H9和H6亞型禽流感病毒二重RT－PCR檢測方法的建立

李 丹，謝芝勛，宋德貴，李 孟，謝志勤，羅思思，謝麗基，黃 莉，范 晴，黃嬌玲

（1.廣西師范大學生命科學學院，桂林541000；2.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西獸醫(yī)生物技術重點實驗室，南寧530001）

H9和H6亞型禽流感病毒二重RT－PCR檢測方法的建立

李 丹1，謝芝勛2＊，宋德貴1，李 孟2，謝志勤2，羅思思2，謝麗基2，黃 莉2，范 晴2，黃嬌玲2

（1.廣西師范大學生命科學學院，桂林541000；2.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西獸醫(yī)生物技術重點實驗室，南寧530001）

摘 要：試驗旨在建立可同時鑒別檢測H9和H6亞型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）的二重RT－PCR方法。根據(jù)GenBank中H9和H6亞型AIV的HA基因保守序列，分別設計2對特異性引物，優(yōu)化引物濃度與退火溫度等條件，建立了可同時鑒別檢測H9和H6亞型AIV的二重RT－PCR檢測方法。用該法對H9和H6亞型AIV混合感染樣品、H9亞型AIV單一感染樣品和H6亞型AIV單一感染樣品進行擴增，結(jié)果均得到對應的目的條帶，而對其余亞型AIV及其他禽病病原體均未擴增出特異性條帶。該法對H9和H6亞型AIV的檢測下限均為5×104拷貝／μL。本研究建立的二重RT－PCR檢測方法特異性強、敏感性高、穩(wěn)定性和重復性良好，可同時鑒別檢測H9與H6兩種亞型AIV，為H9與H6亞型AIV的監(jiān)測提供技術支撐。

關鍵詞：禽流感病毒；H9亞型；H6亞型；二重RT－PCR

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）屬于正黏病毒科、A型流感病毒屬。根據(jù)AIV表面的血凝素蛋白（hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶蛋白（neuraminidase，NA）抗原的差異可劃分為18種HA亞型（H1～H18）和10種NA亞型（N1～N10）［1－4］。另外，根據(jù)病毒對雞致病性的強弱又可將其分為低致病性禽流感病毒（low pathogenic avian influenza，LPAIV）和高致病性禽流感病毒（highly pathogenic avian influenza，HPAIV）［5］。長期以來，因為LPAIV造成的家禽損失較小而往往被人們忽視和輕視。近年來研究結(jié)果表明，LPAIV可通過基因重組進而造成人類流感的大流行，其中H9與H6亞型AIV就是這類LPAIV中較重要的兩個亞型。有研究結(jié)果表明，近年來新出現(xiàn)的可感染人的H7N9、H10N8、H6N1和H5N6亞型流感病毒的部分基因來自H9N2亞型禽流感病毒［6－9］。1997年香港地區(qū)發(fā)現(xiàn)的感染人的高致病性H5N1亞型AIV的7個基因來源于H6亞型禽流感，這表明低致病性H6亞型AIV有可能為H5亞型HPAIV提供內(nèi)部基因［10］。2013年5月，中國臺灣地區(qū)發(fā)現(xiàn)了首例H6N1亞型AIV直接感染人的病例［11］。另外，血清學抗體調(diào)查結(jié)果表明H9與H6亞型AIV都可感染人［12－13］。因此，H9與H6亞型AIV對人類公共衛(wèi)生安全具有重要意義，引起了廣泛的關注。

病毒分離鑒定是AIV檢測的一種經(jīng)典方法，但該方法存在檢測周期較長的缺點。目前檢測AIV的方法主要是血清學和分子生物學方法，而血清學方法需要標準陽性血清，具有一定的局限性［14］。分子生物學檢測方法具有快速準確等優(yōu)點，特別是多重PCR具有操作簡便、特異性強、敏感性高、省時省力等特點而得到了廣泛應用［15］。近年來，廣西動物疫病病原生物學與診斷重點實驗室對廣西地區(qū)的低致病性禽流感進行了持續(xù)的流行病學監(jiān)測，研究結(jié)果表明H6與H9亞型AIV在家禽中較常見且有混合感染的情況存在［16］。H9與H6亞型AIV混合感染具有相似的臨床癥狀且傳統(tǒng)的檢測方法費時，難以及時準確的得到診斷結(jié)果。因此，本研究旨在建立一種可同時檢測H9與H6亞型AIV的二重RT－PCR檢測方法，以期快速準確的鑒別兩種亞型AIV，為感染人的禽流感亞型的監(jiān)測提供技術支撐，具有重要的公共衛(wèi)生意義。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1毒株 H1N7、H3N2、H6N1、H6N2、H6N8、H9N2及H9N6亞型AIV毒株、新城疫病毒（NDV）、雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）、雞毒支原體（MG）、禽呼腸孤病毒（ARV）及雞傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）均由廣西動物疫病病原生物學與診斷重點實驗室保存；H2N3、H4N5、H8N4、H10N3、H11N3、H12N5、H13N5亞型AIV毒株均由香港大學惠贈；H5N2、H7N2、H14N5、H15N9、H16N3亞型AIV的RNA均由美國賓夕法尼亞州立大學惠贈。

