Gli-1、ZEB2蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)變化及意義

楊雯，張曉偉，胡睿，胡建功(泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東泰安271000)

Gli-1、ZEB2蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)變化及意義

楊雯，張曉偉，胡睿，胡建功(泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東泰安271000)

目的 探討Gli-1、E盒結(jié)合鋅指蛋白2(ZEB2)蛋白在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法選擇結(jié)腸癌組織標(biāo)本(結(jié)腸癌組)和相應(yīng)癌旁正常結(jié)腸組織標(biāo)本(癌旁組)各38例份，同期正常結(jié)腸組織10例份(正常對(duì)照組)。采用免疫組化SP法檢測(cè)各組Gli-1、ZEB2蛋白表達(dá)，分析其與結(jié)腸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，分析結(jié)腸癌組織Gli-1、ZEB2蛋白表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果結(jié)腸癌組Gli-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)23例份(60.5%)，癌旁組為5例份(13.2%)，正常對(duì)照組為1例份(10.0%)；結(jié)腸癌組ZEB2蛋白陽(yáng)性表達(dá)21例份(55.3%)，癌旁組為13例份(34.2%)，正常對(duì)照組為2例份(20.0%)；結(jié)腸癌組Gli-1、ZEB2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于癌旁組和正常對(duì)照組(P均<0.05)，癌旁組和正常對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)腸癌組織Gli-1、ZEB2蛋白陽(yáng)性表達(dá)與患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)(P均<0.05)，與性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度均無(wú)關(guān)(P均>0.05)。結(jié)腸癌組織Gli-1與ZEB2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.723，P<0.01)。結(jié)論結(jié)腸癌組織Gli-1、ZEB2蛋白表達(dá)升高，其異常表達(dá)可能與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

結(jié)腸癌；HH信號(hào)通路；Gli-1；E盒結(jié)合鋅指蛋白2

結(jié)腸癌是臨床常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在我國(guó)居全部惡性腫瘤的第4位。結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，其發(fā)病可能與生活方式、遺傳、腺瘤、炎癥等有關(guān)。最新研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤的發(fā)生涉及一系列原癌基因的異常激活以及抑癌基因突變等，從而引起信號(hào)通路發(fā)生傳導(dǎo)異常[1]。HH信號(hào)通路參與正常胚胎發(fā)育及組織修復(fù)等過(guò)程，其異常激活在多種人類惡性腫瘤中普遍存在。Gli-1是HH信號(hào)通路的下游轉(zhuǎn)錄因子，激活后可啟動(dòng)細(xì)胞核內(nèi)目的基因的表達(dá)[2]。而E盒結(jié)合鋅指蛋白2(ZEB2)可以通過(guò)與靶基因啟動(dòng)子區(qū)E-box結(jié)合，參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。本研究探討Gli-1和ZEB2蛋白在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年3～10月泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院手術(shù)切除的結(jié)腸癌組織標(biāo)本(結(jié)腸癌組)和相應(yīng)癌旁正常結(jié)腸組織標(biāo)本(癌旁組)各38例份，術(shù)后組織病理檢查明確診斷?；颊吣?4例，女14例；年齡43～73歲、中位年齡58歲，≥58歲28例、<58歲10例；腫瘤直徑≤3 cm 20例，>3 cm 18例；TNM分期[2]：Ⅰ、Ⅱ期15例，Ⅲ、Ⅳ期23例；分化程度：高分化10例，中分化19，低分化9例；組織學(xué)類型均為腺癌；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例，無(wú)轉(zhuǎn)移16例。術(shù)前未進(jìn)行放化療以及其他免疫治療，無(wú)其他部位腫瘤發(fā)生。選擇同期結(jié)腸鏡下活檢得到的正常結(jié)腸組織10例份作為正常對(duì)照組。

