草珊瑚葉片總RNA提取方法及效果的比較研究

沈少炎，謝德金，吳玉香，榮俊冬，何天友，陳禮光，鄭郁善,*

（1．福建農(nóng)林大學(xué) 園林學(xué)院，福建 福州 350002；2．福建農(nóng)林大學(xué) 林學(xué)院，福建 福州 350002）

草珊瑚葉片總RNA提取方法及效果的比較研究

沈少炎1，謝德金2，吳玉香1，榮俊冬2，何天友1，陳禮光2，鄭郁善1,2*

（1．福建農(nóng)林大學(xué) 園林學(xué)院，福建 福州 350002；2．福建農(nóng)林大學(xué) 林學(xué)院，福建 福州 350002）

采用CTAB法、CTAB-LiCl法、CTAB-Trizol法、Trizol法、天根RNA提取試劑盒及百泰克RNA提取試劑盒提取草珊瑚（Sarcandra glabra）葉片總RNA，并通過微量紫外分光光度計、電泳檢測等對提取的結(jié)果進行了分析比較。結(jié)果表明：CTAB-LiCl法和天根RNA提取試劑盒比較適合提取草珊瑚葉片的總RNA。這兩種方法提取的總RNA的完整性和純度較高，無明顯的蛋白質(zhì)及其他雜質(zhì)污染，OD260/OD280的值在1.9～2.1，OD260/OD230在2.0～2.4。獲得質(zhì)量高、完整性好、純度高的總RNA，為后續(xù)構(gòu)建cDNA文庫以及相關(guān)基因的克隆提供了試驗基礎(chǔ)。

草珊瑚；RNA提??；CTAB-LiCl法；天根RNA提取試劑盒

草珊瑚(Sarcandra glabra) 是金粟蘭科（Chloranthaceae）草珊瑚屬（Sarcandra）[1]，多年生常綠草本或亞灌木，又名觀音茶、接骨木等[2]，是我國傳統(tǒng)的中藥材。草珊瑚全株可入藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)草珊瑚具有抗菌消炎、抑制流感病毒、促進骨折愈合以及抗腫瘤等藥效和生物活性[3～5]。利用分子生物學(xué)研究我國傳統(tǒng)中草藥已經(jīng)成為當今科研工作的趨勢。但是，關(guān)于草珊瑚分子生物學(xué)方面的探索才剛剛開始，包括如cDNA文庫的構(gòu)建、RNA印跡表達、基因克隆和基因表達分析等都是草珊瑚分子生物學(xué)研究的重要課題，開展這些研究的關(guān)鍵是提取高質(zhì)量的總RNA。關(guān)于植物總RNA提取方法及其改良方法已多有報道，但是由于不同植物及其不同部位都有各自的特點，這些特點又會反映在自身的結(jié)構(gòu)和組成上，沒有一種適合于所有植物總RNA的提取方法，必須針對不同植物的特點，對總RNA的提取方法進行相應(yīng)的改良，才能提高總RNA的質(zhì)量[6～7]。目前關(guān)于草珊瑚葉片的總RNA的提取方法尚未見報道。本試驗嘗試用6種方法從草珊瑚葉片中提取總RNA，并進行系統(tǒng)的分析和比較，以期找到一種理想的提取方法，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試劑儀器

以移植于福建農(nóng)林大學(xué)的5年生草珊瑚植株幼嫩葉片為材料，剪取葉片后用蒸餾水洗凈晾干后儲存至-80℃超低溫冰箱，備于后期進行液氮研磨提取。將研磨好的樣品分成6份，采用不同方法提取總RNA前稱量不同質(zhì)量的樣品。

試驗試劑藥品包括：CTAB提取緩沖液［2% CTAB，100 mmol·L-1Tris-HCl（pH=8.0），25 mmol·L-1EDTA( pH = 8.0)，2 mol·L-1NaCl，0.5 g·L-1亞精胺，2% PVP，2% β-巰基乙醇］；50×TAE緩沖液（2 M Tris-醋酸, 100 mM EDTA，使用前稀釋為1×TAE緩沖液）；0.1% DEPC處理水（1 ml DEPC，1 L超純水）；75%酒精；RNase-free水；10 mol·L-1LiCl；百泰克RNA提取試劑盒（RP3301，北京百泰克科技）；天根RNA提取試劑盒（DP441，北京天根生物）；Trizol（Thermo Fisher Scientific，USA）；DEPC（Amresco，USA）；無水乙醇、氯仿、酚/氯仿/異戊醇、異丙醇、β-巰基乙醇、PVP等均為國產(chǎn)國藥分析純。研缽于200℃烘烤2 h后直接放于-20℃預(yù)冷備用。一些未提及的溶液配制方法參見《分子克隆》[8]。