1.1.2試劑 SPF雞胚購自北京梅里亞公司；MLV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP和RNA酶抑制劑、DL2000 DNA Marker、pMD18－T載體均購自TaKaRa公司；DNA／RNA抽提試劑盒、2×TransTaq－T PCR SuperMix、膠回收試劑盒和質(zhì)粒抽提試劑盒均購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1引物設計與合成 根據(jù)GenBank中H9和H6亞型AIV的HA基因序列，運用DNAStar軟件進行比對，比較出保守序列，以雞源H9N2亞型AIVHA基因（登錄號：KU762372.1）和鴨源H6N8亞型HA基因（登錄號：JX304762.1）為參考序列，運用Primer Premier 5.0軟件，設計篩選出2對特異性引物，并通過BLAST驗證。引物由北京六合華大基因有限公司合成。引物序列見表1。

表1　引物序列Table 1 Sequences of primers

1.2.2病毒RNA／DNA提取與RNA反轉(zhuǎn)錄 參照DNA／RNA抽提試劑盒使用說明書對試驗中所用到的AIV、NDV、ARV和IBV的RNA及ILTV的DNA進行抽提，抽提后的DNA／RNA用33μL DEPC水溶解。RNA病毒抽提產(chǎn)物參照反轉(zhuǎn)錄酶說明書進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，所有產(chǎn)物置于－30℃保存。

1.2.3二重RT－PCR反應體系及條件的優(yōu)化二重PCR反應體系25μL：2×TransTaq－T PCR SuperMix 12.5μL，H9與H6亞型AIV cDNA共2μL作為模板，引物H9－F、H9－R、H6－F和H6－R（25pmol／μL）各加入0.1～1.0μL，10個梯度進行引物濃度的優(yōu)化，最后用超純水補至25μL。根據(jù)試驗效果對退火溫度及時間進行優(yōu)化，最終確定最佳的反應體系及條件。

1.2.4特異性試驗 運用所建立的二重RTPCR檢測方法按照優(yōu)化好的反應條件對H1N7、H2N3、H3N2、H6N1、H6N2、H6N8、H8N4、H9N2、H9N6、H10N3、H12N5、H13N5、H14N1、H15N5、NDV、ARV、IBV和ILTV的RNA／DNA進行檢測，驗證該方法的特異性。

1.2.5標準品的制備 參考文獻［17］的方法，用HA全長基因的引物，分別以H9N2與H6N2為模板進行RT－PCR擴增，得到其HA基因全長目的片段，并將這兩個基因片段分別連接到pMD18－T載體上。將含有H9與H6亞型AIV的HA基因片段序列的重組載體分別命名為H9－T和H6－T。用質(zhì)粒抽提試劑盒提取H9－T和H6－T的質(zhì)粒，并用NanoDrop ND－1000微量核酸檢測儀對其進行濃度測定，根據(jù)分子質(zhì)量和核酸濃度計算對應的拷貝數(shù)，將H9－T與H6－T等拷貝數(shù)混合，并進行10倍倍比稀釋，以得到H9－T與H6－T質(zhì)粒DNA濃度均為5× 109至5×101拷貝／μL的標準品。

1.2.6敏感性試驗 運用所建立的H9和H6亞型AIV二重RT－PCR的檢測方法對H9－T與H6－T質(zhì)粒濃度為5×109至5×101拷貝／μL的樣品進行特異性擴增，檢測該方法的敏感性。

1.2.7穩(wěn)定性和重復性試驗 取H9、H6亞型AIV的cDNA及同一批PCR檢測試劑于－30℃冰箱放置1和2個月，進行PCR檢測。兩次試驗各做3個重復。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，驗證該方法的穩(wěn)定性和重復性。