1.2 結(jié)腸組織Gli-1、ZEB2蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化SP法。取三組組織標(biāo)本，均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚度切片。常規(guī)進(jìn)行HE染色和免疫組化染色，方法如下：切片脫蠟及水化，高壓修復(fù)，依次加入兔抗人Gli-1多克隆抗體(1∶100)和鼠抗人ZEB2單克隆抗體(1∶50)、Ⅰ抗、Ⅱ抗以及新鮮配置的DAB顯色。自來(lái)水沖洗，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，自來(lái)水沖洗。碳酸鋰返藍(lán)，經(jīng)梯度乙醇脫水干燥后二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。由兩名病理科醫(yī)生于顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞比例。Gli-1蛋白主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，ZEB2蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，以出現(xiàn)淡黃或棕黃色顆粒視為陽(yáng)性染色。陽(yáng)性細(xì)胞比例<5%定義為陰性表達(dá)，≥5%定義為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3 結(jié)腸癌組織Gli-1、ZEB2蛋白表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 分析結(jié)腸癌組織Gli-1、ZEB2蛋白表達(dá)患者性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。分析結(jié)腸癌組織Gli-1、ZEB2蛋白表達(dá)的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以率表示，結(jié)果比較采用χ2檢驗(yàn)；組織Gli-1、ZEB2蛋白表達(dá)的關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組Gli-1、ZEB2蛋白表達(dá)比較 結(jié)腸癌組Gli-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)23例份(60.5%)，癌旁組為5例份(13.2%)，正常對(duì)照組為1例份(10.0%)；結(jié)腸癌組ZEB2蛋白陽(yáng)性表達(dá)21例份(55.3%)，癌旁組為13例份(34.2%)，正常對(duì)照組為2例份(20.0%)；結(jié)腸癌組Gli-1、ZEB2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于癌旁組和正常對(duì)照組(P均<0.05)，癌旁組和正常對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.2 結(jié)腸癌組織Gli-1、ZEB2蛋白陽(yáng)性表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 結(jié)腸癌組織Gli-1、ZEB2蛋白陽(yáng)性表達(dá)與患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)(P均<0.05)，與性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度均無(wú)關(guān)(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 結(jié)腸癌組織Gli-1、ZEB2蛋白陽(yáng)性表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 結(jié)腸癌組織Gli-1與ZEB2蛋白表達(dá)的關(guān)系 Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織Gli-1與ZEB2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.789，P<0.01)。

3 討論

HH信號(hào)通路由HH蛋白、Ptch跨膜蛋白、Gli家族等下游轉(zhuǎn)錄因子組成，其在多種腫瘤組織中被激活[3]。Gli是HH信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要組成部分，包括Gli-1、Gli-2、Gli-3，均含有高度保守的DNA結(jié)合區(qū)。Gli-1處于HH信號(hào)通路的最末端，直接調(diào)控目的基因的表達(dá)，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4]。Cavicchiol等[5]對(duì)62例份胃癌組織中的Gli-1蛋白進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Gli-1蛋白在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常胃黏膜組織。郭杰芳等[6]研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌患者癌組織、癌旁組織、正常癌旁組織的Gli-l陽(yáng)性表達(dá)率分別為68%、24%、0，推測(cè)Gli-l檢測(cè)有助于判斷胰腺癌患者的分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況等。王俊菊等[7]研究顯示，口腔鱗狀細(xì)胞癌與正?？谇火つそM織Gli-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為65.0%和0。Kou等[8]研究結(jié)果提示，Gli-1蛋白表達(dá)與腫瘤的侵襲能力具有相關(guān)性。périgny等[9]研究提示，皮膚基底細(xì)胞癌Gli-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)90%以上。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組Gli-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于癌旁組和正常對(duì)照組，癌旁組和正常對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明結(jié)腸癌組織中Gli-1蛋白表達(dá)升高；結(jié)腸癌組織Gli-1蛋白表達(dá)與患者的TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度無(wú)關(guān)，說(shuō)明結(jié)腸癌組織中Gli-1蛋白表達(dá)升高可能與其發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指上皮細(xì)胞失去上皮特征的同時(shí)獲得間質(zhì)細(xì)胞表型和轉(zhuǎn)移能力的一種生物學(xué)現(xiàn)象。在腫瘤轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，癌細(xì)胞通過(guò)EMT實(shí)現(xiàn)對(duì)周圍組織的浸潤(rùn)；而在種植部位，癌細(xì)胞通過(guò)間質(zhì)細(xì)胞-上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化(MET)最終形成與原發(fā)灶在形態(tài)結(jié)構(gòu)上相似的轉(zhuǎn)移灶[10]。ZEB家族是誘導(dǎo)MET的因素之一，ZEB2高表達(dá)可以促進(jìn)間質(zhì)性標(biāo)志物如基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)家族的表達(dá)，誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。ZEB家族還可與其他參與EMT發(fā)生的調(diào)節(jié)因素相互聯(lián)系，形成一個(gè)作用于EMT的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[11]。周文娟等[12]發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織ZEB2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常宮頸黏膜組織，ZEB2蛋白高表達(dá)與宮頸癌的分化程度、FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且可作為宮頸癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，與Mejlvang等[13]觀點(diǎn)一致。Oztas等[14]研究提示，ZEB2蛋白在肺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率可達(dá)70%，正常肺組織中則未見(jiàn)表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組ZEB2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于癌旁組和正常對(duì)照組，癌旁組和正常對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明結(jié)腸癌組織中ZEB2蛋白表達(dá)升高；結(jié)腸癌組織ZEB2蛋白表達(dá)與患者的TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度均無(wú)關(guān)，說(shuō)明結(jié)腸癌組織中ZEB2蛋白表達(dá)升高可能與其發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。分析原因，可能是ZEB2蛋白在抑制E-cadherin表達(dá)的同時(shí)激活了MMP1、MMP2、MMP14等，誘導(dǎo)EMT發(fā)生，從而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲[15]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織Gli-1、ZEB2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，提示ZEB2可能是Gli-1的下游因子，仍需進(jìn)行深入研究。