主要實驗儀器包括：電子天平、超凈工作臺、壓力蒸汽滅菌鍋、凝膠成像系統(tǒng)、制冰機、恒溫水浴鍋、北京六一電泳儀、Thermo公司的微量紫外分光光度計、超低溫冰箱。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取

1.2.1.1 CTAB法 參照Jamalnasir等方法[9]并做修改，具體步驟：（1）取新鮮葉片加入少許PVP，在液氮中快速研磨成粉末，將研磨好的葉片粉末0.1 g迅速轉(zhuǎn)移到預(yù)熱的1 ml CTAB緩沖液中，渦旋震蕩混勻后，65℃水浴20 min，每隔5 min渦旋混勻1次，使RNA充分析出，于4℃、12 000 r·min-1離心15 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的1.5 mL離心管中，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（25:24:1），上下顛倒混勻5 min；（2）同樣參數(shù)離心后，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中，加入等體積的氯仿抽提混勻，冰浴5 min；同樣參數(shù)離心后轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中，加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，上下顛倒混勻，-20℃沉淀2 h；（3）4℃下，12 000 r·min-1離心15 min后棄上清，用75%乙醇洗滌，將沉淀彈起，充分顛倒，4℃下，12 000 r·min-1離心15 min，棄上清，并用槍小心吸去殘留液體并吹干沉淀至無色透明；（4）用RNase-free水溶解沉淀，取出少量用于后續(xù)檢測，其余-70℃貯存。

1.2.1.2 CTAB-LiCl法 參照趙錦等方法[10]并做修改，具體步驟如下：（1）取新鮮葉片加入少許PVP，在液氮中快速研磨成粉末，將研磨好的葉片粉末0.15 g迅速轉(zhuǎn)移到預(yù)熱的1 ml CTAB緩沖液中，渦旋震蕩混勻后，65℃水浴20 min，每隔2 min混勻1次，使RNA充分析出，加入600 μL氯仿，上下顛倒混勻10 min，于4℃，12 000 r·min-1離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的1.5 mL離心管中，并重復(fù)操作；（2）加入1/4體積的10 mol·L-1LiCl溶液，4℃靜置過夜，同樣參數(shù)離心后，棄上清，以250 μL DEPC水溶解沉淀；（3）加等體積氯仿抽提2次，取上清并加入2倍體積的無水乙醇，-20℃沉淀2 h，相同參數(shù)離心后棄上清，用75%乙醇洗滌，將沉淀彈起，充分顛倒，于4℃，7 500 r·min-1離心10 min, 棄上清并小心棄除殘留的液體，風干沉淀至無色透明；（4）用RNase-free水溶解沉淀，取出少量用于后續(xù)檢測，其余-70℃貯存。

1.2.1.3 Trizol法 參照Chow等方法[11]并做修改，具體步驟：（1）取新鮮葉片用液氮在研缽中快速研磨成粉末，將研磨好的葉片粉末0.1 g轉(zhuǎn)入1 mL Trizol提取液中，渦旋震蕩2 min，室溫靜置5 min于4℃，12 000 r·min-1離心10 min；（2）轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中，加入0.2 mL氯仿，震蕩15 s后，室溫靜置2～3 min；（3）相同參數(shù)離心后取上層水相至新的離心管中并加入0.5 mL異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10 min；（4）4℃，12 000 r·min-1離心10 min，棄上清液并用1 mL 75%乙醇漂洗沉淀，使其從底部彈起懸?。唬?）相同參數(shù)離心后棄上清并風干沉淀；（6）用20 ～ 50 μL RNase-free水溶解沉淀，取出2～5 μL用于后續(xù)檢測，其余-70℃貯存。

