復(fù)方黃芪養(yǎng)心合劑對SD大鼠冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后心室及血管周圍膠原重構(gòu)的影響

陳啟蘭祝光禮龔一萍任興昌齊國安赫小龍

復(fù)方黃芪養(yǎng)心合劑對SD大鼠冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后心室及血管周圍膠原重構(gòu)的影響

陳啟蘭1祝光禮1龔一萍2任興昌3齊國安4赫小龍1

目的觀察復(fù)方黃芪養(yǎng)心合劑（CAMNH）對SD大鼠冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后心室及血管周圍膠原重構(gòu)（VR）的影響。方法SD大鼠47只隨機(jī)取假手術(shù)組（SO組）8只。其余39只行冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎術(shù)，觀察10天，存活29只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為三組，復(fù)方黃芪養(yǎng)心合劑組（CAMNH組）、美托洛爾緩釋片組（MSSRT組）每組10只，心臟重構(gòu)組（VR組）9只，CAMNH組MSSRT組予相應(yīng)藥物灌胃，VR組和SO組予蒸餾水灌胃，共計(jì)8周。計(jì)算全心室質(zhì)量與體質(zhì)量比（Vt/Wt）；使用改良Masson染色法觀察大鼠心室重構(gòu)，用Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，計(jì)算心肌組織膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）和血管周圍膠原面積（PVCA）。結(jié)果Vt/Wt：MSSRT組小于VR組［（2.77±0.26）%比（3.06±0.21）%，P＜0.05］；CAMNH組明顯小于VR組［（2.67±0.17）%比（3.06± 0.21）%，P＜0.01］。CVF與PVCA：MSSRT組及CAMNH組與VR組比較明顯降低［（43.89±6.83）%、（42.60±17.55）%比（59.01±6.93）%；（101.8±49.7）%、（104.1±41.2）%比（148.1±69.3）%；P＜0.01］。結(jié)論復(fù)方黃芪養(yǎng)心合劑能夠減輕冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后SD大鼠Vt/Wt，降低VR大鼠CVF、PVCA，作用

大鼠；冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后；心臟重構(gòu)；復(fù)方黃芪養(yǎng)心合劑；美托洛爾；心肌組織膠原容積分

心室重構(gòu)（ventriclar remodeling，VR）是在各種損傷及繼發(fā)性因素作用下所造成的心肌結(jié)構(gòu)、功能的變化，心肌細(xì)胞外基質(zhì)及血管周圍膠原沉積和纖維化是VR的重要表現(xiàn)之一，使心肌僵硬度增加，造成心力衰竭[1]。近年來冠心病越來越成為臨床常見病[2]，由于心肌缺血、梗死造成的冠心病心室重構(gòu)也越來越多見。本研究觀察復(fù)方黃芪養(yǎng)心合劑（compound astragalus mixture nourishing heart，CAMNH）對SD大鼠冠脈結(jié)扎術(shù)后心室及血管周圍膠原重構(gòu)的干預(yù)作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性清潔級Sprague-Dawley （SD）大鼠47只，體質(zhì)量180～220g，8～10周齡，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK（滬）2008-0016。飼養(yǎng)條件：飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，分籠飼養(yǎng)，每籠5只，清潔飼養(yǎng)室保持恒溫（20℃），相對濕度40%～60%；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙）2008-0115。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 CAMNH處方組成和制劑工藝：黃芪（批號(hào)101010）、黨參（批號(hào)101005）、太子參（批號(hào)101013）、苦參（批號(hào)101022）、丹參（批號(hào)101023）、甘松（批號(hào)101019）各20g，炙甘草10g（批號(hào)101018），生山楂15g（批號(hào)101007），單味中藥均由浙江省臨安市中藥藥材有限公司提供。將各藥加水煎煮2次，第一次1.5h，第二次0.5h，由杭州市中醫(yī)院藥劑制劑室制備成生藥濃度為2g/mL的生藥煎劑，4℃冰箱保存。對照藥物：美托洛爾緩釋片（metoprolol succinate sustained-release tablets，MSSRT）（47.5mg/片，批號(hào)m14438）由阿斯特拉（無錫）制藥有限公司提供。