綜上所述，結(jié)腸癌組織Gli-1、ZEB2蛋白表達(dá)升高，并可能促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展。但本研究未對(duì)兩者行mRNA及DNA水平檢測(cè)，未能證實(shí)兩者是否為組成型激活。

[1] Gellad ZF, Provenzale D. Colorectal cancer: national international perspective on theburden of disease and public health impact[J]. Gastroenterology, 2010,138(6):2177-2190.

[2] Isohata N, Aoyagi K, Mabuchi T, et al. Hedgehog and epithelial-mesenchymal transition signaling in normal and malignant epithelial cells of the esophagus[J]. Int J Cancer, 2009, 125 (5):1212-1221.

[3] Chan AO, Chu KM, Lam SK, et al. Early prediction oftumor recurrence after curative resection of gastric carcinoma by measuring soluble ecadherin[J]. Cancer, 2005,104 (4):740-746.

[4] Santini R, Vinci MC, Pandolfi S, et al. Hedgehog-GLI signaling drives self-renewal and tumorigenicity of human melanoma-initiating cells, Hh[J]. Stem Cells, 2012,30(9):1808-1818.

[5] Cavicchioli Buim ME, Gurgel CA, Goncalves Ramos EA, et al. Activation of sonic hedgehog signaling in oral squamous cell carcinomas: a preliminary study[J]. Human Pathol, 2011,42(10):1484-1490.

[6] 郭杰芳,李兆申,金震東,等.GLI-1基因在胰腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[J].中華醫(yī)學(xué)雜志, 2007,87(12):826-828.

[7] 王俊菊,宋令崗,張凱等.Hh信號(hào)通路在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的激活及意義[J].癌變·畸變·突變,2013,25(2):106-110.

[8] Kou YB, Zhang SY, Zhao BL, et al. Knockdown of MMP11 inhibits proliferation and invasion of gastric cancer cells[J]. Int J Immunopathol Pharmacol, 2012,26(2):361-370.

[9] Périgny M, Bairati I, Harvey I, et al. Role of immunohistochemical overexpression of matrix metalloproteinases MMP-2 and MMP-11 in the prognosis of death by ovarian cancer[J]. Am J Clin Pathol, 2008,129(2):226-231.

[10] Yoshikawa R, Nakano Y, Tao L, et al. Hedgehog signal activation in oesophageal cancer patients undergoing neoadjuvant chemoradiotherapy[J]. Br J Cancer, 2008,98(10):1670-1674.

[11] Ibrahim N, He L, Leong CO, et al. BR CA1-associated epigeneticregulation of p73 mediates an effector pathw ay for chemosensitivityin ovarian carcinoma [J]. Cancer Res, 2010,70 (18):7155-7165.

[12] 周文娟,孟躍進(jìn),郭曉峰,等.宮頸癌組織中ZEB2和E-cad蛋白的表達(dá)[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào),2014,49(2):219-222.

[13] Mejlvang J, Kriajevska M, Vandewalle C, et al. Direct repression of cyclin D1 by SIP1 attenuates cell cycle progression in cells undergoing an epithelial mesenchymal transition[J]. Mol Biol Cell, 2007,18(11):4615.

[14] Oztas E, Avci ME, Ozcan A, et al. Novel monoclonal antibodies detect Smad-interacting protein 1(SIP1) in the cytoplasm of human cellsfrom multiple tumor tissue arrays[J]. Exp Mol Pathol, 2010,89:182-189.

[15] Vandewalle C, Van Roy F, Berx G. The role of the ZEB family of transc-ription factors in development and disease[J]. Cell Mol Life Sci, 2009,66(5):773-787.

張曉偉(E-mail: 17837203@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.48.031

R735.5

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1002-266X(2016)48-0089-03

2016-09-28)