1.2.1.4 CTAB-Trizol法 參照宋蓓等方法[12]并做修改，具體步驟：（1）第一步驟與CTAB法相同，將0.1 g粉末轉(zhuǎn)移到預(yù)熱的1 mL CTAB緩沖液中，渦旋震蕩混勻后，65℃水浴20 min，每隔5 min渦旋混勻1次，使RNA充分析出，于4℃，12 000 r·min-1離心10 min后取上清液加入0.7倍的異丙醇，混勻后室溫靜置10 min；（2）相同參數(shù)離心后棄上清，用RNase-free水溶解沉淀，加入1 mL Trizol提取液，200 μL氯仿，劇烈震蕩30 s；（3）相同參數(shù)離心后取上清液，加水至400 μL并加入300 μL 5 mol·L-1NaCl和300 μL異丙醇，充分混勻后冰浴20 min；（4）4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min，去上清液，加入預(yù)冷的75%乙醇使其從底部彈起懸??；（5）于4℃下，7 500 r·min-1離心5 min, 棄除上清液并風干10～15 min；（6）用20～50 μL RNase-free水溶解沉淀，取出2～5 μL用于后續(xù)檢測，其余-80℃貯存。

1.2.1.5 百泰克試劑盒法 參照百泰克公司植物總RNA提取試劑盒（RP3301）指導(dǎo)說明書進行，以30 μL RNase-free水溶解沉淀，取出2～5 μL用于后續(xù)檢測，其余-70℃貯存。

1.2.1.6 天根試劑盒法 參照天根公司RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒（DP441）指導(dǎo)說明書進行，以30 μL RNase-free水溶解沉淀，取出2～5 μL用于后續(xù)檢測，其余-70℃貯存。

1.2.2 總RNA檢測

1.2.2.1 總RNA的純度檢測 用NanoDrop2000c 微量紫外分光光度計測定樣品OD260/OD280，OD260/OD230的比值和總RNA的濃度。通常，OD260/OD280以及OD260/OD230的比值的范圍在1.8～2.1，說明核酸的雜質(zhì)較少、純度較高。1.2.2.2 總RNA完整性的檢測 取6種方法提取總RNA樣品，在1.2%的非變性瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，測定總RNA的完整性。RNA的完整性可以通過28S、18S以及5S的完整度及明亮度進行檢測。但是，由于植物葉片中含有大量葉綠體RNA，凝膠顯像中可見4條或更多rRNA。通常較完整的RNA的28S亮度是18S亮度的1.5～2.0倍，5S末端較銳利，不彌散，否則表示RNA樣品產(chǎn)生了降解，出現(xiàn)彌散片狀或條帶消失即表明樣品RNA嚴重降解[6～8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種總RNA提取方法的比較

用NanoDrop2000c測定不同提取方法的總RNA的OD260/OD280、OD260/OD230的比值以及總RNA的濃度結(jié)果（表1），通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性（圖1）。

表1 6種不同方法提取的草珊瑚葉片總RNA純度、濃度檢測比較Table 1 Comparison of the purity and yield of total RNA extracted by six methods in leaves of S. glabra

由圖1、表1可知，電泳圖CTAB-LiCl法和天根總RNA提取試劑盒法提取出的總RNA在28S、18S條帶清晰、完整、無彌散，加樣孔內(nèi)較干凈，OD260/OD280的比值范圍在1.9～2.1，說明沒有蛋白質(zhì)的污染，而OD260/OD230的比值大于2.0，說明RNA沒有鹽類等雜質(zhì)的干擾。但是CTAB-LiCl法在點樣孔附近有些微弱條帶，有輕微DNA污染。天根總RNA提取試劑盒法由于在實驗步驟中加入了DNA酶，消除了DNA存在的可能。從28S和18S條帶的亮度和完整度可知，CTAB-LiCl法得到的總RNA含量比較高，而天根試劑盒法得到的總RNA含量比較低；CTAB法得到的總RNA的完整性低，含量低，且有輕微DNA污染，但其純度較高；CTAB-Trizol法在點樣孔附近有蛋白殘留，且總RNA完整性低；Trizol法得到的總RNA有大量的DNA污染出現(xiàn)，且其完整性和純度不高，CTAB-Trizol法和Trizol法的試劑成分可能會影響提取結(jié)果，OD260/OD230含量較低，胍類等鹽分殘留較多；百泰克RNA提取試劑盒法提取出的總RNA完整性不高，含量低，有輕微DNA污染。

圖1 6種不同方法提取的草珊瑚葉片總RNA電泳檢測結(jié)果Figure 1 Electrophoretograms of total RNA extracted from leaves of S. glabra. by six different methods

圖2 CTAB-LiCl法提取的RNA純化前后電泳圖對比Figure 2 Comparison of electrophoretogram of RNA extracted

綜上所述，CTAB法、CTAB-Trizol法、Trizol法以及百泰克試劑盒都不適合提取草珊瑚的總RNA；CTAB-LiCl法提取草珊瑚葉片總RNA時需用DNA酶處理完后，再濃縮純化；天根總RNA提取試劑盒法可以直接用來快速、簡潔的提取草珊瑚葉片總RNA，但是得到的總RNA含量及成功率較低。試驗表明，采用CTAB-LiCl法以及天根試劑盒法提取草珊瑚總RNA較為合適，但需要進一步消除DNA的污染。