1.3 主要試劑和儀器 戊巴比妥鈉（規(guī)格：25g/瓶，上海西唐，批號(hào)WS20080118）；Masson三色染色試劑盒（MST-8003/8004，福州邁新）；DH-150動(dòng)物人工呼吸機(jī)（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠）；Medlab-U/4CS生物信號(hào)采集儀（南京美易科技有限公司）；病理組織漂烘處理儀（常州效區(qū)中威電子儀器廠）；LEICA RM 2235輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（LEICA，德國）；BX-51 OLYMPUS顯微鏡（Olympus，日本）；Microview MVC 1000圖像采集儀（Olympus，日本）；Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics，美國）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大鼠冠脈結(jié)扎術(shù)后心室重構(gòu)（ventricular remodeling，VR）模型的建立 大鼠急性心肌梗死制作參考徐叔云等[3]的方法通過左冠狀動(dòng)脈前降支高位結(jié)扎并略作改進(jìn)[4]。結(jié)扎術(shù)后觀察15min，關(guān)閉胸腔，擠出殘余空氣，逐層縫合胸壁組織，做好麻醉后復(fù)蘇及保暖工作。假手術(shù)（sham-operated，SO）組除不結(jié)扎冠脈左前降支外，其余步驟相同。全程記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖并存盤。

2.2 動(dòng)物分組 47只大鼠隨機(jī)取假手術(shù)組（SO組）8只。其余39只大鼠行冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎術(shù)，術(shù)后縫合，觀察10天，存活29只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為三組，復(fù)方黃芪養(yǎng)心合劑組（CAMNH組）、美托洛爾緩釋片組（MSSRT組）每組各10只，心臟重構(gòu)組（VR組）9只。CAMNH組按14g/［7mL/（kg·d）］劑量灌胃；MSSRT組按9.5mg/［7mL/（kg·d）］劑量，將MSSRT研細(xì)，稱重，加蒸餾水溶解后灌胃；VR組和SO組均按蒸餾水7mL/（kg·d）灌胃，共計(jì)8周。

2.3 指標(biāo)檢測

2.3.1 心電圖 冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后10周，各組大鼠麻醉，記錄心電圖30s。

2.3.2 全心室質(zhì)量與體質(zhì)量比 稱體質(zhì)量（weight，Wt，g），麻醉，開胸，取下大鼠心臟，用生理鹽水洗凈血污，去除左右心房、心耳，用吸水紙吸去水分，稱全心室質(zhì)量（ventricle weight，Vt，g），計(jì)算全心室質(zhì)量與體質(zhì)量比（Vt/Wt，%）。

2.3.3 HE及改良Masson染色觀察 標(biāo)本的取材與處理：取下大鼠心臟，用生理鹽水洗凈血污，去除左右心房、心耳、右心室，用吸水紙吸去水分，取結(jié)扎以下部分，從心尖至心底部垂直心臟縱軸方向，將心臟切成3個(gè)組織塊，厚度約2～3mm（視組織塊縱徑長短而定），取2個(gè)組織塊置于4%中性福爾馬林溶液內(nèi)固定24h。將心肌組織用不同濃度酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，按肌肉橫斷面切片（厚度3μm），65℃下過夜烤干備用。

HE染色：組織切片于病理組織漂烘處理儀60℃烤片1h，二甲苯脫蠟二次，再依次梯度酒精脫水和蒸餾水水化，HE常規(guī)染色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡觀察心肌缺血情況。用彩色攝像機(jī)采集圖像（×200）。

改良Masson染色：組織切片于病理組織漂烘處理儀60℃烤片1h，二甲苯脫蠟二次，再依次梯度酒精脫水和蒸餾水水化，吸取Masson復(fù)合染色液染色，去離子水洗兩次；吸取磷鉬酸液適量滴至標(biāo)本上，5min后傾去，去離子水涮洗兩次；吸取苯胺藍(lán)適量滴至標(biāo)本上，5min后傾去；直接滴加鹽酸酒精分化液適量，30～60s后傾去，×2次；無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡觀察心肌細(xì)胞與膠原纖維情況。用彩色攝像機(jī)采集圖像（×400）。用Image Pro plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，測量心肌組織膠原容積分?jǐn)?shù)（collagen volume fraction，CVF，%）和血管周圍膠原面積（perivascular collagenvolume area，PVCA，%）。CVF（%）=膠原面積/總面積×100%，PVCA （%）=小動(dòng)脈管腔周圍膠原面積/動(dòng)脈管腔面積× 100%，每一標(biāo)本均至少取5個(gè)視野測量，計(jì)算其均值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（±s） 表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活情況 左前降支冠脈結(jié)扎成功率為100%。冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)中死亡8只，術(shù)后觀察期間死亡2只，術(shù)后第6周末存活29只，存活率74.4%。術(shù)后第6周CAMNH組死亡2只，術(shù)后第10 周VR組死亡1只，余均存活至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

