雨生紅球藻源蝦青素對糖尿病小鼠的降糖作用及其機制

李勇超,賀青華,劉瑞雪,張 波,楊宗鑫,周 敏

(北京聯(lián)合大學功能食品科學技術(shù)研究院,北京聯(lián)合大學應(yīng)用文理學院,北京 100191)

雨生紅球藻源蝦青素對糖尿病小鼠的降糖作用及其機制

李勇超,賀青華,劉瑞雪,張 波*,楊宗鑫,周 敏

(北京聯(lián)合大學功能食品科學技術(shù)研究院,北京聯(lián)合大學應(yīng)用文理學院,北京 100191)

通過尾靜脈注射四氧嘧啶(45～50 mg/kg BW iv)建立小鼠高血糖模型,研究雨生紅球藻源蝦青素(astaxanthin,ASX)對四氧嘧啶高血糖小鼠血糖的調(diào)節(jié)作用。分別以雨生紅球藻源蝦青素粉(蝦青素含量為2%)25、100 mg/kg連續(xù)灌胃高血糖小鼠14 d,在末次灌胃后摘眼球取血測定血糖、胰島素、SOD、GSH-Px的活性和MDA水平;肝、腎組織稱重并測定SOD、GSH-Px的活性和MDA水平。結(jié)果表明,雨生紅球藻源蝦青素可緩解高血糖模型小鼠體重降低的趨勢,減少飲水量和攝食量;雨生紅球藻源蝦青素可顯著降低四氧嘧啶高血糖小鼠的血糖值(p<0.05)以及極顯著提高血清中胰島素的含量(p<0.01),增強了血清中的SOD(p<0.01)和GSH-Px(p<0.01)的活性,抑制了腎臟和肝臟中的MDA水平。結(jié)果表明,提高血清和肝腎組織的抗氧化能力,增加機體內(nèi)的胰島素水平可能是雨生紅球藻源蝦青素降血糖的機制之一。

雨生紅球藻,蝦青素,血糖,糖尿病,小鼠

糖尿病(diabetes mellitus,DM),是由遺傳因素和環(huán)境因素相互作用而引起的體內(nèi)胰島功能性障礙從而導致胰島素分泌不足和糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、維生素、水、電解質(zhì)的代謝紊亂,以及氧化平衡破壞的一種全身慢性終身性疾病,臨床上表現(xiàn)的主要特征為高血糖[1]。目前在世界范圍內(nèi),糖尿病患病率、發(fā)病率和糖尿病患者數(shù)量急劇上升,且有研究表明[2-3],糖尿病出現(xiàn)糖、脂和蛋白多種物質(zhì)的代謝紊亂,常伴有各種氧化應(yīng)激、炎癥、細胞凋亡和器官受損的現(xiàn)象,嚴重危害人類的生命與健康,其發(fā)病的原因尚未明確,發(fā)病機理復(fù)雜,尚無根治藥物[1-4]。其在臨床上的治療主要以藥物控制機體血糖的升高,減輕糖尿病的癥狀,從而降低糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生率。但是藥物治療會有一定的毒副作用,且會使患者對藥物產(chǎn)生依懶性,會嚴重影響糖尿病患者的生活質(zhì)量。因此有許多研究者把目光轉(zhuǎn)向了具有降糖作用的天然活性物質(zhì),以期通過飲食調(diào)理來控制血糖,防止并發(fā)癥的發(fā)生[5-6]。

蝦青素(Astaxanthin,ASX)全稱為3,3′-二羥基-β胡蘿卜素-4,4′-酮,是一種紅色的類胡蘿卜素及天然的脂溶性色素,廣泛地分布在海洋的細菌、藻類、甲殼類和魚類中等,其中雨生紅球藻中蝦青素的含量高達1.5%～3%,被公認為自然界中生產(chǎn)天然蝦青素最好的原料之一[5-6]。近年來國內(nèi)外對蝦青素做了大量的研究,現(xiàn)有結(jié)果表明,天然蝦青素是迄今為止發(fā)現(xiàn)的自然界最強的天然抗氧化劑之一,它能發(fā)揮強大的抗氧化作用,增強細胞的再生能力,維持機體的平衡和減少衰老細胞的堆積,在抗炎、抗癌、預(yù)防心血管疾病、增強機體的免疫、保護神經(jīng)系統(tǒng)有著重要的作用[9-13]。本文主要研究雨生紅球藻源蝦青素對糖尿病小鼠的血糖控制作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆明小鼠 許可證編號:SCXK(京)2012-0001,SPF級,雄性,體質(zhì)量(25±3)g,中國食品藥品檢定研究院;雨生紅球藻源蝦青素粉 蝦青素含量為2%,杭州鑫偉低碳技術(shù)研發(fā)公司;葡萄糖測定試劑盒 中生北控生物科技股份有限公司;小鼠胰島素(INS)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒 上海滬尚生物科技有限公司;蛋白定量測試盒 南京建成生物工程研究所;丙二醛(MDA)測試盒 南京建成生物工程研究所;總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒 南京建成生物工程研究所;谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒 南京建成生物工程研究所。