2.2 總RNA中的DNA去除及純化

把兩管CTAB-LiCl法所得的RNA合并，用DNase-I，RNase-free酶處理后，經(jīng)NaCl等純化濃縮處理后用20 μL體積的RNase-free水溶解沉淀，所得的RNA的完整性、純度、濃度均可達到要求，見圖2、表2。

采用CTAB-LiCl法提取后，再經(jīng)過純化，能夠看到清晰的條帶，28S與18S的熒光亮度接近2：1。條帶之間十分清晰并且沒有彌散發(fā)生，表明純化的RNA結(jié)構(gòu)完整，沒有產(chǎn)生降解。用此方法提取的RNA已經(jīng)達到了構(gòu)建了cDNA文庫的條件。

表2 總RNA去除DNA及純化前后的濃度及純度對比Table 2 Comparison of purity and yield of total RNA extracted by CTAB-LiCl before and after purification

3 討論與結(jié)論

提取高質(zhì)量、結(jié)構(gòu)完整的總RNA是植物分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，現(xiàn)今已有較多的植物RNA分離提取的報道[13～15]。草珊瑚含有豐富的黃酮類物質(zhì)，目前從草珊瑚中分離到的黃酮類化合物有24種[16～17]，黃酮類又被稱為多酚類化合物。此外，草珊瑚粗多糖的提取率為7.7%，其中多糖含量為13.2%[18]。草珊瑚是多年生草本或亞灌木，其組織富含多酚、多糖及其它次級代謝產(chǎn)物[16,19～20]。植物總RNA的提取方法有多種，對于特定植物選擇一種簡便、經(jīng)濟、快速的方法對于該種類植物的分子生物學(xué)研究十分的必要。

本試驗結(jié)合草珊瑚葉片中富含多酚、多糖及其它次級代謝產(chǎn)物較多的特點，利用CTAB，CTAB-LiCl，CTAB-Trizol，Trizol，天根試劑盒以及百泰克試劑盒6種方法來提取總RNA。其中CTAB-LiCl法以及天根試劑盒法比較適合提取草珊瑚葉片的總RNA。草珊瑚葉片中含有較多的多酚類和多糖類物質(zhì)，而酚類化合物在勻漿時容易被氧化成醌類物質(zhì)，能與RNA產(chǎn)生不可逆的結(jié)合，從而影響總RNA的提取質(zhì)量。目前，一般采用在提取的初始階段防止其被氧化，然后再將其與RNA分開[20～21]的方法來去除酚類物質(zhì)。采用CTAB-LiCl提取草珊瑚總RNA時，在初始階段加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和β-巰基乙醇來去除酚類化合物，而LiCl能選擇性地沉淀高分子量的RNA，這樣就可以去除DNA的干擾。同時，天根試劑盒在實驗初始階段中也加入了β-巰基乙醇，在實驗進程中加入了DNA酶去除了DNA的干擾。多糖的許多理化性質(zhì)與RNA相似，在提取過程中能與RNA共沉淀，很難將它們分開，在實驗中加入KAC（醋酸鉀）及無水乙醇可以去除大部分多糖。

本研究選擇的CTAB-LiCl法以及天根試劑盒法能夠有效的防止多酚及多糖物質(zhì)的干擾，獲得質(zhì)量高、完整性好、純度高的總RNA，能夠滿足草珊瑚后續(xù)cDNA文庫構(gòu)建、相關(guān)持家基因的克隆及相關(guān)基因功能的驗證提供了試驗基礎(chǔ)，并為其它植物RNA提取提供了試參考依據(jù)。

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典（一部）[M]. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005：154-155.

[2] 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會. 中國植物志(第二十卷 第一分冊)[M]. 北京：科學(xué)出版社，1982：79.

[3] 倪開誠，閔芳，郭衛(wèi)東，等. 采用ISSR分子標記進行草珊瑚8個種源的遺傳多樣性分析[J]. 中草藥，2008，9：1 392-1 396.

[4] He X F，Yin S，Ji Y C，et al. Sesquiterpenes and dimeric sesquiterpenoids from Sarcandra glabra[J]. J Nat Prod，2010，73(1)：45-50.

