納米酶在葡萄糖分析檢測中的應(yīng)用研究進展

羅 成 李 艷 龍啟文 龍建綱

1(宜春學(xué)院醫(yī)學(xué)院，宜春 336000)2(宜春職業(yè)技術(shù)學(xué)院，宜春 336000)3(西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院教育部生物醫(yī)學(xué)與信息工程重點實驗室線粒體生物醫(yī)學(xué)研究所，西安 710049)

納米酶在葡萄糖分析檢測中的應(yīng)用研究進展

羅 成1李 艷1龍啟文2龍建綱3*

1(宜春學(xué)院醫(yī)學(xué)院，宜春 336000)2(宜春職業(yè)技術(shù)學(xué)院，宜春 336000)3(西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院教育部生物醫(yī)學(xué)與信息工程重點實驗室線粒體生物醫(yī)學(xué)研究所，西安 710049)

即時、準確的監(jiān)控血糖和尿糖的變化對于糖尿病的早期診斷及血糖控制具有重要意義。自從2004年報道金納米簇具有磷酸轉(zhuǎn)移酶樣催化活性以來，多種具備酶樣催化活性的納米材料被發(fā)現(xiàn)，包括過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、氧化酶等。與天然酶相比，納米酶具有成本低廉、制備簡單、易于保存運輸、環(huán)境耐受性高等優(yōu)點。利用納米酶進行葡萄糖分析檢測有望降低檢測成本，提高檢測系統(tǒng)穩(wěn)定性。本文總結(jié)了金屬納米顆粒、金屬氧化物、金屬硫化物、碳基材料以及復(fù)合材料等多種納米酶檢測系統(tǒng)在葡萄糖分析檢測中的特點、檢測限和檢測范圍，并對納米酶研究面臨的挑戰(zhàn)及前景進行展望。

納米酶；過氧化物酶；葡萄糖氧化酶；葡萄糖

引言

葡萄糖被小腸絨毛細胞吸收后經(jīng)血液循環(huán)輸送至體細胞，是人體最主要的能量來源。胰島素能夠促進體細胞從血液中攝取葡萄糖，維持血糖水平的穩(wěn)定。胰島素分泌能力下降或者受體途徑功能缺陷會造成高血糖。長期高血糖容易導(dǎo)致糖尿病發(fā)生，增加心臟疾病、中風(fēng)、失明、腎衰竭、周圍神經(jīng)病變等風(fēng)險[1]。即時監(jiān)控血糖以及尿糖的變化有利于糖尿病的早期診斷及有效治療，因此高效、經(jīng)濟、靈敏的葡萄糖檢測分析系統(tǒng)異常重要。

納米技術(shù)是對至少有一維大小為1～100 nm的材料(如納米顆粒、納米棒、納米囊、納米管、薄膜以及富勒烯等)的科學(xué)、技術(shù)和工程研究的統(tǒng)稱。納米材料具有獨特的光、電、磁學(xué)性能，被廣泛應(yīng)用在光學(xué)儀器、電子設(shè)備、日常消費品等多種領(lǐng)域[2]，特別是輔助提高疾病診斷與治療的效率[3]。2004年Manea等發(fā)現(xiàn)巰基保護的金納米簇具有磷酸轉(zhuǎn)移酶樣催化活性，能夠催化磷酸基團轉(zhuǎn)移，并將其命名為納米酶(nanozyme)[4]。自此以后，納米酶領(lǐng)域得到了廣泛的關(guān)注并取得了一系列研究進展。除磷酸轉(zhuǎn)移酶外，研究發(fā)現(xiàn)納米材料還具有過氧化物酶、過氧化氫酶(鉑、四氧化三鈷)、超氧化物歧化酶(金-鉑、二氧化鈰)、氧化酶(金、四氧化三鈷、二氧化鈰、鐵酸鈷)、硝酸還原酶(硫化鎘-鉑)、尿酸酶(鉑)等多種酶樣活性。其中，過氧化物酶樣活性是納米材料中報道最多也是最廣泛的活性，多種納米材料包括金屬納米顆粒(鉑、金、鈀、銀以及合金等)、金屬氧化物(氧化鎳、氧化銅、三氧化二鐵、二氧化鈰、四氧化三鐵、四氧化三鈷、五氧化二釩、鐵酸鋅、鐵酸鈷等)、硫化物(硫化鎘、硫化銅、硫化鎢等)、碳材料(碳量子點、碳納米管、石墨烯等)、配位聚合物(普魯士藍)以及導(dǎo)電聚合物等都具有過氧化物酶樣活性[5]。本文中將具有酶樣催化活性的納米材料統(tǒng)稱為納米酶。和天然酶相比，納米酶具有生產(chǎn)方法簡單、成本低廉、環(huán)境耐受度高、易于儲存和運輸?shù)葍?yōu)點[6-7]。