5804R型低溫高速離心機 德國eppendorf;電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司;電動勻漿器 常州朗越儀器制造有限公司;SPF實驗室 北京聯(lián)合大學食品功能技術(shù)研究院。

1.2 動物的分組與飼養(yǎng)

SPF級昆明雄性小鼠50只,適應(yīng)性飼養(yǎng)飼養(yǎng)3 d,隨機分為四組:正常組、模型組、雨生紅球藻源蝦青素粉(純度2%)低劑量組(25 mg/kg BW)、雨生紅球藻源蝦青素粉(純度2%)高劑量組(100 mg/kg BW)。實驗性小鼠在SPF屏障系統(tǒng)中飼養(yǎng),溫度控制在(20±2) ℃之間,空氣相對濕度50%～70%,光照周期為 14 h光照(6:00～20:00)/10 h黑暗,自由取食、飲水。

1.3 糖尿病模型的建立和蝦青素的灌胃

采用四氧嘧啶誘導糖尿病小鼠的方法造模:小鼠禁食24 h(自由取水)注射新鮮配制的四氧嘧啶(ALX)(45～50 mg/kg BW iv)造模,5～7 d后小鼠禁食3～5 h,眼眶取血,測血糖,血糖值在10～25 mmol/L為高血糖模型建立成功的小鼠。選高血糖模型小鼠按禁食3～5 h的血糖水平分組,隨機選1個模型對照組和2個劑量組(組間血糖差不大于1.1 mmol/L)。

造模成功后,模型組、雨生紅球藻源蝦青素粉(純度2%)低劑量組(25 mg/kg BW)、雨生紅球藻源蝦青素粉(純度2%)高劑量組(100 mg/kg BW)各10只,自小鼠造模成功后24 h開始灌胃,雨生紅球藻源蝦青素粉溶液低劑量為25 mg/kg,雨生紅球藻源蝦青素粉溶液高劑量為100 mg/kg,正常組、模型組灌胃生理鹽水,灌胃體積為1 mL/100 g BW,持續(xù)灌胃14 d,每天對各組小鼠的體重、飲水量和攝食量進行稱量,且記錄各組小鼠的精神狀態(tài)。

1.4 血清和臟器的采集和制備

雨生紅球藻源蝦青素灌胃14 d后,摘眼球取血,離心得到的血清放入-80 ℃冰箱中用于血糖值、胰島素和抗氧化指標的測定。處死小鼠后,立即解剖取出小鼠的肝和腎,放入-80 ℃冰箱中用于后續(xù)抗氧化指標的測定。

1.5 血糖和胰島素的測定

用葡萄糖測定試劑盒測定小鼠血清中血糖含量,按試劑盒說明書進行操作按式(1)計算血糖下降率。

血糖下降率(%)=實驗前血糖值-實驗后血糖值/實驗前血糖值×100

式(1)

用小鼠胰島素(INS)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測小鼠血清中的胰島素水平,按試劑盒操作說明書進行實驗。

1.6 血清抗氧化指標的測定

用丙二醛(MDA)測試盒測定小鼠血清中的MDA,按試劑盒說明書進行操作。用總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒測定小鼠血清中的SOD活性,按試劑盒說明書進行操作。用谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒測定小鼠血清中GSH-Px的活力,按試劑盒說明書進行操作。

1.7 肝、腎組織抗氧化指標的測定

將小鼠肝、腎的樣本從-80 ℃冰箱中拿出,放在10倍量的生理鹽水中用組織勻漿器勻漿制成10%的勻漿液,3000 r/min離心10 min取上清備用,按照1.6中方法測定小鼠肝和腎中的MDA含量、T-SOD的活力和GSH-PX的活力。

1.8 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 12.0軟件進行分析,各組數(shù)據(jù)結(jié)果以x±s表示,并進行單因素方差分析,p<0.05表示有顯著性差異,p<0.01表示有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 雨生紅球藻源ASX對小鼠體重的影響

實驗期間觀察發(fā)現(xiàn),正常組的小鼠皮毛光澤,精神狀態(tài)良好;模型組的小鼠毛色暗黃,精神萎靡;低、高劑量的雨生紅球藻源ASX干預(yù)后,小鼠的毛色逐漸有光澤,精神狀態(tài)漸漸變好。

