相關酵母進行分類鑒定。26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析與5.8S-ITS rDNA區(qū)域序列分析為目前最常用的DNA序列分析法。但針對個別酵母菌種使用這兩種方法之一仍不能確定到種,需要另一種方法來進一步確定。這兩種方法與RFLP技術相結合則會更加簡便,而且可將絕大部分非釀酒酵母的菌株區(qū)分開來[7,31]。

Interdella序列在釀酒酵母中分布廣泛,Interdelta指紋圖譜分析方法能準確地將釀酒酵母菌株區(qū)分至亞種水平,該方法具有簡單快速、操作容易、擴增條帶圖譜穩(wěn)定等優(yōu)點[32,34]。黃英子等[33]人對甘肅地區(qū)美樂冰紅自然和接種發(fā)酵分離出的343株釀酒酵母進行了Interdelta指紋圖譜分析,區(qū)分為7個亞種;對甘肅地區(qū)貴人香冰白自然和接種發(fā)酵分離出的625株釀酒酵母進行了Interdelta指紋圖譜分析,區(qū)分為18亞種;通過聚類分析可以確定不同亞種釀酒酵母之間的親緣關系,使其分類更接近于自然分類系統(tǒng)。趙晶晶等[34]人對沙城產區(qū)龍眼葡萄相關酵母菌進行研究,利用Interdelta指紋圖譜分析技術將分離得到的54株釀酒酵母區(qū)分為4個亞種。R Romaniello等[35]人對來自意大利英雄葡萄種植區(qū)(heroic vine-growing area)自然發(fā)酵葡萄酒中的釀酒酵母菌進行了研究,利用Interdelta指紋圖譜分析技術將分離得到的39株釀酒酵母區(qū)分為4個亞種。

與DNA指紋圖譜技術相比,宏基因組學技術可以獲得研究樣品中所有微生物的全基因組序列信息,借助高通量測序技術可以發(fā)現(xiàn)大量不可培養(yǎng)的微生物,有助于了解微生物菌落結構[20]。高通量測序技術可直接準確分析出樣品微生物組成,不需要進行分離、純化及培養(yǎng)[21]。而且它還具有分析樣品量多、單個樣品序列通量高的優(yōu)點,主要應用于土壤微生物研究中[22]。

目前,DNA序列分析法是葡萄相關酵母現(xiàn)代分子鑒定方法中應用最廣的,而對于釀酒酵母則會進一步進行Interdelta指紋圖譜分析。通過宏基因組學技術,可以獲取樣品中所有酵母菌的基因組序列信息。高通量測序技術不僅可用于葡萄園土壤中酵母菌結構組成的研究,也可分析葡萄酒中微生物的構成。

4 展望

國外不同葡萄酒產區(qū)都利用自己獨有的酵母菌進行釀造,具有鮮明的特色性,而國內的葡萄酒廠多購買進口商業(yè)酵母進行釀造,缺乏自己的特色。隨著科學技術的不斷進步,研究手段更加先進,能更好地了解不同地區(qū)的酵母多樣性,從而為篩選不同地域的優(yōu)良野生酵母做好準備。

對篩選出來的酵母菌我們可以進一步分析其代謝產物對葡萄酒香氣、風味的影響,以及它的釀造性能。進一步篩選出釀造性能良好且有利于形成良好香氣和風味的優(yōu)良野生酵母菌,然后進行葡萄酒釀造實驗?？山臃N單一野生酵母或者幾株野生酵母,也可接種野生酵母和商業(yè)酵母一起釀造,最終確定最佳方案投入生產。這不僅有利于我國不同地區(qū)生產特色風格的葡萄酒,還能提高產品的品質,增強我國葡萄酒在世界的競爭力。

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Research progress on diversity and identification of grape-related yeast species

LI Jing1,2,LUO Su-su1,+,ZHANG Xiao-xu1

(1.College of Food Science and Engineering,Jinzhou Medical University,Jinzhou121000,China;2.College of Biological Science and Technology,Dalian University of Technology,Dalian116024,China)

In this paper,grape-related yeast species and diversity,dynamic change of yeast in different environment and brewing process,characteristics of traditional and modern for identification of strains were comprehensively reviewed.It provide certain theoretical basis for the selection of wild yeast strains with regional characterisrics and good fermentation performance.

grape-related yeast;strain identification;diversity

2016-04-14 +同為第一作者。

李婧(1980-)，女，博士研究生，副教授，研究方向：食品微生物與發(fā)酵，E-mail:lijing80@mail.dlut.edu.cn。 羅蘇蘇(1995-)，女，大學本科，研究方向：食品科學，E-mail:losusu36@163.com。

遼寧省大學生創(chuàng)新項目。

TS261.1

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000