1.2.8臨床樣品檢測 運用建立的二重RTPCR檢測方法對活禽市場采集的120份雞、鴨咽喉及泄殖腔拭子進行檢測，同時將病料處理后接種SPF雞胚進行病毒分離鑒定，并進行HA基因全長的測定。將上述結(jié)果進行比較，驗證二重RT－PCR的檢測結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1二重RT－PCR條件的優(yōu)化

通過對H9與H6亞型AIVHA基因2種引物濃度的測定及擴增溫度時間等的優(yōu)化，最終確定二重PCR最佳反應體系25μL：2×TransTaq－T PCR SuperMix 12.5μL，H9與H6亞型AIV cDNA共2μL，引物H9－F和H9－R（25pmol／μL）各0.5μL，引物H6－F及H6－R（25pmol／μL）各0.8μL，超純水補至25μL。最終優(yōu)化的反應條件為：94℃預變性3min；94℃變性30s，53℃退火45s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；72℃延伸5min，最后4℃結(jié)束反應。

2.2特異性試驗

由圖1可知，本試驗建立的二重RT－PCR方法對H9及H6亞型AIV混合感染樣品檢測出2條特異性的條帶，分別為551bp（H9亞型）及222bp（H6亞型）；對H6N1、H6N2、H6N8亞型AIV檢測結(jié)果僅出現(xiàn)1條特異性條帶，片段大小為222bp；對H9N2與H9N6亞型AIV進行擴增也均只檢測出1條特異性條帶，片段大小為551bp；對其他亞型AIV和常見的禽病病原體均未擴增出任何條帶，結(jié)果表明該方法具有良好的特異性。

2.3敏感性試驗

由圖2可知，運用本試驗建立的二重RT－PCR方法針對5×109至5×101拷貝／μL的H9與H6亞型的AIV質(zhì)粒模板進行擴增，結(jié)果顯示，對濃度為5×109至5×104拷貝／μL的H9與H6亞型的AIV均有2條明顯的特異性擴增條帶出現(xiàn)，片段大小分別為551、222bp；對濃度≤5×103拷貝／μL的H9與H6亞型AIV均無擴增條帶。由此可見，該法最低能檢測到質(zhì)粒模板量為5×104拷貝／μL的H9與H6亞型AIV。

圖1　特異性試驗結(jié)果Fig.1 The results of specificity test

圖2　敏感性試驗結(jié)果Fig.2 The results of sensitivity test

2.4穩(wěn)定性和重復性試驗

由圖3可知，運用本試驗建立的二重RT－PCR方法對－30℃冰箱中放置1和2個月的H9、H6亞型AIV的cDNA及同一批PCR檢測試劑進行檢測，結(jié)果顯示，對H9與H6亞型AIV仍能擴增出2條明顯的特異性條帶，片段大小分別為551、222bp，結(jié)果表明該方法穩(wěn)定性和重復性良好。

圖3　穩(wěn)定性和重復性試驗結(jié)果Fig.3 The results of repeatability and stability test

2.5 臨床樣品檢測

運用該方法對廣西動物疫病病原生物學與診斷重點實驗室從南寧活禽市場采集的120份雞和鴨口腔及泄殖腔的棉拭子樣品進行檢測，結(jié)果顯示有6份樣品為H9與H6亞型AIV陽性，陽性率為5%， 33份樣品能擴增出551bp的目的條帶，為H9Nx AIV，15份樣品能擴增出222bp的目的條帶，為H6Nx AIV，部分臨床樣品檢測結(jié)果見圖4。上述結(jié)果與病毒分離鑒定和HA基因測序結(jié)果100%相符，表明該方法具有一定的實用性。

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圖4　部分臨床樣品檢測結(jié)果Fig.4 The detection results of some clinical samples

3 討 論

H9與H6亞型AIV雖然為LPAIV，但有調(diào)查研究結(jié)果表明在部分地區(qū)健康青年體內(nèi)檢測到了H9與H6亞型AIV的抗體，這一結(jié)果表明H9與H6亞型禽流感在部分人群中存在隱性感染的情況［12－13］。近年來，有研究證實這兩種LPAIV還為HPAIV提供內(nèi)部基因［6－7］，甚至出現(xiàn)了這兩種亞型禽流感直接跨越種間屏障傳染給人的案例［11，18－19］，對公共衛(wèi)生安全構成了極大的危害，從而引發(fā)了對這兩種AIV研究的廣泛關注。