葡萄糖氧化酶(GOx)法是目前臨床檢測血糖中最普遍的方法之一，具有操作簡便、特異性和準確性較高等優(yōu)點，其原理是：GOx催化葡萄糖氧化為葡萄糖酸和過氧化氫(H2O2)，H2O2在辣根過氧化物酶(HRP)催化下，將無色底物氧化生成有顏色的產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與葡萄糖的量成正比，通過檢測溶液的吸光度可以計算得到葡萄糖的濃度。納米酶具有的諸多優(yōu)點使其在葡萄糖檢測領(lǐng)域得到了廣泛的研究。利用具有過氧化物酶樣活性的納米酶替代HRP與GOx進行偶聯(lián)，GOx催化葡萄糖產(chǎn)生的H2O2在過氧化物酶樣納米酶的催化作用下氧化底物，產(chǎn)生顏色變化、化學(xué)發(fā)光或熒光變化等，測定這些變化可以用于體液中葡萄糖含量的測定，為糖尿病診斷以及治療提供有力支持。另外，部分種類納米酶具有GOx樣活性，可以催化葡萄糖氧化并生成H2O2，因此有望替代GOx應(yīng)用在葡萄糖檢測中。目前有多種基于納米酶的葡萄糖檢測系統(tǒng)(見圖1)，下面主要根據(jù)材料類別對納米酶的特點以及在葡萄糖分析檢測中的應(yīng)用研究進行介紹。

圖1 納米酶催化反應(yīng)測定葡萄糖示意Fig.1 Schematic diagram of glucose detection using nanozymes

1 金屬納米顆粒

除了磷酸轉(zhuǎn)移酶[4]，金納米顆粒還具有過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、過氧化物酶、GOx等多種酶樣活性[8-9]。Jv等發(fā)現(xiàn)金納米顆粒具有過氧化氫酶樣活性，能夠催化H2O2氧化3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)產(chǎn)生藍色產(chǎn)物[10]。類似于天然過氧化物酶，金納米顆粒在最適反應(yīng)條件下(pH:4，45℃)催化活性最高。此外，金納米粒子的大小以及表面電荷都會影響它的催化活性：粒徑越小則比表面積越大，單位質(zhì)量納米顆粒的表面活性催化位點越多，催化效率更高；正電荷半胱胺比負電荷檸檬酸及巰基乙酸修飾的金納米顆粒催化活性高。偶聯(lián)GOx和金納米顆?？梢杂糜谄咸烟呛繙y定(線性檢測范圍：18～1 100 μmol/L；檢測限：4 μmol/L)，GOx的底物特異性排除了葡萄糖類似物(如果糖、乳糖和麥芽糖)對檢測的干擾。Jiang等利用去鐵蛋白包裹的成對金納米簇催化TMB-H2O2反應(yīng)，反應(yīng)符合經(jīng)典米氏動力學(xué)以及乒乓反應(yīng)機制，與HRP相比，納米簇對環(huán)境的耐受度高(pH：0～12；溫度：4～80℃，2 h)[11]。偶聯(lián)GOx建立的葡萄糖檢測系統(tǒng)線性檢測范圍為2～10 mmol/L，接近健康人群以及糖尿病人群的血糖變化范圍，有望用于血液樣品的直接測定，減少樣品稀釋造成的誤差。Liu等在金納米棒上原位生成鉑納米點，該納米復(fù)合體可以將底物鄰苯二胺(OPD)氧化為黃色的2，3-二氨基吩嗪，對OPD的親和力遠遠高于HRP(70～900倍)，偶聯(lián)GOx可以實現(xiàn)葡萄糖的檢測(檢測限：45 μmol/L；線性檢測范圍：45～400 μmol/L)[12]。該納米檢測系統(tǒng)的獨特優(yōu)勢是鉑/金納米復(fù)合體中鉑/金的比率變化能夠調(diào)節(jié)對底物的親和力，并且還具有抗壞血酸氧化酶樣活性，能夠降低樣品中抗壞血酸對葡萄糖測定造成的干擾。