3.2 心電圖改變 手術(shù)前，大鼠心率多數(shù)高于400 次/min，P波、QRS波、T波正?？杀?；左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎即刻Ⅱ?qū)?lián)R波振幅明顯抬高，ST段抬高＞0.2mV，T波、ST段與R波融合形成單向曲線，持續(xù)至手術(shù)結(jié)束，證明造模成功[4]。冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后10周，大鼠心率250～450bpm，VR組、CAMNH組及MSSRT組均可見Q波形成、QRS波及ST-T改變，部分可見早搏；SO組P波、QRS波、T波正?？杀?。VR 組R波振幅減小，ST段與T波融合，T波深倒；MSSRT組：QRS波振幅增加，ST段明顯壓低并與T波融合；CAMNH組：QRS波振幅減小，ST段明顯壓低并與T波融合，可見早搏（圖1）。

圖1 大鼠冠脈左前降支結(jié)扎術(shù)后Ⅱ?qū)?lián)心電圖改變

3.3 各組大鼠Vt/Wt、CVF、PVCA比較 Vt/Wt（%）VR組明顯重于SO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；MSSRT組小于VR組（P＜0.05），但是顯著大于SO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；CAMNH組明顯小于VR組（P＜0.01），與SO組相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），CVF（%）：VR組與SO組相比明顯增高（P＜0.01）。MSSRT組與VR組相比明顯降低（P＜0.01），與SO組相比明顯增高（P＜0.01）。CAMNH組與VR組相比明顯降低（P＜0.01）；與SO組相比明顯增高（P＜0.01）；與MSSRT組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。PVCA（%）：VR組與SO組相比明顯增高（P＜0.05）。MSSRT組與VR組相比明顯降低（P＜0.01）；與SO組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。CAMNH組與VR組相比明顯降低（P＜0.01）；與SO組MSSRT組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠Vt/Wt、CVF、PVCA比較（%，±s）

表1 各組大鼠Vt/Wt、CVF、PVCA比較（%，±s）

注：與VR組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與SO組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01；SO：假手術(shù)組；VR：心臟重構(gòu)組；MSSRT：復(fù)方黃芪養(yǎng)心合劑組；CAMNH組：美托洛爾緩釋片組；Vt/Wt：心室質(zhì)量/體質(zhì)量；CVF：心臟組織膠原容積分?jǐn)?shù)；PVCA：血管周圍膠原面積

3.4 病理形態(tài)學(xué)觀察 摘取大鼠心臟時(shí)肉眼可見SO組心臟體積正常，心肌組織彈性良好，顏色鮮紅，表面光滑；VR組、MSSRT組、CAMNH組心臟體積變大，顏色暗紅，心肌組織彈性較差，梗死區(qū)室壁顏色灰白，其中VR組最為明顯。

HE染色光鏡下觀察可見SO組心肌橫紋清晰，心肌纖維排列整齊，胞漿染色均勻，胞核清楚，未見炎性細(xì)胞浸潤（圖2-A，封四）。VR組可見典型心肌梗死，梗死區(qū)心肌橫紋消失，心肌纖維溶解斷裂，心肌細(xì)胞斷裂、核固縮、結(jié)構(gòu)破壞，排列紊亂，伴有炎性細(xì)胞浸潤及部分毛細(xì)血管新生；非梗死區(qū)心肌纖維排列整齊，心肌橫紋清晰可見；梗死區(qū)與非梗死區(qū)之間邊界清晰可見（圖2-B，封四）。MSSRT組、CAMNH組病變較VR組明顯減輕（圖2-C、D，封四）。

