兩種粒徑微球造孔劑粒徑比和質(zhì)量比對磷酸鈣骨水泥孔隙率的影響▲

葉財敏 陳娟娟 梁翠薇 吳修團(tuán) 李文良 謝柳蓉 廖紅兵

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔修復(fù)科，南寧市 530021)

兩種粒徑微球造孔劑粒徑比和質(zhì)量比對磷酸鈣骨水泥孔隙率的影響▲

葉財敏 陳娟娟 梁翠薇 吳修團(tuán) 李文良 謝柳蓉 廖紅兵*

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔修復(fù)科，南寧市 530021)

目的 利用兩種粒徑的聚甲基丙烯酸甲酯( PMMA)微球作為微球工具以不同的粒徑比和質(zhì)量比加入磷酸鈣骨水泥( CPC)后觀察其對復(fù)合物孔隙率的影響。方法 使用50 μm/15 μm PMMA微球、100 μm/50 μm PMMA微球和20 μm/15 μm PMMA微球三種粒徑組合方式(微球占復(fù)合物的體積比均為50%)，每種組合中微球的質(zhì)量比分別為2 ∶8、3 ∶7、4 ∶6、5 ∶5、6 ∶4、7 ∶3和8 ∶2，高溫煅燒后用密度法計算磷酸鈣骨水泥的孔隙率。結(jié)果 50 μm/15 μm PMMA微球質(zhì)量比為2 ∶8、3 ∶7、4 ∶6、5 ∶5、6 ∶4、7 ∶3和8 ∶2時CPC復(fù)合物孔隙率分別為(70.9±1.2)%、(70.0±0.6)%、(67.9±0.7)%、(71.2±0.9)%、(68.4±0.8)%、(70.5±0.8)%、(71.2±1.8)%；100 μm/50 μm PMMA微球質(zhì)量比為2 ∶8、3 ∶7、4 ∶6、5 ∶5、6 ∶4、7 ∶3和8 ∶2時CPC復(fù)合物孔隙率分別為(70.9±1.2)%、(71.3±2.6)%、(69.6±2.4)%、(71.1±1.5)%、(68.8±0.9)%、(69.1±1.5)%、(69.9±1.9)%；20 μm/15 μm PMMA微球質(zhì)量比為2 ∶8、3 ∶7、4 ∶6、5 ∶5、6 ∶4、7 ∶3和8 ∶2時CPC復(fù)合物孔隙率分別為(76.7±2.9)%、(72.7±1.2)%、(70.7±0.7)%、(69.7±1.1)%、(70.8±2.1)%、(72.5±2.5)%、(66.9±1.4)%。結(jié)論 在磷酸鈣骨水泥中添加相同體積的兩種不同粒徑微球，孔隙率會隨著粒徑比和質(zhì)量比的變化而變化。

磷酸鈣骨水泥；微球；孔隙率；聚甲基丙烯酸甲酯

外科創(chuàng)傷、腫瘤切除手術(shù)和高速交通事故造成的骨缺損，需要骨移植修復(fù)，同時隨著人口老齡化和人們健康觀念的增強(qiáng)，對骨移植材料的需求日益高漲。骨缺損是一個世界性的難題，自體來源骨移植組織供區(qū)少，數(shù)量有限，研究人員開始把研究重點聚焦于制備理想的骨移植替代材料。然而到目前為止，還沒有制備出理想的骨移植替代材料。20世紀(jì)80年代Brown研制出可用于骨移植和修復(fù)的磷酸鈣骨水泥(calcium phosphate cement，CPC)，因其生物相容性好、骨引導(dǎo)性和可注射性，被視為有前途的骨移植材料。CPC最大的缺陷是降解緩慢，幾乎不能誘導(dǎo)新生骨組織長入材料內(nèi)部。近年來有研究發(fā)現(xiàn)通過可降解的微球與CPC復(fù)合，微球的機(jī)械強(qiáng)度有助于材料初始強(qiáng)度的提高[1]，同時隨著微球的降解，形成多孔結(jié)構(gòu)，促進(jìn)CPC的降解，提高成骨能力，是更可行的方法[2～4]。然而先前的研究添加的微球都是同一種粒徑的可降解微球，并進(jìn)行動物實驗[5]，還沒有研究者在體外實驗中利用兩種粒徑的可降解微球研究CPC孔隙率的變化。因此，筆者引入聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)微球作為可降解微球的研究工具，研究兩種微球不同粒徑比和質(zhì)量比對磷酸鈣骨水泥孔隙率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 粉末狀磷酸鈣骨水泥(上海瑞邦生物材料有限公司)，PMMA(微球粒徑分別為15 μm、20 μm、50 μm和100 μm，蘇州知益微球科技有限公司)。

