基于多層過濾的光度法微生物鑒定算法的研究

張紹康 林 勇

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093)

基于多層過濾的光度法微生物鑒定算法的研究

張紹康 林 勇*

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093)

針對(duì)一種全自動(dòng)光度法微生物鑒定儀設(shè)計(jì)了相應(yīng)的微生物鑒定算法。算法根據(jù)酶標(biāo)板板孔陰陽(yáng)性的綜合信息，采用多層過濾機(jī)制逐步調(diào)整樣本微生物與模板微生物的相似度：首先通過夾角余弦法計(jì)算原始相似度，然后將匹配異常的板孔分為絕對(duì)、顯著和大概率異常等3個(gè)等級(jí)對(duì)相似度進(jìn)行不同程度的調(diào)整，最后根據(jù)調(diào)整后的相似度給出鑒定結(jié)果。通過微生物重復(fù)實(shí)驗(yàn)以及與梅里埃鑒定方法的比對(duì)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了算法的有效性，對(duì)5種常見微生物進(jìn)行鑒定實(shí)驗(yàn)，本算法檢準(zhǔn)率均超過85%；與梅里埃鑒定方法比較，本算法有4種高于或等于梅里埃法，1種略低。梅里埃法得到的相似度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差是本算法的1.5～11倍。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本算法具有高檢準(zhǔn)率和高魯棒性的特點(diǎn)。

多層過濾； 相似度； 微生物鑒定； 光度法

引言

微生物鑒定是微生物實(shí)驗(yàn)室廣泛開展的基礎(chǔ)工作。近年來，國(guó)家針對(duì)抗生素濫用的問題出臺(tái)政策要求二級(jí)及以上醫(yī)院應(yīng)配備微生物實(shí)驗(yàn)室，微生物樣本送檢率不低于30%[1-2]。這對(duì)高效快速的微生物鑒定提出新的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的光度鑒定法以其靈敏度高、準(zhǔn)確度高、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于微生物鑒定中[3-4]。目前基于光度法鑒定系統(tǒng)流行于各大微生物鑒定廠商，例如：法國(guó)梅里埃公司的VITEK-ATB、VITEK系統(tǒng)[5]，美國(guó)Dade MicroScan公司的Auto-Scan4[6]，美國(guó)BIOLOG公司Microlg-M、GENⅢMicroStation[7]系統(tǒng)，SENSITITRE公司的Auto-Reader、Sensititre ManualSysyem系統(tǒng)[8]。這些產(chǎn)品都能較準(zhǔn)確地完成微生物鑒定，但大多數(shù)是半自動(dòng)型[9-10]。半自動(dòng)型鑒定過程需要人工干預(yù)，因此效率不高，易誤操作。針對(duì)這一問題，我們研發(fā)了一款全自動(dòng)微生物鑒定儀器并進(jìn)行鑒定算法設(shè)計(jì)。首先，該儀器工作原理是全程通過機(jī)械手定時(shí)自動(dòng)地移動(dòng)微生物培養(yǎng)酶標(biāo)板至光度獲取區(qū)域進(jìn)行測(cè)量[11]，從而得到每個(gè)板孔的光度值，然后將其傳輸?shù)缴衔粰C(jī)并轉(zhuǎn)換為陰陽(yáng)性數(shù)據(jù)，最后通過鑒定算法得到鑒定結(jié)果。

本研究設(shè)計(jì)了一種基于多層過濾的光度法微生物鑒定算法。這種算法具有高準(zhǔn)確性、高魯棒性等特點(diǎn)。算法過程：微生物培養(yǎng)結(jié)束得到鑒定板條上各孔的陰陽(yáng)性數(shù)據(jù)，將其與微生物標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)進(jìn)行模糊匹配，根據(jù)板條的綜合信息得出鑒定結(jié)果。臨床微生物的鑒定實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了算法的有效性。