改良Masson染色光鏡下觀察，可清晰顯示心肌細(xì)胞呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)色（圖3，封四）。SO組心肌間隙有少量散在膠原纖維（圖3-A，封四）；VR組紅色的心肌細(xì)胞與藍(lán)色的膠原纖維均有廣泛分布并有交界，位于梗死區(qū)與非梗死區(qū)交界處，交界處可見紅色的心肌細(xì)胞與藍(lán)色的膠原纖維交錯(cuò)分布，大鼠心肌梗死區(qū)有大量膠原堆積，并可見壞死的不完整心肌細(xì)胞（圖3-B，封四）。MSSRT組與CAMNH組可見有藍(lán)色的膠原沉積于梗死區(qū)，但較VR組減輕（圖3-C、D，封四）。

心肌內(nèi)冠狀動(dòng)脈周圍可見藍(lán)色的膠原纖維環(huán)繞，有向細(xì)胞間質(zhì)呈放射狀分布的趨勢（圖4，封四）。SO組在冠脈周圍僅見少量膠原纖維分布（圖4-A，封四），VR組可見在冠脈周圍大量的膠原增生，并向血管周圍的間質(zhì)延伸（圖4-B，封四）。心肌血管周圍膠原沉積MSSRT組、CAMNH組與VR組相比有明顯減少（圖4-C、D，封四）。

4討論

心室重構(gòu)過程一方面是指心肌細(xì)胞肥厚，心肌細(xì)胞凋亡、壞死、增生，甚至纖維化；另一方面指細(xì)胞外基質(zhì)的膠原沉積和纖維化。在VR進(jìn)程中，以炎性細(xì)胞因子升高為標(biāo)志的免疫激活及膠原代謝異常發(fā)揮著重要作用[5]。心肌膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，它在維持心臟結(jié)構(gòu)和功能方面起重要作用。正常時(shí)膠原的生成和降解在體內(nèi)處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，病理?xiàng)l件下，膠原的增多或減少都會(huì)引起及心肌纖維化，加重心衰。趙淑明等[6]研究證明葶藶生脈方可調(diào)節(jié)慢性心力衰竭大鼠心肌膠原的代謝，改善心功能。沈祥春等[7]研究發(fā)現(xiàn)太子參對急性心肌梗死心力衰竭大鼠心室重構(gòu)有改善作用。池一凡等[8]研究認(rèn)為，黃芪可以延緩心肌纖維化及VR的進(jìn)展。王偉[9]發(fā)現(xiàn)益氣養(yǎng)陰活血解毒中藥可縮小AMI后心室重構(gòu)大鼠心肌梗死面積，抑制膠原蛋白合成、減少心肌肥厚、心肌纖維化。

本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方黃芪養(yǎng)心合劑能明確降低Vt/ Wt，其作用與美托洛爾緩釋片相當(dāng)。在間質(zhì)膠原重構(gòu)方面可觀察到心室重構(gòu)心肌間質(zhì)纖維化和血管周圍纖維化并存，CVF、PVCA增大。復(fù)方黃芪養(yǎng)心合劑能明顯降低CVF，抑制心肌間質(zhì)纖維化，其作用與美托洛爾緩釋片相當(dāng)；復(fù)方黃芪養(yǎng)心合劑能明顯降低PVCA，抑制心肌血管周圍纖維化，其作用與美托洛爾緩釋片相當(dāng)。

心肌梗死后的心室重構(gòu)（VR）包括膠原增生和左室的增大，屬中醫(yī)“胸痹”、“虛勞”等范疇。該病為本虛標(biāo)實(shí)之證，主要由于心肌梗死后局部心肌血脈流行不暢，心肌供血不足，又兼手術(shù)損耗心肌之氣血，氣血虧虛，日久形成虛勞，造成心臟的擴(kuò)大。冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎術(shù)后心脈流行不暢，阻塞心脈，脈絡(luò)閉塞，導(dǎo)致水濕內(nèi)停，化為濕濁。虛、瘀、濕、濁諸邪蓄積以致濁瘀內(nèi)結(jié)，致心肌梗死后心肌纖維化。故而認(rèn)為心肌梗死后VR的中醫(yī)病機(jī)主要為氣血虧虛、濁瘀內(nèi)結(jié)。