金納米顆粒具有的GOx活性也被用于葡萄糖檢測分析。Li等將CdTe量子點和金納米顆粒分別組裝在介孔二氧化硅微球核心和殼層中，金納米顆粒具有的GOx樣活性催化葡萄糖氧化，產(chǎn)生葡萄糖酸和H2O2，H2O2能夠淬滅微球內(nèi)部量子點的熒光[13]。根據(jù)量子點熒光強度的降低可以反推葡萄糖含量，檢測限低至1.32 μmol/L，而且多種物質(zhì)包括金屬陽離子(500 μmol/L Zn2+、1 000 μmol/L Mg2+、1 000 μmol/L K+、1 000 μmol/L Na+)和生物分子(500 μmol/L半胱氨酸、500 μmol/L苯丙氨酸、500 μmol/L賴氨酸以及250 μmol/L牛血清白蛋白)沒有對檢測系統(tǒng)造成干擾。Qu等將金納米顆粒組裝到V2O5納米線上，利用金納米顆粒的GOx樣活性以及V2O5納米線的過氧化物酶樣活性，對葡萄糖的檢測限為0.5 μmol/L[14]。Lin等充分發(fā)揮了金納米顆粒的多種酶樣活性，利用介孔二氧化硅作為裸露金納米顆粒的支持物，實現(xiàn)單一催化載體的級聯(lián)酶促反應(yīng)[15]。金納米顆粒的GOx樣活性催化葡萄糖氧化，葡萄糖酸含量增加導(dǎo)致溶液pH值降低，進而激活金納米顆粒的過氧化物酶樣活性，催化底物TMB生成藍色產(chǎn)物，利用該種自激活的級聯(lián)酶促反應(yīng)可以提高反應(yīng)條件的兼容性，增加偶聯(lián)酶促體系的穩(wěn)定性。對于GOx-過氧化物酶樣納米酶檢測體系而言，檢測特異性取決于GOx對葡萄糖的特異性識別和催化，因而檢測特異性好。金納米顆粒的GOx樣活性對底物的特異性不高，葡萄糖類似物如半乳糖等可能會對該類檢測結(jié)果造成一定干擾[16]。

Hu等利用BSA作為穩(wěn)定劑和還原劑合成了水溶性銅納米簇，其環(huán)境耐受能力強(pH：2～10；溫度：20～80℃，2 h)，催化TMB-H2O2反應(yīng)的最適pH為6.0，反應(yīng)結(jié)束后納米簇沒有明顯形態(tài)變化[17]。和HRP相比，銅納米簇達到最大反應(yīng)速率所需的H2O2濃度更高，提示其催化活性在高H2O2環(huán)境下更加穩(wěn)定。偶聯(lián)GOx測定葡萄糖含量的檢測限為100 μmol/L，線性檢測范圍為100～2 000 μmol/L。

Jiang等利用殼聚糖修飾的銀納米顆粒催化TMB氧化，而單寧酸、檸檬酸或者聚乙二醇修飾的銀納米顆粒沒有該催化性能，這可能是由于不同的表面修飾改變了銀納米顆粒的表面電荷，影響H2O2的結(jié)合以及電子轉(zhuǎn)移過程，進而導(dǎo)致不同的過氧化物酶樣活性[18]。殼聚糖修飾的銀納米顆粒偶聯(lián)GOx對葡萄糖的檢測限為0.1 μmol/L，線性檢測范圍為5～200 μmol/L。

Chen等合成了不同比例的鐵鈷合金納米顆粒，發(fā)現(xiàn)與單一的鐵納米顆粒以及鈷納米顆粒相比，其過氧化物酶樣活性顯著增強[19]。鐵鈷合金納米顆粒在長期儲存后仍保留多達85%酶樣活性，并具有較強的環(huán)境耐受性(pH：2～10；溫度：20～80℃，2 h)。該納米顆粒偶聯(lián)GOx對葡萄糖的檢測限為0.01 μmol/L，線性檢測范圍為0.5～10 μmol/L。該研究結(jié)果表明改變元素的組成以及比例，可以作為改善納米顆粒催化活性的有效手段。

2 金屬氧化物

磁性納米材料在藥物輸送、腫瘤熱療、磁共振成像、組織工程、生物傳感、生物分離和生化分析等領(lǐng)域得到了廣泛的研究和應(yīng)用[20]。自從Gao等報道Fe3O4納米顆粒具有過氧化物酶樣活性以來[21]，研究發(fā)現(xiàn)多種磁性納米材料可以通過催化H2O2分解為羥自由基，氧化底物而表現(xiàn)出過氧化物酶樣活性，偶聯(lián)GOx后可以用于葡萄糖含量測定[22-28]。