1 材料與方法

1.1 基于多層過濾的光度法微生物鑒定算法

所使用的算法為多層懲罰系數(shù)調(diào)整相似度算法(multi-layer adjusted similarity coefficient algorithm, MASCA)。該算法是首先將實(shí)驗(yàn)樣本各孔陰陽(yáng)性數(shù)據(jù)與模板微生物庫(kù)中的每種微生物相應(yīng)板孔信息進(jìn)行對(duì)比得到原始相似度，然后根據(jù)匹配程度的綜合信息進(jìn)行多層懲罰，最后計(jì)算得到樣本與所有模板微生物的相似度(similarity, SIM)，從而給出判斷結(jié)果。

1.1.1 問題描述

為了方便描述算法，首先對(duì)鑒定過程中采用的符號(hào)和概念進(jìn)行形式化的定義。鑒定微生物使用模板的孔數(shù)為n。微生物培養(yǎng)結(jié)束后得到板條各孔的陰陽(yáng)性的情況，在這里通過向量E來描述，有

(1)

式中，Ai表示第i孔的陰陽(yáng)性，可表示為

(2)

鑒定微生物的核心思想是通過待鑒定微生物各孔的陰陽(yáng)性分布與標(biāo)準(zhǔn)微生物的陰陽(yáng)性分布情況的比較，提取標(biāo)準(zhǔn)微生物庫(kù)中與待測(cè)微生物最接近的微生物作為候選鑒定結(jié)果，在算法中用相似度Corr的大小表示其近似程度。把標(biāo)準(zhǔn)微生物的陰陽(yáng)性分布情況存放于標(biāo)準(zhǔn)微生物數(shù)據(jù)庫(kù)中(模板庫(kù)通過標(biāo)準(zhǔn)菌的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)確定)，微生物數(shù)量為s，第i種標(biāo)準(zhǔn)微生物數(shù)據(jù)用向量表示為

(3)

式中，Pij為第i種微生物在第j個(gè)孔上出現(xiàn)陽(yáng)性的概率(j=1,2,…,m)，此概率值是通過對(duì)已知的標(biāo)準(zhǔn)微生物經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)，依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)得到的。

式(1)和式(2)在于將實(shí)驗(yàn)微生物與微生物庫(kù)中的模板匹配轉(zhuǎn)化為尋找E和Fi中哪一個(gè)相似度最大，并且該相似度要達(dá)到一定閾值要求時(shí)才認(rèn)可為該微生物[12]。

1.1.2MASCA算法的設(shè)計(jì)

圖1為MASCA算法流程，主要包括5個(gè)步驟。

圖1 MASCA算法流程Fig.1 MASCA algorithm process

步驟1：原始相似度(RawCorri)計(jì)算。通過計(jì)算向量E和Fi的夾角余弦值獲得，有

(4)

當(dāng)E和Fi為零向量時(shí)，因?yàn)闊o法計(jì)算夾角余弦值，所以通過計(jì)算E和Fi的歐式距離來代替RawCorri。

步驟2：絕對(duì)異常調(diào)整。針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)微生物數(shù)據(jù)Pij為0或1時(shí)，而某次實(shí)驗(yàn)值卻相反為1或0的情況(即在標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)中該孔值為100%陰性或100%陽(yáng)性時(shí)，而實(shí)驗(yàn)值卻相反為陽(yáng)性或陰性)。因此需要對(duì)該類孔進(jìn)行較大的懲罰，令實(shí)驗(yàn)微生物與所有標(biāo)準(zhǔn)微生物比對(duì)的最小絕對(duì)異?？讛?shù)為Hmin，當(dāng)前標(biāo)準(zhǔn)微生物絕對(duì)異?？讛?shù)為H，懲罰系數(shù)PC0設(shè)定為

(5)

式中,α是一個(gè)常數(shù)。

步驟3：顯著異常調(diào)整。針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)微生物數(shù)據(jù)中Pij為小于等于0.05或大于等于0.95時(shí)而實(shí)驗(yàn)值為1或0的情況，其懲罰系數(shù)PC1計(jì)算方法與PC0計(jì)算方法類似，不同之處在于其使用的Hmin應(yīng)在原來的基礎(chǔ)上增加一個(gè)步長(zhǎng)τ (實(shí)驗(yàn)中τ為2)，即參與計(jì)算式為