1.2 樣本的制作和孔隙率的計算

1.2.1 樣本的制作 ①PMMA微球占復(fù)合物體積比50%時，按質(zhì)量比稱量50 μm/15 μm PMMA微球及CPC，質(zhì)量比2 ∶8(X1組)、3 ∶7(X2組)、4 ∶6(X3組)、5 ∶5(X4組)、6 ∶4(X5組)、7 ∶3(X6組)和8 ∶2(X7組)；②PMMA微球占復(fù)合物體積比50%時，按按質(zhì)量比稱量100 μm/50 μm PMMA微球及CPC，質(zhì)量比2 ∶8(Y1組)、3 ∶7(Y2組)、4 ∶6(Y3組)、5 ∶5(Y4組)、6 ∶4(Y5組)、7 ∶3(Y6組)和8 ∶2(Y7組)；③PMMA微球占復(fù)合物體積比50%時，按質(zhì)量比稱量20 μm/15 μm PMMA微球及CPC，質(zhì)量比2 ∶8(Z1組)、3 ∶7(Z2組)、4 ∶6(Z3組)、5 ∶5(Z4組)、6 ∶4(Z5組)、7 ∶3(Z6組)和8 ∶2(Z7組)。按0.4 ml/g的固液比例，用移液槍將4%NaH2PO4溶液混入復(fù)合物粉末中，用金屬調(diào)拌刀將復(fù)合物粉末和液體調(diào)拌均勻，在15 s內(nèi)將調(diào)拌好的材料裝入2 mL注射器中，然后除去注射器金屬針頭，將材料注射入直徑5 mm，高度6 mm的特氟龍管中。所有樣本在恒溫37°C、100%濕度的恒溫水浴箱中固化24 h后脫模。每組樣品制備5個。

1.2.2 密度法計算孔隙率 將固化脫模后的樣品放置于60°的干燥箱中，24 h后取出。樣本按編號放置于蒸發(fā)皿中，隨后放入高溫電爐，600°煅燒3 h。待樣品冷卻后分別稱重記為M，游標(biāo)卡尺測量樣品的長度L，使用圓柱體的體積公式計算出樣品體積V，根據(jù)孔隙率計算公式ε=(1-M/V×ρ)×100%計算復(fù)合物孔隙率，V為樣品煅燒后的體積，ρ為CPC的理論密度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析，計量單位以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，組間比較采用單因素方差分析，方差不齊采用秩合檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

復(fù)合物孔隙率測量結(jié)果見表1。在100 μm/50 μm組，復(fù)合物的孔隙率不隨微球質(zhì)量比的變化而變化，不同質(zhì)量比之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；在50 μm/15 μm組，4 ∶6組和6 ∶4組與5 ∶5組比較，均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)；在20 μm/15 μm組，2 ∶8組與5 ∶5組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，3 ∶7組、7 ∶3和8 ∶2組與5 ∶5組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。圖1、圖2和圖3分別為50 μm/15 μm組、100 μm/50 μm組和20 μm/15 μm組在7個質(zhì)量比時，復(fù)合物孔隙率的柱狀圖。

表1 三種不同粒徑比下七個質(zhì)量比時復(fù)合物孔隙率

注：*P<0.01，#P<0.05。

圖1 50 μm/15 μmPMMA微球/CPC復(fù)合物在不同

質(zhì)量比時的孔隙率，均與5 ∶5組比較，＊＊P<0.01。 圖2 100 μm/50 μm PMMA微球/CPC復(fù)合物在不同質(zhì)量比時的孔隙率，均與5 ∶5組比較，P<0.05。

圖3 20 μm/15 μm PMMA微球/CPC復(fù)合物在不同質(zhì)量比時的孔隙率，均與5 ∶5組比較，＊＊P<0.01，＊P<0.05

3 討 論

3.1 磷酸鈣骨水泥孔隙率的提高 CPC由固體磷酸鈣鹽粉末和液體組成，在合適的比例混合后形成糊狀物，凝固固化后形成弱結(jié)晶纏繞的羥基磷灰石(hydroxyapatite)晶體網(wǎng)絡(luò)，能很好地充填缺損部位。但CPC在體內(nèi)降解緩慢，與新生骨組織的生長速度不匹配，動物體內(nèi)移植實驗發(fā)現(xiàn)材料未能完全降解吸收[6，7]。因而，增加CPC的降解性能是提高成骨能力的關(guān)鍵。