Wei等發(fā)現(xiàn)Fe3O4納米顆?？梢源呋疕2O2氧化2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)生成綠色產(chǎn)物(最適反應(yīng)條件 pH 4，45℃)，偶聯(lián)GOx測定葡萄糖的檢測限為30 μmol/L，線性檢測范圍為50～1 000 μmol/L[25]。Liu等將5,10,15,20-四(4-羧基苯基)卟啉(H2TCPP)交聯(lián)在Fe3O4納米顆粒表面形成H2TCPP-Fe3O4納米顆粒，H2TCPP增強了Fe3O4納米顆粒的過氧化物酶樣活性，最適反應(yīng)條件與HRP相似(pH 3.8，40℃)，環(huán)境耐受度較高(pH：1.70～10.57；溫度：5～80℃，2 h)[29]。和Fe3O4納米顆粒相比，H2TCPP-Fe3O4納米顆粒對H2O2的親和力更強，而對TMB的親和力相對較低。偶聯(lián)GOx測定葡萄糖的檢測限為2.21 μmol/L，線性檢測范圍為5～25 μmol/L，對同一批臨床血液樣本的測定結(jié)果與經(jīng)典葡萄糖檢測方法基本一致。比色法對設(shè)備要求低并可以通過肉眼觀察，但是靈敏度卻有限，利用反應(yīng)前后的熒光信號變化進行檢測，能夠提高Fe3O4納米酶系統(tǒng)對葡萄糖的檢測限(底物—檢測濃度)：amplex ultrared 3 μmol/L[30]；CdTe量子點1 μmol/L[31]；苯甲酸0.025 μmol/L[32]。大多數(shù)Fe3O4納米酶在酸性環(huán)境具有最佳反應(yīng)效率，而GOx最適反應(yīng)條件為中性環(huán)境，導(dǎo)致兩者偶聯(lián)檢測葡萄糖時需要進行分步反應(yīng)。將GOx和Fe3O4納米顆粒利用二氧化硅[33]或者酪蛋白[34]進行固定，可以提高GOx和Fe3O4催化活性的pH穩(wěn)定性及兼容性，從而將檢測過程集成到一步反應(yīng)，固定化還有利于穩(wěn)定酶樣活性從而進行多次循環(huán)使用。

Mu等發(fā)現(xiàn)Co3O4納米顆粒對反應(yīng)環(huán)境的耐受性較高：HRP在pH低于4或者溫度高于50℃時活性基本被抑制，而其在較寬范圍內(nèi)(pH：2～12；溫度：4～70℃)仍能保持酶樣活性[26]。此外，Co3O4納米顆粒能在高濃度H2O2環(huán)境中保持穩(wěn)定，偶聯(lián)GOx測定葡萄糖含量的線性范圍為10 μmol/L～10 mmol/L，檢測限為5 μmol/L。還原氧化石墨烯-Co3O4[35]或者卟啉-Co3O4[36]納米復(fù)合材料能夠增強Co3O4納米顆粒的過氧化物酶樣活性，葡萄糖測定的檢測限相應(yīng)降低至1 μmol/L和0.86 μmol/L。

除Fe3O4以及Co3O4納米顆粒外，其他磁性材料如γ-Fe2O3[6]、NiO[27]、MFe2O4(M=Mg、Ni、Cu、Co、Zn)[22-24,28,37-38]等都具有過氧化物酶樣活性。偶聯(lián)GOx測定葡萄糖含量的檢測限分別為: γ-Fe2O3為0.21 μmol/L[24]，NiFe2O4為0.45 μmol/L[28]，CoFe2O4為0.024 μmol/L[22]；殼聚糖修飾的CoFe2O4為0.01 μmol/L[37]，ZnFe2O4為0.3 μmol/L[23]。鑒于NiFe2O4納米顆粒還具有過氧化氫酶樣活性并且與過氧化物酶樣活性的反應(yīng)條件接近，可能會分解部分H2O2形成氧氣，影響檢測結(jié)果，因此在應(yīng)用NiFe2O4納米酶測定葡萄糖含量時需要謹慎優(yōu)化反應(yīng)條件[28]。

和其他納米酶類似，CuO也具有過氧化物酶樣活性，其對環(huán)境的耐受性也比較高(pH：3～12；溫度：4～90℃，2 h)，偶聯(lián)GOx測定葡萄糖的線性范圍為0.1～8 mmol/L[39]。Chen等利用魯米諾氧化產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光[40]、Hu等利用對苯二甲酸氧化生成熒光物質(zhì)[41]，CuO-GOx檢測系統(tǒng)測定葡萄糖的檢測限相應(yīng)降低為2.9 μmol/L或者1 μmol/L，且和經(jīng)典葡萄糖氧化酶法對同一批血清中葡萄糖含量的檢測結(jié)果基本一致。

Zhang等發(fā)現(xiàn)TiO2納米管陣列具有過氧化物酶樣活性，其最適反應(yīng)條件(pH 3.5，40℃)以及對底物的親和力與HRP接近，但是酶活性的環(huán)境穩(wěn)定性較高，偶聯(lián)GOx測定葡萄糖的線性范圍為0.4～3.6 mmol/L，該檢測體系測定糖尿病病人血糖含量與醫(yī)院分析檢測數(shù)據(jù)基本一致[42]。Zhao等發(fā)現(xiàn)CeO2表面高濃度Ce3+存在能夠提高CeO2/TiO2納米管的過氧化物酶樣活性，偶聯(lián)GOx測定葡萄糖的檢測限為6.1 μmol/L[43]。