[5] Zhou H，Liang J，Lu D，et al. Characterization of phenolics of Sarcandra glabra by non-targeted high-performance liquid chromatography fingerprinting and following targeted electrospray ionisation tandem mass spectrometry/time-of-flight mass spectrometry analyses [J]. Food Chem， 2013，138(4)：2 390-2 398.

[6] 吳林，薛建平，徐有明，等. 半夏葉片總RNA四種提取方法及效果的比較[J]. 中草藥，2008，06：901-905.

[7] 王玉成，楊傳平，姜靜. 木本植物組織總RNA提取的要點與原理[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2002，2：1-4.

[8] 薛藝敏. 雷公藤葉片cDNA文庫的構(gòu)建與EST分析[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2013.

[9] Jamalnasir H，Wagiran A，Shaharuddin N A，et al. Isolation of high quality RNA from plant rich in flavonoids, Melastoma decemfidum Roxb ex. Jack[J]. Aust J Crop Sci，2013，7(7)：911-916.

[10] 趙錦，劉中成，代麗等. 棗不同器官和組織RNA提取方法的研究[J]. 植物遺傳資源學(xué)報，2009，10(1)：111-117.

[11] Chow K L，Tsang W H，Lee J T Y. Simple Modifications to Standard TRIzol? Protocol Allow High-Yield RNA Extraction from Cells on Resorbable Materials[J]. J Biomater Nanobiotechnol，2011，02(01)：41-48.

[12] 宋蓓，趙錦，劉孟軍，等. 改良CTAB-LiCl法提取棗總RNA體系的建立[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2007，7(23)：79-83.

[13] 譚麗麗，燕正民，徐亞英，等. 番茄葉片總RNA提取方法的比較[J]. 東北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，4(4)：29-32

[14] 王夢娜，武艷，程國山，等. 茶樹葉片總RNA提取方法的比較研究[J]. 植物生理學(xué)報，2013，49(1)：95-99.

[15] 白云鳳，郭志華，白冬梅，等. 馬鈴薯總RNA提取和鑒定方法的改進[J]. 園藝學(xué)報，2007，34(4)：1 059-1 062.

[16] 徐艷琴，劉小麗，黃小方，等. 草珊瑚的研究現(xiàn)狀與展望[J]. 中草藥，2011，12：2 552-2 559.

[17] 胡曉茹. 草珊瑚的化學(xué)成分研究[D]. 北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，2009.

[18] 邵佳，郁建平，胡美忠. 草珊瑚水溶性粗多糖提取及抗氧化性能研究[J]. 食品科學(xué)，2007，11：283-286.

[19] 陳瑾，迪麗拜爾·托乎提，郭衛(wèi)東. 五種提取草珊瑚葉片總DNA方法的比較研究[J]. 新疆師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2008，01：87-89.

[20] 李宏. 植物組織RNA提取的難點及對策[J]. 生物技術(shù)通報，1999，1：38-41.

[21] Loomis W D. Overcoming problems of phenolics and quinines in the isolation of plant enzymes and organelles[J]. Method Enzymol，1974，31: 528-545.

Comparison on Methods of Total RNA Extraction from Sarcandra glabra Leaves

SHEN Shao-yan1，XIE De-jin2，WU Yu-xiang1，RONG Jun-dong2，HE Tian-you1，CHEN Li-guang2，ZHENG Yu-shan1,2*
（1.Department of Landscape，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002,China；2.Department of forestry, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, 350002,China）

Experiments were conducted on total RNA extraction from Sarcandra glabra leaves by CTAB, CTAB-LiCl, CTAB-Trizol, Trizol, TIANGEN RNAprep Pure Plant Kit and Bio Teke RNApure Total RNA Plant kit. Comparisons were made on the extraction efficiencies by UV spectrophotometer detection and electrophoresis. The result showed that extraction by CTAB-LiCl and TIANGEN RNAprep Pure Plant Kit was better for total RNA in leaves of S. glabra, because the total RNA extracted by above two methods had better integrity and purity without obvious contamination like proteins and other impurities. The ratio of OD260/OD280was among 1.9-2.1, OD260/OD230among 2.0-2.4.

Sarcandra glabra; RNA extraction; CTAB-LiCl; TIANGEN RNAprep Pure Plant Kit

S567.9

A

1001-3776（2016）05-0040-05

2016-05-09；

2016-07-23

福建省科技重大專項（2004YZ02-05）資助；福建省科技創(chuàng)新平臺（2008Y2001）資助

沈少炎（1992-），男，碩士研究生，從事園林植物與觀賞園藝研究；*通訊作者。