(6)

步驟4：大概率異常懲罰。針對(duì)該反應(yīng)孔在標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)中大概率呈陽(yáng)性而實(shí)驗(yàn)值卻為陰性結(jié)果的情況(例如某孔有85%概率呈陽(yáng)性，然而實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性)，定義概率閾值記為Pt，懲罰系數(shù)的調(diào)整原則為首先統(tǒng)計(jì)上述孔的總個(gè)數(shù)記為m,其標(biāo)準(zhǔn)微生物i對(duì)應(yīng)各孔的Pi1, Pi2,…, Pim懲罰系數(shù)PC2表示為

(7)

式中，a=0.5,b=0.15，c=0.95，這些系數(shù)均來源于對(duì)已有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行大量的統(tǒng)計(jì)訓(xùn)練優(yōu)化, 根據(jù)作者經(jīng)驗(yàn)調(diào)整獲得的，且在驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中取得了較好的鑒定結(jié)果。

步驟5：相似度綜合分析。將步驟1～步驟4計(jì)算得到的初始相似度和調(diào)整系數(shù)相乘，即可獲得調(diào)整后的相似度AdjCorri，將AdjCorri進(jìn)行排序，最終獲取實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)果。鑒定結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)是取AdjCorri排序前10的值分別是R1,R2,…,R10。若這些值滿足下列任何一個(gè)條件：一是R1-R2>0.3且R1>0.4，二是R1-R2>0.1且R1>0.8, 則鑒定得到唯一結(jié)果，否則儀器無鑒定結(jié)果，只將Ri結(jié)果顯示，進(jìn)行手動(dòng)鑒定。

1.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.1 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

為了確保獲得微生物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的真實(shí)性，整個(gè)實(shí)驗(yàn)是在微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的。分別針對(duì)5種微生物進(jìn)行了多次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，這5種微生物屬于實(shí)驗(yàn)鑒定所用標(biāo)準(zhǔn)菌。在恒溫培養(yǎng)前，為了避免或降低培養(yǎng)液量因素的影響，采用自動(dòng)加液儀器對(duì)板條的各孔進(jìn)行精確加液；然后將板條放入鑒定用的儀器中進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，全程通過機(jī)械手定時(shí)自動(dòng)地移動(dòng)微生物培養(yǎng)酶標(biāo)板至光度獲取區(qū)域進(jìn)行測(cè)量；最后將測(cè)量的光度信息傳輸?shù)接?jì)算機(jī)并轉(zhuǎn)換為陰陽(yáng)性數(shù)據(jù)，通過鑒定算法得到鑒定結(jié)果。

本次實(shí)驗(yàn)使用的5種微生物以及實(shí)驗(yàn)次數(shù)分別為：大腸埃希菌B共32次；陰溝腸桿菌B共14次；糞腸球菌共16次；銅綠假單胞菌共20次；金黃色葡萄球菌金黃亞種共12次，總鑒定次數(shù)為94。其中金黃色葡萄球菌金黃亞種、糞腸球菌為革蘭氏陽(yáng)性微生物，大腸埃希菌B、銅綠假單胞菌、陰溝腸桿菌B為革蘭氏陰性微生物。

在鑒定過程中，用到了模板數(shù)據(jù)。模板數(shù)據(jù)是標(biāo)準(zhǔn)菌經(jīng)過培養(yǎng)后酶標(biāo)板各板孔的陽(yáng)性概率。獲取模板數(shù)據(jù)的方法是對(duì)每種微生物標(biāo)準(zhǔn)菌采取重復(fù)實(shí)驗(yàn)處理并保存每次實(shí)驗(yàn)各孔的陰陽(yáng)性值，然后經(jīng)過統(tǒng)計(jì)計(jì)算得到每個(gè)孔的陽(yáng)性概率值，即本文第1.1.1節(jié)中Pij。