3 金屬硫化物

近年來研究發(fā)現(xiàn)，大量金屬硫化物同樣具有過氧化物酶樣活性，如MoS2[44]、WS2[45-46]、CuS[47]、CdS[48]等，并被用于葡萄糖的檢測分析。

MoS2二維超薄層狀結(jié)構(gòu)在加氫脫硫、析氫反應(yīng)以及生物傳感器等應(yīng)用中極具潛力。Lin等發(fā)現(xiàn)MoS2納米片能夠通過促進TMB和H2O2之間的電子轉(zhuǎn)移以及催化H2O2分解為羥自由基，氧化TMB生成藍色產(chǎn)物，且納米片的形態(tài)、元素價態(tài)以及化學(xué)計量等在反應(yīng)前后沒有明顯變化[44]。除TMB外，MoS2納米片還可以催化H2O2氧化底物OPD及ABTS，生成相應(yīng)黃色及綠色產(chǎn)物。MoS2納米片在較寬pH范圍內(nèi)(2.0～7.5)催化活性都較高，但對溫度比較敏感，最適溫度為30℃。MoS2納米片偶聯(lián)GOx測定葡萄糖的線性范圍為5～150 μmol/L，檢測限為1.2 μmol/L，對臨床血液樣品的檢測結(jié)果與常用的檢測方法差別不大。結(jié)合瓊脂糖水凝膠，MoS2納米片可用于制備便攜式葡萄糖檢測試劑盒。

Lin等發(fā)現(xiàn)WS2納米片比MoS2納米片對環(huán)境耐受性更強，且在較寬溫度范圍內(nèi)(30～70℃)仍能保持較高的過氧化物酶樣活性[45]。和HRP相比，WS2納米片對底物H2O2有更高的親和力，需要更高TMB濃度以達到最大反應(yīng)速率。偶聯(lián)GOx測定葡萄糖的線性范圍為5～300μmol/L，檢測限為2.9 μmol/L，同樣可以用于開發(fā)便攜式葡萄糖檢測試劑盒。Chen等在WS2納米片上組裝血紅素，偶聯(lián)GOx測定葡萄糖的檢測限可以達到1.5 μmol/L[46]。

CuS被應(yīng)用于光催化劑、太陽能電池、光限幅、生物傳感器等領(lǐng)域。He等發(fā)現(xiàn)CuS納米片構(gòu)成的凹面狀超結(jié)構(gòu)具有過氧化物酶樣活性[49]。Dutta等發(fā)現(xiàn)CuS納米顆粒也具有過氧化物酶樣活性，其最適反應(yīng)條件(pH:4，40℃)與HRP接近，偶聯(lián)GOx測定葡萄糖含量的線性范圍為2～1 800 μmol/L，檢測限為0.12 μmol/L[47]。該體系與經(jīng)典葡萄糖氧化酶法檢測臨床人血清樣品中葡萄糖含量結(jié)果基本一致，表明該系統(tǒng)具有應(yīng)用于臨床檢測分析的潛力。

CdS的應(yīng)用領(lǐng)域與CuS類似，主要集中在太陽能電池、傳感器、發(fā)光二極管、光催化等領(lǐng)域。Liu等制備了H2TCPP-CdS納米復(fù)合材料，發(fā)現(xiàn)其具有較強的過氧化物酶樣活性，最適反應(yīng)條件為pH:3.8，50℃[48]。和HRP相比，H2TCPP-CdS納米復(fù)合材料對底物TMB具有更高的親和力，且在較高濃度H2O2下能夠維持酶樣活性。該納米復(fù)合材料偶聯(lián)GOx檢測葡萄糖的線性范圍為18.75～100 μmol/L，檢測限為7.02 μmol/L。