復(fù)方黃芪養(yǎng)心合劑為院內(nèi)制劑，長期臨床實(shí)踐顯示，應(yīng)用復(fù)方黃芪養(yǎng)心合劑治療冠心病心臟擴(kuò)大患者，可有效緩解胸悶、胸痛、氣短乏力、心悸心慌等癥，改善VR及心功能。之前的研究[4，10]證實(shí)，復(fù)方黃芪養(yǎng)心合劑可改善大鼠缺血再灌注室性心律失常，可改善大鼠缺血再灌注心肌細(xì)胞縫隙連接蛋白43 （connexin43，Cx43）的分布改變。CAMNH由黃芪、黨參、太子參、苦參、炙甘草、丹參、甘松、山楂等八味中藥組成，方中黃芪、黨參、太子參共同補(bǔ)益心氣，丹參、生山楂活血祛瘀、養(yǎng)血安心，甘松理氣，苦參清熱燥濕，炙甘草益氣和中，全方共起益氣養(yǎng)血、祛瘀化濁之功效。

本研究提示，在冠脈結(jié)扎術(shù)后心肌梗死所致的VR心肌纖維化血管周圍纖維化的動(dòng)物模型中，CAMNH對心臟重構(gòu)、心肌間質(zhì)和血管周圍膠原重構(gòu)兩方面都有顯著的抑制作用，其具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步探討。

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（收稿：2015-01-15 修回：2015-05-15）

Effects of Compound Astragalus Mixture Nourishing Hearton Ventricle Remodeling and Perivascular Colla－gen Fibration in Rats

CHEN Qilan1,ZHU Guangli1,GONG Yiping2,Ren Xingchang3,QI Guoan4,HE Xiaolong1.1 Department of Internal Medicine,Hangzhou Traditional Chinese Medical Hospital,Hangzhou(310007),China; 2 Faculty of Traditional Chinese Medical Diagnosis,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China; 3 Department of Pathology,Hangzhou Traditional Chinese Medical Hospital,Hangzhou(310007),China;4 Department of Internal Medicine,Xiaoshan District Traditional Chinese Medical Hospital of Hangzhou,Hangzhou(311201),China

ObjectiveTo investigatethe effects of compound astragalus mixture nourishing heart（CAMNH）on ventricleremodeling（VR）and perivascularcollagen fibration in SD rats after coronary artery ligation.MethodsEight out of 47 SD rats were randomly selected to receive sham operation（SO）.Another 39 SD rats receivedligation of coronary artery and 29 rats survived after 10 d.The survived rats were randomlydivided into 3 groups:CAMNH group,metoprolol succinate sustained-release tablets（MSSRT）group and VR group.Rats in CAMNH and MSSRT groups were treated withCAMNH（14g·kg-1·d-1）or MSSRT（9.5mg·kg-1·d-1）for 8 weeks.Rats in SO and VR groups were given distilled water intragastrically.The ratio of weight（Wt,g）and ventricleweight（Vt,g）was calculated（Vt/Wt,%）.The VR of rats was observed with upgrading Masson staining and collagen volume fraction（CVF,%）and perivascular collagenvolume area（PVCA,%）were measured with Image Pro Plus 6.0 software.ResultsVt/Wt（%）in MSSRT group and CAMNH groupwere lower than that in VR group（2.77%±0.26%,2.67%±0.17%vs 3.06%± 0.21%,P＜0.05 or 0.01）.CVF（%）and PVCA（%）in MSSRT group and CAMNH group were significantly decreased compared to VR group（CVF:43.89%±6.83%,42.60%±17.55%vs 59.01%±6.93%;PVCA:101.8%±49.7%, 104.1%±41.2%vs 148.1%±69.3%;P＜0.01）.ConclusionCAMNH can reduce Vt/Wt（%）and CVF（%）and PVCA（%）in SD rats after ligation of coronary artery.The effects is similar to MSSRT.

rats;after ligation of coronary artery;cardiac remodeling;compound astragalus mixture nourishing heart;metoprolol;collagen volume fraction;perivascular collagenvolume area

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2008YB012）

1杭州市中醫(yī)院心血管內(nèi)科（杭州 310007）；2浙江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)教研室（杭州 310053）；3杭州市中醫(yī)院病理科（杭州310007）；4浙江省杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院內(nèi)科（杭州 311201）

陳啟蘭，Tel：13588750941，E-mail：1469013813@qq.com

與美托洛爾緩釋片相當(dāng)。

數(shù)；血管周圍膠原面積