1.2.2 驗(yàn)證方法

為了驗(yàn)證該算法的有效性、高檢準(zhǔn)率和高魯棒性，采用兩種方法驗(yàn)證,一是微生物重復(fù)實(shí)驗(yàn)，二是與梅里埃鑒定算法作對(duì)比。在驗(yàn)證方法中采用平均相似度(AvgC)、相似度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)和檢準(zhǔn)率(R)等3個(gè)指標(biāo)來衡量鑒定算法的性能。RSD和R可表示為

(8)

(9)

2 結(jié)果

2.1 微生物重復(fù)實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)果及分析

用光度法獲取實(shí)驗(yàn)微生物的陰陽(yáng)性反應(yīng)數(shù)值，并采用MASCA進(jìn)行鑒定，重復(fù)實(shí)驗(yàn)的鑒定結(jié)果如表1所示。

表1 微生物鑒定結(jié)果Tab.1 Microbial identification results

注：S.a.sub(金黃色葡萄球菌金黃亞種)，E.fae(糞腸球菌)， E.coliB(大腸埃希菌B)，P.aer(銅綠假單胞菌)，E.cola- B(陰溝腸桿菌B)

Note: S.a.sub(Staphylococcus aureus subsp),E.fae (Enterococcus faecalis),E.coli B(E. coli B),P.aer(Pseudomonas aeruginosa),E.cola B(Enterobacter cloacae B)

由表1可知，在所有重復(fù)實(shí)驗(yàn)的鑒定結(jié)果中，每一種微生物的平均相似度都達(dá)到了較好的結(jié)果。其中金黃色葡萄球菌金黃亞種的相似度更是高達(dá)0.908。從相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差即相對(duì)于平均值的離散程度的結(jié)果中，可以看出金黃色葡萄球菌金黃亞種的結(jié)果最穩(wěn)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差僅為0.6%，陰溝腸桿菌B的為2.7%。在5種微生物鑒定結(jié)果只有銅綠假單胞菌穩(wěn)定性稍低，通過將其和余下四種微生物的數(shù)據(jù)結(jié)果對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)主要原因是由于銅綠假單胞菌樣本自身反應(yīng)的穩(wěn)定性差導(dǎo)致的。檢準(zhǔn)率除陰溝腸桿菌B為85.7%和銅綠假單胞菌為85.0%外均達(dá)到100%。

由以上數(shù)據(jù)可知在鑒定結(jié)果中不同種微生物的相似度略有所差異，同種微生物的鑒定結(jié)果中相似度也不等。這是因?yàn)椋阂皇俏⑸飳?duì)不同碳源和氮源的利用程度不同；二是不同的微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率也有所不同；三是在不同的培養(yǎng)環(huán)境下生長(zhǎng)，生長(zhǎng)反應(yīng)出現(xiàn)不同，造成了某些孔通過光度法獲取的數(shù)據(jù)出現(xiàn)偏差。總之，目前多層過濾調(diào)整相似度算法能夠較為準(zhǔn)確地鑒定革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌。

2.2 與法國(guó)梅里埃微生物鑒定儀鑒定結(jié)果比較

通過對(duì)上述實(shí)驗(yàn)標(biāo)本再次用法國(guó)梅里埃公司的微生物鑒定方法進(jìn)行鑒定并將其鑒定結(jié)果參數(shù)與采用MASCA方法的結(jié)果參數(shù)進(jìn)行比較，比較結(jié)果如表2所示。與梅里埃鑒定算法相比較時(shí)，分別從檢準(zhǔn)率和相似度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差驗(yàn)證該算法的可行性。由表2可知，上述樣本兩種算法都得出了較好的鑒定結(jié)果。對(duì)于檢準(zhǔn)率，除陰溝腸菌B外，采用MASCA鑒定的其他微生物樣本檢準(zhǔn)率均高于或等于梅里埃算法。

表2 鑒定結(jié)果比較Tab.2 Comparisons of identification results

圖2 兩種算法鑒定成功次數(shù)的文氏圖Fig.2 Venn diagrams for the successful identification number of two algorithms