4 碳基材料

富勒烯[50]、碳量子點[51-52]、石墨烯量子點[53]、氮化碳[54]等碳基納米材料也具有過氧化物酶樣活性，并被應(yīng)用于葡萄糖含量測定。Li等制備的羧基化富勒烯對環(huán)境的耐受力遠遠高于HRP，在pH<5或者溫度高于50℃孵育2 h仍然能維持90%左右的催化活性，且在高濃度H2O2環(huán)境中催化活性穩(wěn)定性較高[50]。TMB分子通過π-π堆積作用吸附在羧基化富勒烯的碳籠表面，并提供孤對電子給碳籠，提高了碳籠的電子密度和電子流動性，碳籠的親水基團加速了電子向H2O2轉(zhuǎn)移，最適反應(yīng)條件為pH 3.5，45℃。羧基化富勒烯偶聯(lián)GOx檢測葡萄糖的線性范圍為1～40 μmol/L，檢測限為0.5 μmol/L，且對人血清樣品的分析數(shù)據(jù)與葡萄糖檢測試劑盒基本一致。Shi等利用蠟燭煙灰制備的碳量子點催化TMB-H2O2反應(yīng)(最適反應(yīng)條件pH 3.5，35℃)，環(huán)境耐受能力明顯強于HRP(pH：2～12；溫度：0～90℃，2 h)且對底物TMB的親和力更高，能夠在較高濃度H2O2下維持催化活性[51]。碳量子點偶聯(lián)GOx測定葡萄糖的線性范圍為1～500 μmol/L，檢測限為0.4 μmol/L。Zheng等利用石墨烯量子點[53]、Lin等利用石墨烯樣氮化碳[54]偶聯(lián)GOx測定葡萄糖的檢測限分別為0.5 μmol/L和1 μmol/L。

5 配位聚合物

由于獨特的電化學(xué)行為和結(jié)構(gòu)特征，普魯士藍被廣泛應(yīng)用在分子磁鐵、電致變色器件、儲能、腫瘤化療以及生物傳感器等領(lǐng)域。Zhang等證實普魯士藍納米顆粒具有過氧化物酶樣活性，催化ABTS-H2O2反應(yīng)的最適反應(yīng)條件為pH 4.0，50℃，對底物H2O2的親和力高于HRP，而對底物ABTS的親和力低于HRP[55]。普魯士藍納米顆粒偶聯(lián)GOx檢測葡萄糖的線性范圍為1～50 μmol/L，檢測限為0.03 μmol/L，該系統(tǒng)對人血清樣品葡萄糖含量的測定結(jié)果與常用檢測方法結(jié)果接近，誤差在5%以內(nèi)。

Wang等將普魯士藍納米顆粒填充在碳納米管內(nèi)，然后將GOx錨定在碳納米管表面，增強了普魯士藍納米顆粒對底物(TMB、H2O2)的親和力，拓寬了對葡萄糖檢測的線性范圍1～1 000 μmol/L[56]。

6 其他類型材料

碲化鎳納米線[57]、多金屬氧酸鹽[58]、硅量子點[59]、硒化錳[60]等納米材料也具有過氧化物酶樣活性，其最適反應(yīng)pH值與HRP接近，偶聯(lián)GOx檢測葡萄糖的靈敏度高，檢測限分別為0.42、0.1、0.05、0.085 μmol/L。

7 復(fù)合材料

將具有模擬酶樣活性的多種納米材料制備復(fù)合材料，能夠充分利用納米材料之間的相互作用，增強納米酶樣活性，提高葡萄糖的檢測靈敏度。Wang等在MoO3納米片上生長鉑納米顆粒，該雜合納米結(jié)構(gòu)的過氧化物酶樣活性比單獨鉑納米顆?；蛘進oO3納米片更強，對葡萄糖的檢測限低至0.187 μmol/L[61]。Xing等在石墨烯表面生成Fe2O3薄膜，該雜合納米材料同樣具有更強的過氧化物酶樣活性，對葡萄糖的檢測限為0.5 μmol/L[62]。此外含F(xiàn)e3O4的納米復(fù)合材料，如Fe3O4-金[63]、Fe3O4-氧化石墨烯[64]以及Fe3O4-石墨烯-鈀[65]雜合納米顆粒對葡萄糖的檢測限分別為0.5、0.74以及0.13 μmol/L。

8 總結(jié)與展望

大量納米材料由于其固有的納米酶樣活性，特別是過氧化物酶樣活性，能夠催化H2O2氧化底物，生成具有顏色變化、化學(xué)發(fā)光或熒光特性的產(chǎn)物，與GOx偶聯(lián)后可以用于葡萄糖含量測定。納米酶具有生產(chǎn)簡便、成本低廉、對環(huán)境耐受性強、酶活性穩(wěn)定等優(yōu)點，有望取代HRP應(yīng)用在分析檢測中。比色法對設(shè)備要求低，甚至肉眼即可分辨，熒光分析法和化學(xué)發(fā)光法則具有較高的檢測靈敏度；納米酶的種類不同，對應(yīng)的線性檢測范圍和檢測靈敏度也不同，線性檢測范圍及檢測限是衡量檢測方法的重要指標：線性檢測范圍寬可以減少樣品預(yù)處理(比如樣品稀釋)，檢測限低則提高了靈敏度，降低樣品消耗量。因此不同的納米酶檢測體系能夠滿足對精確度和便利性等的不同要求，擴大納米酶體系的適用范圍(見表1)。