從整個實驗過程體重變化曲線圖1可以看出:正常對照組小鼠的體重呈現(xiàn)持續(xù)增長的趨勢;模型組的小鼠在實驗的前7 d時體重逐步下降,隨后慢慢增長,說明糖尿病小鼠在接受刺激后體內(nèi)適應(yīng)性代謝紊亂;在雨生紅球藻源ASX干預(yù)后高血糖小鼠體重先下降而逐漸趨于正常,且恢復(fù)程度顯著高于模型組小鼠,與正常組小鼠無差異。

表1 雨生紅球藻源的ASX對小鼠血糖下降率、飲水量、攝食量和胰島素含量的影響

注:*表示與正常對照組比較差異顯著(p<0.05),**表示與空白對照組比較差異極顯著(p<0.01);#表示與模型對照組比較差異顯著(p<0.05),##表示與模型對照組組比較差異極顯著p<0.01;表2、表3同。

圖1 雨生紅球藻源ASX對小鼠體重的影響Fig.1 Effect of ASX on body weight in diabetic mice

2.2 雨生紅球藻源ASX對小鼠飲水量、攝食量、血糖和胰島素含量的影響

實驗小鼠的飲水量和攝食量結(jié)果見表1,模型組小鼠的飲水量和攝食量極顯著高于正常對照組小鼠的飲水量和攝食量(p<0.01);在雨生紅球藻ASX干預(yù)后,低劑量雨生紅球藻源ASX組小鼠的飲水量和攝食量顯著低于模型組小鼠的飲水量(p<0.01)和攝食量(p<0.05),高劑量雨生紅球藻源ASX組小鼠的飲水量和攝食量極顯著低于模型組小鼠的飲水量和攝食量(p<0.01)。結(jié)合表1和圖1表明雨生紅球藻源的ASX干預(yù)后可以對糖尿病三多一少的癥狀有明顯減輕。

表1實驗結(jié)果表明:與正常對照組相比,模型組小鼠的血糖下降率與正常對照組小鼠的血糖下降率有極顯著性差異(p<0.01);與模型組相比,低劑量雨生紅球藻源的ASX組小鼠的血糖下降率與模型組小鼠的血糖下降率有顯著性升高(p<0.05),高劑量雨生紅球藻源ASX組小鼠的血糖下降率與極顯著升高(p<0.01)。說明雨生紅球藻源ASX干預(yù)后,抑制了小鼠體內(nèi)血糖的進一步升高,但未恢復(fù)至正常水平。

與正常對照組相比,模型組小鼠血清中胰島素的含量與正常組小鼠血清中胰島素含量極顯著降低(p<0.01);與模型組相比,低劑量雨生紅球藻源ASX組小鼠血清中胰島素含量極顯著升高(p<0.01),高劑量雨生紅球藻源ASX組小鼠血清中胰島素含量極顯著升高(p<0.01)。說明雨生紅球藻源ASX干預(yù)后,是通過調(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)胰島素水平從而達到降低血糖的目的。

2.3 雨生紅球藻源ASX對小鼠血清中的抗氧化指標的影響

表1實驗結(jié)果表明:與正常對照組相比,模型組小鼠血清中的SOD活性下降(p<0.05),GSH-Px活性下降(p<0.05),而MDA含量無顯著差異(p>0.05);與模型組相比,低劑量雨生紅球藻源ASX組小鼠血清中T-SOD活性升高(p<0.05),GSH-Px活性升高(p<0.01),MDA含量無顯著差異,高劑量雨生紅球藻源ASX組小鼠血清中T-SOD活性升高(p<0.01),GSH-Px活性升高(p<0.01),MDA含量無差異。說明蝦青素可以明顯改善四氧嘧啶糖尿病小鼠的氧化應(yīng)激水平。

表2 小鼠血清中的抗氧化指標(T-SOD、GSH-Px、MDA)

2.4 雨生紅球藻源ASX對小鼠肝、腎抗氧化指標的影響

肝臟和腎臟是影響機體糖代謝的重要器官,肝臟和腎臟功能的好壞對糖尿病的發(fā)生及病情發(fā)展有極為重要的影響。表3實驗結(jié)果表明:與正常對照組相比,模型組小鼠肝臟和腎臟的MDA含量顯著升高(p<0.05),SOD活力無差異、GSH-Px活力無顯著差異;與模型組相比,低劑量雨生紅球藻源ASX組小鼠肝臟和腎臟的MDA含量顯著降低(p<0.05),SOD活力無顯著差異、GSH-Px活力無顯著差異,高劑量雨生紅球藻源ASX組小鼠肝臟和腎臟的MDA含量顯著降低(p<0.01),SOD活力無顯著差異、GSH-Px活力無顯著差異。說明蝦青素干預(yù)后對四氧嘧啶糖尿病小鼠組織的氧化應(yīng)激水平有一定的作用,且對SOD、GSH-Px的活力有改善的作用,但與模型組相比無差異。