圖2中的數(shù)字5(2次陰溝腸桿菌B，3次銅綠假單胞菌)表示MASCA沒有鑒定成功而梅里埃鑒定成功的次數(shù)；79次為共同鑒定成功；10次(4次大腸埃希菌B，2次糞腸球菌，4次銅綠假單胞菌)表示MASCA鑒定成功而梅里埃沒有鑒定成功。本次實(shí)驗(yàn)總的鑒定成功率本儀器為94.7%，梅里埃為89.3%。由表2中相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差發(fā)現(xiàn)，5種微生物MASCA的鑒定結(jié)果均表現(xiàn)出比梅里埃算法更好的穩(wěn)定性。

通過以上的參數(shù)對(duì)比得出MASCA算法整體上對(duì)于已在醫(yī)院運(yùn)用的梅里埃算法有了進(jìn)一步的提高，這驗(yàn)證了該算法的有效性。

3 討論和結(jié)論

在通過基于光度法獲知每個(gè)板條各孔陰陽(yáng)性的基礎(chǔ)上，與標(biāo)準(zhǔn)模板數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，并對(duì)對(duì)比信息采用多層過濾調(diào)整相似度算法處理，以達(dá)到快速高效地鑒定微生物。大量的重復(fù)實(shí)驗(yàn)表明，MASCA具有較高的檢準(zhǔn)率和魯棒性；與梅里埃鑒定算法進(jìn)行對(duì)比時(shí)，MASCA表現(xiàn)出了較高的檢準(zhǔn)率和更強(qiáng)的魯棒性。因此，MASCA對(duì)于自動(dòng)化鑒定微生物具有重要的實(shí)踐意義。

在多次鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果中存在誤判現(xiàn)象，通過分析得出造成這種結(jié)果的原因有以下兩個(gè)方面：

1)微生物在培養(yǎng)時(shí)偶爾存在污染導(dǎo)致無法鑒定出結(jié)果，例如相鄰孔之間培養(yǎng)液互相侵入。

2)微生物培養(yǎng)時(shí)有大量的水蒸氣造成光度法對(duì)獲取的處理數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。這兩方面問題在現(xiàn)有鑒定儀中屬于共性問題。

針對(duì)上述兩種情況，首先調(diào)出誤判實(shí)驗(yàn)的樣本圖像，通過手動(dòng)輸入人工判讀，如果判讀成功就為第2種情況，否則為第1種情況而需要重做實(shí)驗(yàn)。

雖然目前已做重復(fù)實(shí)驗(yàn)微生物能夠獲得大部分微生物鑒定上的成功，但是還有一些未達(dá)到快速成功的鑒定。這主要是由于基于光度法獲取的陰陽(yáng)性本身信息量小，是此方法的一個(gè)瓶頸。針對(duì)此瓶頸提出基于時(shí)間序列法獲取更大信息量的假設(shè)?；跁r(shí)間序列法是通過一定時(shí)間間隔去采集實(shí)驗(yàn)微生物的信息，從而可以對(duì)每種微生物的每個(gè)孔擬合出一條微生物的生長(zhǎng)曲線。此方法可以獲取更多的微生物的信息，因此可以達(dá)到更快速更準(zhǔn)確地鑒定微生物，而基于時(shí)間序列法將是下一步的研究?jī)?nèi)容。

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Multi-Layer Adjusted Similarity Coefficient Algorithm Based on Photometric Method in Microbial Identification

Zhang Shaokang Lin Yong*

(SchoolofMedicalInstrumentandFoodEngineering,UniversityofShanghaiforScienceandTechnology,Shanghai200093,China)

multi-layer filter；similarity；microbial identification；photometric

10.3969/j.issn.0258-8021. 2016. 01.014

2015-07-09， 錄用日期:2015-08-11

國(guó)家自然科學(xué)基金(31100902, C060404)；上海市重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)基金(S30501)

R318

D

0258-8021(2016) 01-0114-05

*通信作者(Corresponding author)， E-mail: yong_lynn@163.com