有學(xué)者指出，增加CPC基質(zhì)材料的孔隙率能增加其成骨能力[5，8]。在CPC基質(zhì)材料中添加一定體積的可降解的微球，隨著微球的降解，形成一定孔隙率的多孔材料。添加不同粒徑的可降解微球，可形成多級孔隙結(jié)構(gòu)，大粒徑微球可形成大孔，小粒徑微球能夠填充于大粒徑微球之間。在添加微球體積一定時，大粒徑微球和小粒徑球體的組合是否對孔隙率造成影響？實驗發(fā)現(xiàn)在100 μm/50 μm組中，各質(zhì)量比之間的孔隙率兩兩比較均沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示在小粒徑球體與大粒徑球體的粒徑比為0.5 ∶1時，微球的粒徑對孔隙率沒有影響。在50 μm/15 μm組中(小粒徑球體與大粒徑球體的粒徑比為0.3 ∶1)，4 ∶6組和6 ∶4組與5 ∶5組比較，孔隙率顯著降低(P<0.01)，可能原因是4 ∶6組和6 ∶4組中的兩種PMMA微球數(shù)目比小于2 ∶8、8 ∶2、3 ∶7和7 ∶3組中的兩種微球數(shù)目比，同時兩微球的粒徑比為0.3 ∶1，進(jìn)而引起孔隙率的降低，提示在添加兩種微球(粒徑比為0.3 ∶1)時，兩種微球質(zhì)量比接近1 ∶1能形成較低的孔隙率，質(zhì)量組合相差越大，其形成的孔隙率越大。在20 μm/15 μm組中(小粒徑球體與大粒徑球體的粒徑比為0.75 ∶1)，2 ∶8組與5 ∶5組比較，孔隙率顯著增加(P<0.01)，3 ∶7組、7 ∶3組和8 ∶2組與5 ∶5組比較，孔隙率增加(P<0.05)，可能原因是2 ∶8組、3 ∶7組、7 ∶3組和8 ∶2組球體數(shù)目比大于4 ∶6組和6 ∶4組，導(dǎo)致孔隙率的增加。有學(xué)者指出當(dāng)兩種球體的粒徑比大于0.7時可認(rèn)為是等大球的堆積[9]，本研究結(jié)果與其有所差別。如果20 μm/15 μm組(粒徑比0.75>0.7)視為等大球，在同等體積比下，孔隙率不會隨兩種微球的質(zhì)量比的變化而變化。提示粒徑比在0.75時，兩種微球的質(zhì)量比越大，其形成的孔隙率越高。

本研究只設(shè)置了三個粒徑比，在今后的研究中可安排多個粒徑比，以期闡明粒徑比對孔隙率的影響。

3.2 多孔材料孔隙率測量方法的選擇 多孔支架材料孔隙率的測量方法主要有：壓汞法[10]、液體置換法[11]、密度法[12]，掃描電子顯微鏡分析法[13]和Micro-CT圖像分析法[14]等。密度法是一種簡單快速的測量支架材料的孔隙率的方法，適用于不能承高壓力的支架材料孔隙率的測量。本實驗制備的磷酸鈣骨水泥樣品是規(guī)則的圓柱體，樣品在煅燒后形成疏松多孔造成結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定，外力的施加可能會造成結(jié)構(gòu)的破壞，因此選用密度法測量孔隙率。通過測量圓柱體的高度可計算出圓柱體的體積，進(jìn)而可計算出孔隙率。

由此可見，在磷酸鈣骨水泥中添加相同體積的兩種不同粒徑微球，孔隙率會隨著粒徑比和質(zhì)量比的變化而變化。

[1] Cuzmar E, Perez RA, Manzanares MC, et al.In vivo osteogenic potential of biomimetic hydroxyapatite/collagen microspheres: comparison with injectable cement pastes[J].PLoS One,2015,10(7):e0131188.

[2] An J, Leeuwenburgh SC, Wolke JG, et al.Effects of stirring and fluid perfusion on the in vitro degradation of Calcium phosphate cement/PLGA composites[J].Tissue Eng Part C Methods,2015,21(11):1171-1177.

[3] Bian C, Lin H, Li X, et al.Preparation of spherical macroporous poly(lactic-co-glycolic acid) for bone tissue regeneration[J].IET Nanobiotechnol,2015,9(1):1-4.

[4] Lee K, Weir MD, Lippens E, et al.Bone regeneration via novel macroporous CPC scaffolds in critical-sized cranial defects in rats[J].Dent Mater,2014,30(7):e199-e207.

[5] Van Houdt CI, Preethanath RS, Van Oirschot BA, et al.Toward accelerated bone regeneration by altering poly(D,L-lactic-co-glycolic) acid porogen content in Calcium phosphate cement[J].J Biomed Mater Res A,2016,104(2):483-492.

[6] Ding S, Zhang J, Tian Y, et al.Magnesium modification up-regulates the bioactivity of bone morphogenetic protein-2 upon Calcium phosphate cement via enhanced BMP receptor recognition and Smad signaling pathway[J].Colloids Surf B Biointerfaces,2016,145(期缺失):140-151.