近年來，廣西動物疫病病原生物學與診斷重點實驗室對廣西地區(qū)家禽和野禽中不同亞型的LPAIV進行持續(xù)的流行病學監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)家禽和野禽感染H9與H6亞型LPAIV的比例較高，這與趙國等［20］對華東地區(qū)LPAIV的監(jiān)測結(jié)果基本一致。H9與H6亞型毒株是否為廣西地區(qū)流行的LPAIV提供內(nèi)部基因尚不清楚，還有待于進一步深入調(diào)查與研究。目前，對于H9與H6亞型AIV的混合感染迫切需要一種能快速有效地檢測和鑒別H9與H6亞型AIV的方法，為LPAIV流行病學的監(jiān)測及研究兩種AIV的遺傳變異情況提供技術支撐。

傳統(tǒng)的病原學分離鑒定與血清學檢測方法操作相對復雜、耗時長且檢測敏感度低，相對而言多重RT－PCR鑒于其方便快捷、靈敏度高等優(yōu)點得到了更多的關注［15，21］。本研究成功建立了H9與H6亞型AIV二重RT－PCR檢測方法，該方法一管的檢測便可確定H9與H6亞型AIV的感染，也可確定單一H9或H6亞型AIV的感染，且其對H9及H6 AIV的檢測下限均為5×104拷貝／μL，與羅思思等［14］、徐倩等［22］所建立的只能單獨檢測H9或H6亞型AIV的檢測方法相比更為簡便、快速。運用該方法針對H9與H6亞型AIV的HA基因都能擴增出與設計相符的特異性片段，針對其他亞型AIV及其他禽類疾病的擴增結(jié)果均為陰性，表明其特異性強；對該方法進行敏感性試驗，最低可檢測出5× 104拷貝／μL的H9與H6亞型AIV的模板量，表明其敏感性高。針對該方法進行穩(wěn)定性和重復性試驗的結(jié)果顯示對同一批樣品所做的3次重復性試驗均能得到明顯的目的條帶，而試驗樣品在－30℃儲存一段時間后再用于樣品檢測，其檢測的效果并未發(fā)生改變，表明該方法穩(wěn)定性和重復性良好。臨床樣品檢測結(jié)果與血凝抑制試驗的鑒定結(jié)果相符，表明其具有一定的實用性。

4 結(jié) 論

本試驗建立了可同時鑒別檢測H9和H6亞型AIV的二重RT－PCR方法，該方法特異性強、敏感性高、穩(wěn)定性和重復性良好，為H9與H6亞型AIV的快速鑒別診斷提供了一種更為有效的檢測方法。

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（責任編輯 董曉云）

中圖分類號：S852.65

文獻標識碼：A

文章編號：1671－7236（2016）12－3101－06

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.003

收稿日期：2016－04－25

基金項目：國家“萬人計劃”領軍人才專項（2016－37－88）；廣西科技項目（2013GXNSFDA019015、AD163800009、14123001－8）；廣西水產(chǎn)畜牧局科研項目（桂漁牧科201204930、201452001）

作者簡介：李 丹（1990－），女，廣西桂林人，碩士生，研究方向：微生物學，E－mail：1176231278＠qq.com

通信作者：＊謝芝勛（1963－），二級研究員，碩士生導師，研究方向：預防獸醫(yī)學，E－mail：xiezhixun＠126.com

Development of a Duplex RT－PCR Assay for Detection of H9and H6Subtype AIV

LI DAN1，XIE Zhi－xun2＊，SONG De－gui1，LI Meng2，XIE Zhi－qin2，LUO Si－si2，XIE Li－ji2，HUANG Li2，F(xiàn)AN Qing2，HUANG Jiao－ling2
（1.CollegeofLifeSciences，GuangxiNormalUniversity，Guilin541000，China；2.GuangxiKeyLaboratoryofVetrinaryBiotechnology，GuangxiVeterinaryResearchInstitute，Nanning530001，China）

Abstract：This experiment was aimed to develop a method for simultaneous detection of H9and H6subtype avian influenza virus（AIV）.Two pairs of specific primers were designed according to the conserved regions sequences of H6and H9AIVHAgene，a duplex RT－PCR simultaneous detection of H9and H6subtype AIV was developed by optimizing the PCR system such as the concentration of different primers and annealing temperature.It showed that all samples could be amplified specific bands from H9subtype AIV single infection samples or H6subtype AIV single infection samples，and the samples mix infection these two subtypes AIV.No specific bands of the same sizes were amplified from genomic materials of other avian pathogens.The detection limit of the duplex RT－PCR was 5×104copies／μL.It suggested that this duplex RT－PCR assay was a specific，sensitive，stable and repeatable method for detection of H9and H6subtype of AIV，and could provide technical support for the monitoring of H9and H6subtype AIV.

Key words：avian influenza virus；H9subtype；H6subtype；duplex RT－PCR