表1 納米酶對葡萄糖的檢測限及線性檢測范圍

Tab.1 The detection limit and linear range for glucose by nanozymes

納米酶底物檢測限/(μmol/L)檢測范圍/(μmol/L)金納米顆粒[10]TMB418～1.1×103金納米簇[11]TMB2×103～1×104銅納米簇[17]TMB1×1021×102～2×103銀納米顆粒[18]TMB0.15～2×102鐵-鈷合金納米顆粒[19]TMB0.010.5～10鐵酸鈷納米顆粒[22]魯米諾0.0240.1～10鐵酸鋅納米顆粒[23]TMB0.31.25～18.75鐵酸鎳納米顆粒[28]ABTS0.450.94～25γ-三氧化二鐵納米顆粒[24]TMB0.211～80四氧化三鐵納米顆粒ABTS[25]3050～1×103TMB[29]2.215～25CdTe量子點[31]11.6～1.6×102氧化鎳納米顆粒[27]TMB2050～5×102四氧化三鈷納米顆粒[36]TMB0.861～10氧化銅納米顆粒[41]對苯二甲酸13～1×102氧化銅納米顆粒[40]魯米諾0.010.1～5二硫化鉬納米片[44]TMB1.25～1.5×102二硫化鎢納米片[45]TMB2.95～3×102硫化銅納米顆粒[47]TMB0.122～1.8×103硫化鎘納米顆粒[48]TMB7.0218.75～1×102C60-羧基富勒烯[50]TMB0.51～40碳點[51]TMB0.41～5×102石墨烯量子點[53]TMB0.50.5～2×102石墨烯樣氮化碳[54]TMB15～1×102普魯士藍納米顆粒[55]ABTS0.030.1～50碲化鎳納米線[57]ABTS0.421～50多金屬氧酸鹽[58]TMB0.10.1～1×102硅量子點[59]TMB0.050.17～2×102鉑納米顆粒-三氧化鉬納米片[61]TMB0.1875～5×102介孔三氧化二鐵-石墨烯復(fù)合納米材料[62]TMB0.50.5～10四氧化三鐵-金@介孔二氧化硅[63]TMB0.510～1.3×102石墨烯-磁性鈀雜合納米材料[65]TMB0.130.5～60金納米顆粒-五氧化二釩納米線復(fù)合納米材料[14]ABTS0.50～10金@鉑核/殼納米棒[12]OPD4545～4×102金納米顆粒@介孔二氧化硅微球[13]CdTe量子點1.325～2×102四氧化三鐵-酪蛋白復(fù)合納米顆粒[34]TMB13～1×103四氧化三鐵@介孔二氧化硅[33]TMB330～1×103二氧化鈰-二氧化鈦納米管[43]TMB6.110～5×102普魯士藍-碳納米管[56]TMB0.21～1×103

注：TOPS：N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽；4-APP：4-氨基安替比林。

Note: TOPS: N-ethyl-N(3-sulfopropyl)-3-methyl-aniline sodium salt; 4-AAP: 4-amino antipyrine.

模擬過氧化物酶樣活性并偶聯(lián)GOx是目前納米酶在葡萄糖含量測定中的主要模式。GOx具有天然酶共有的缺點，如制備過程復(fù)雜，保存條件要求高，容易變性失去催化活性等。大部分納米材料的過氧化物酶樣活性最適反應(yīng)pH約為4.0，這樣的酸性環(huán)境會加速GOx變性而失去催化活性，因此GOx-納米酶檢測體系需要分成2個獨立步驟，首先在中性環(huán)境(pH值約為7)GOx催化葡萄糖氧化生成H2O2，然后將溶液pH調(diào)節(jié)到約為4.0后利用納米酶催化底物氧化。酶促級聯(lián)反應(yīng)條件的不兼容性給實際應(yīng)用帶來一定困難。解決該問題的途徑可以分為兩個方面。一方面，對納米酶和GOx進行固定化，提高GOx和納米酶對環(huán)境的耐受性，增加酶促反應(yīng)條件的兼容性，同時提高酶系統(tǒng)穩(wěn)定性，增加循環(huán)使用次數(shù)[15,33-34]；另一方面，拓展模擬酶的催化類別，如改變納米顆粒表面活性基團[67]、形狀[68-69]等調(diào)節(jié)納米酶的催化活性，開展新型納米材料特別是復(fù)合材料的催化特性研究，探索GOx酶樣活性的納米材料。金納米顆粒是目前少有的具有GOx催化活性的納米材料。與GOx相比，金納米顆粒的GOx樣活性對底物的特異性不高[9,16]，是未來納米酶應(yīng)用研究中需要重點研究的問題之一。