表3 小鼠肝臟和腎臟中的抗氧化指標(T-SOD、GSH-Px、MDA)

3 討論與結(jié)論

四氧嘧啶是一種氧化劑,進入機體內(nèi)代謝產(chǎn)生活性氧并迅速被胰島β細胞攝取,通過氧化還原反應(yīng)使胰島β細胞中氧自由基含量升高,導致胰島β細胞大量損傷和死亡。目前大量的研究表明,體內(nèi)自由基堆積可導致胰島β細胞受損,胰島素分泌減少,血糖升高,進一步,在高糖環(huán)境下,蛋白質(zhì)糖基化終末產(chǎn)物生成增加,與特異性受體作用可誘導氧化應(yīng)激,同時高糖也能夠引起氧自由基生成增加,同時也會使機體周圍組織損傷,破壞機體的平衡,抗氧化能力下降[14-15]。

機體在正常情況下氧化和抗氧化處于一個動態(tài)平衡,當某種原因使自由基產(chǎn)生增加、抗氧化能力減弱,將導致各種病理變化的產(chǎn)生。最新研究表明[16-20],自由基誘發(fā)脂質(zhì)的過氧化與糖尿病密切相關(guān),是疾病起始的重要原因之一。MDA是多不飽和脂肪酸過氧化物的降解產(chǎn)物,與脂蛋白交聯(lián)后具有較強的毒性,因此MDA作為衡量體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的主要指標,在一定程度上反映了細胞受氧化損傷的程度;SOD能夠清除自由基,保護細胞損傷,間接的反應(yīng)機體清除自由基的能力;GSH-Px是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解的酶,可以起到保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。實驗研究表明,雨生紅球藻源ASX的干預(yù)治療,顯著降低了糖尿病小鼠的血糖,顯著提高了四氧嘧啶糖尿病小鼠的抗氧化酶活性,降低了四氧嘧啶對機體造成的氧化損傷,減輕了糖尿病的各種癥狀。

綜上所述,雨生紅球藻源ASX可顯著降低高血糖小鼠的飲水量和攝食量,且明顯改善了高血糖小鼠體重的正常趨勢使其趨于正常;顯著降低四氧嘧啶小鼠的氧化損傷,提高機體免疫力,促進胰腺β細胞的胰島素分泌功能,從而降低血糖。雨生紅球藻源ASX對四氧嘧啶糖尿病小鼠降糖的具體途徑仍需進一步研究。

雨生紅球藻源ASX顯著降低高血糖小鼠的飲水量和攝食量,且明顯改善了高血糖小鼠體重的正常趨勢使其趨于正常;能夠促進高血糖小鼠胰島素的分泌,顯著降低高血糖小鼠的血糖值;顯著降低高血糖小鼠的氧化損傷,提高了機體的免疫力。

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Effects ofHaematococcuspluvialisastaxanthin on diabetes mice for decreasing blood glucose and its mechanisms

LI Yong-chao,HE Qing-hua,LIU Rui-xue,ZHANG BO*,YANG Zhong-xin,ZHOU Min

(Research Institute for Science and Technology of Functional Food, College of Arts and Science,Beijing Union University,Beijing 100191,China)

To explore effect ofHaematococcuspluvialisastaxanthin to mice diabete for decreasing blood glucose and its mechanisms. Experimental diabete mice was induced by alloxan(ALX)(45～50 mg/kg BW iv). With 25 mg/kg and 100 mg/kg dose ofHaematococcuspluvialisastaxanthin(2%)for 14 d lavage alloxan diabete mice,the blood samples of mice were collected by orbit,blood glucose,insulin,SOD,GSH-Px activity and MDA level in the blood were measured. The liver and kidney were taken to weigh,SOD,GSH-Px activity and MDA level in the tissues were measured. The results showed thatHaematococcuspluvialisastaxanthin could significantly(p<0.05)inhibit diabete mice weight of reduction and return to normal,reduce(p<0.01)water intake and diet intake and reduce(p<0.01)high blood glucose levels of diabete mice and improve the ability of antioxidation,the mechanism of ASX in reducing blood glucose might be achieved by regulating the insulin.

Haematococcuspluvialis;astaxanthin;blood glucos;diabetes;mice

2016-06-17

李勇超(1991-)，男，碩士研究生，研究方向：生物活性物質(zhì)的功能與毒理，E-mail:liyongchaoyx@126.com。

*通訊作者:張波(1962-)，女，教授，研究方向：生物活性物質(zhì)的功能與毒理，E-mail：zhangbo_wl@buu.edu.cn。

“十二五”國家科技支撐計劃課題(2012BAD33B06)；北京聯(lián)合大學校級科研項目(2015年)。

TS

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000