[7] Do AO, K NW, Sa S, et al.Development of novel Strontium containing bioactive glass based Calcium phosphate cement[J].Dental Materials,2016,32(6):703-712.

[8] Yang B, Zuo Y, Zou Q, et al.Effect of ultrafine poly(ε-caprolactone) fibers on Calcium phosphate cement: in vitro degradation and in vivo regeneration[J].Int J Nanomedicine,2016,11:163-177.

[9] 葉大年,張金民.非等大球體的任意堆積[J].地質(zhì)科學(xué),1990(2):127-136.

[10]Al-Qararah AM, Ekman A, Hjelt T, et al.Porous structure of fibre networks formed by a foaming process: a comparative study of different characterization techniques[J]. J Microsc. 2016 May 9. doi: 10.1111/jmi.12420.

[11]Serra IR, Fradique R, Vallejo MC, et al.Production and characterization of chitosan/gelatin/β-TCP scaffolds for improved bone tissue regeneration[J].Mater Sci Eng C Mater Biol Appl,2015,55 :592-604.

[12]Abd-Elrahman AA, El Nabarawi MA, Hassan DH, et al.Ketoprofen mesoporous silica nanoparticles SBA-15 hard gelatin capsules: preparation and in vitro/in vivo characterization[J]. Drug Deliv,2016,11:1-29.

[13]Park HJ, Min KD, Lee MC, et al.Fabrication of 3D porous SF/β-TCP hybrid scaffolds for bone tissue Reconstruction[J]. J Biomed Mater Res A. 2016 Mar 21. doi: 10.1002/jbm.a.35711.

[14]Eneh CT, Malo MK, Karjalainen JP, et al.Effect of porosity, tissue density, and mechanical properties on radial sound speed in human cortical bone[J]. Med Phys. 2016 May;43(5):2030. doi: 10.1118/1.4942808.

Influence of pore size ratio and mass ratio on the porosity of calcium phosphate cement with two kinds of particle size

YECaimin,CHENJuanjuan,LIANGCuiwei,WUXiutuan,LIWenliang,XIELiurong,LIAOHongbing

(DepartmentofProsthodontics,StomatologicalHospitalAffiliatedtoGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To use two different particle size of Polymeric Methyl Methacrylate(PMMA) microspheres as a tool and observe the influence of porosity of complex after adding different quality ratio tocalcium phosphate cement (CPC). Methods Adding 50 μm/15 μm PMMA microspheres, 100 μm/50 μm PMMA microspheres and 20 μm/15 μm PMMA microspheres (microspheres accounted for the volume of the complexes were 50%) to CPC, and each combination microspheres quality ratio were 2 ∶8， 3 ∶7， 4 ∶6， 5 ∶5， 6 ∶4, 7 ∶3 and 8 ∶2, respectively. Results If the 50 μm /15μm PMMA microspheres mass ratio were 2 ∶8, 3 ∶7, 4 ∶6, 5 ∶5, 6 ∶4, 7 ∶3 and 8 ∶2,the CPC composite porosity were (70.9±1.2)%, (70.0±0.6)%, (67.9±0.7)%, (71.2±0.9)%, (68.4±0.8)%, (70.5±0.8)%, (71.2±1.8)%；If the 100 μm/50 μm PMMA microspheres mass ratio were 2 ∶8, 3 ∶7, 4 ∶6, 5 ∶5, 6 ∶4, 7 ∶3 and 8 ∶2,the CPC composite porosity were(70.9±1.2)%, (71.3±2.6)%, (69.6±2.4)%, (71.1±1.5)%, (68.8±0.9)%, (69.1±1.5)%, (69.9±1.9)%；If the 20 μm/15 μm PMMA microspheres mass ratio were 2 ∶8, 3 ∶7, 4 ∶6, 5 ∶5, 6 ∶4, 7 ∶3 and 8 ∶2,the CPC composite porosity were(76.7±2.9)%, (72.7±1.2)%, (70.7±0.7)%, (69.7±1.1)%, (70.8±2.1)%, (72.5±2.5)%, (66.9±1.4)%. Conclusion When adding two kinds of microspheres with the same volume in the calcium phosphate cement ,the porosity changes with the ratio of the particle size and the mass ratio.

Calcium phosphate cement; Microspheres; Porosity;Polymeric Methyl

國家自然科學(xué)基金(編號：03101212035)

葉財敏(1985～)，男，在讀碩士研究生，研究方向：口腔種植基礎(chǔ)與臨床研究。

R 318

A

1673-6575(2016)03-0319-04

10.11864/j.issn.1673.2016.03.03

2016-02-27

2016-04-24)

*通訊作者