通過對納米材料進行不同表面修飾，能夠改變納米酶對底物的親和力，進而調(diào)節(jié)納米酶的活性。Yu等利用檸檬酸、甘氨酸、聚賴氨酸、聚乙烯亞胺、羧甲基葡聚糖和肝素對Fe3O4納米顆粒進行處理，得到3種表面帶負電荷(N檸檬酸、N羧甲基葡聚糖、N肝素)以及3種表面帶正電荷(N甘氨酸、N聚賴氨酸、N聚乙烯亞胺)的納米顆粒，不同表面修飾的納米顆粒對具有2個氨基的TMB和具有2個磺酸基的ABTS的親和力存在差異：表面負電荷最多的N肝素納米顆粒在TMB為底物時過氧化物酶樣活性最高，而表面正電荷最多的N聚乙烯亞胺納米顆粒在ABTS為底物時過氧化物酶樣活性最高[67]。表面修飾甚至可以更改納米酶活性的類別，如半胱胺包被的金納米顆粒具有過氧化物酶樣活性[10]，而檸檬酸包被的金納米顆粒則具有GOx樣活性[9]。因此通過改變納米顆粒表面修飾調(diào)節(jié)納米酶的催化活性，有望進一步擴展納米酶在分析檢測中的應(yīng)用。

電化學(xué)生物傳感器在葡萄糖檢測中也具有非常廣泛的應(yīng)用，其發(fā)展經(jīng)歷了第1代經(jīng)典葡萄糖酶電極、第2代的介體葡萄糖酶電極以及第3代的直接葡萄糖酶電極[70-71]。以上幾代傳感器均利用GOx構(gòu)建葡萄糖識別元件，酶的活性容易受到環(huán)境的影響，開發(fā)具有GOx樣活性的納米酶替代天然GOx構(gòu)建葡萄糖傳感器，將具有結(jié)構(gòu)簡單、催化穩(wěn)定性高、使用壽命長等優(yōu)點，可進一步擴展生物傳感器在葡萄糖檢測中的應(yīng)用。

總之，提高納米酶的催化活性及底物特異性，探索新型納米材料以及復(fù)合納米材料的催化性能，拓展使用范圍及臨床應(yīng)用實踐等應(yīng)作為納米酶研究中重點關(guān)注的方面。納米技術(shù)的飛速發(fā)展，將極大的推進納米酶領(lǐng)域的研究和實踐。除用于開發(fā)快速、經(jīng)濟、便捷的葡萄糖檢測分析方法外，納米酶還可以應(yīng)用在其他分析物檢測(如乙醇、膽固醇、膽堿、乙酰膽堿、三聚氰胺、核酸、有機磷脂、重金屬離子等)、免疫測定、有機污染物降解、病原微生物防治以及腫瘤治療等方面，在其他科學(xué)研究、醫(yī)療以及生化分析領(lǐng)域等將獲得廣泛應(yīng)用。

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Recent Advances of Nanozymes in Glucose Detection

Luo Cheng1Li Yan1Long Qiwen2Long Jiangang3*

1(SchoolofMedicine,YichunUniversity,Yichun336000,Jiangxi,China)2(YichunVocationalTechnicalCollege,Yichun330000,Jiangxi,China)3(TheKeyLaboratoryofBiomedicalInformationEngineeringofMinistryofEducation,Xi’anJiaotongUniversitySchoolofLifeScienceandTechnology,Xi’an710049,China)

Instant and accurate detection of glucose level in blood and urine is of great significance to the early diagnosis and glucose monitoring of diabetes. Since gold nanocluster was found to have intrinsic phosphotransferase-like catalytic activity in 2004, various enzyme-like activities were reported in nanomaterials (nanozymes), such as peroxidase, catalase, superoxide dismutase and oxidase. Compared with natural enzymes, nanozymes are of low cost, easy to be prepared, stored and transported, resistant to harsh conditions. Application of nanozymes in glucose detection will prospectively reduce the costs and improve the stability. The recent advances of various nanozymes including nanoparticles of metal, metal oxides, metal sulfides, carbon based materials and composite materials were introduced with emphasis on their advantages over natural enzymes, limits in the detection and linear working range in glucose detection. Challenges and prospects regarding the nanozyme research were also outlined in this review.

nanozyme; peroxidase; glucose oxidase; glucose

10.3969/j.issn.0258-8021. 2016. 01.013

2015-09-18， 錄用日期:2015-11-27

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973)項目(2015CB856302)

R318

A

0258-8021(2016) 01-0105-09

*通信作者(Corresponding author)， E-mail:jglong@mail.xjtu.edu.cn