修復(fù)臨界及超臨界骨缺損的組織工程材料研究進(jìn)展

周思睿，鄧江

(1遵義醫(yī)學(xué)院，貴州遵義563000；2遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院)

修復(fù)臨界及超臨界骨缺損的組織工程材料研究進(jìn)展

周思睿1，2，鄧江2

(1遵義醫(yī)學(xué)院，貴州遵義563000；2遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院)

臨床上臨界及超臨界骨缺損均需行手術(shù)治療，手術(shù)方法包括自體骨移植、同種異體骨移植、人工骨及支架移植和組織工程技術(shù)。其中組織工程技術(shù)是一種新近發(fā)展起來的、具有廣闊前景的治療方法。自骨組織工程學(xué)建立以來，種子細(xì)胞、三維支架材料、細(xì)胞生長(zhǎng)因子逐漸成為研究重點(diǎn)及熱點(diǎn)，目前已證實(shí)組織工程結(jié)合細(xì)胞生長(zhǎng)因子能有效修復(fù)臨界及超臨界骨缺損，復(fù)合多種生長(zhǎng)因子的組織工程材料可能是未來治療該病的新方向。

骨缺損；組織工程材料；種子細(xì)胞；支架；細(xì)胞生長(zhǎng)因子

高能量損傷、腫瘤瘤段切除、感染等因素均可導(dǎo)致骨缺損，骨缺損在一定范圍內(nèi)骨組織可自行修復(fù)重建，但是當(dāng)超過一定范圍及距離后無法自行愈合，該臨界點(diǎn)即為臨界骨缺損[1,2]。1986年Schmitz等基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ吞岢鲩L(zhǎng)骨干缺損達(dá)到直徑的1.5倍即可認(rèn)定為臨界骨缺損，目前臨床上將臨界骨缺損的長(zhǎng)度定為1.5～3.0 cm[3,4]。臨床常用治療骨缺損的方法為自體骨移植、同種異體骨移植、人工骨及支架移植[5～7]。上世紀(jì)80年代美國(guó)Laner等[5]提出了組織工程學(xué)概念，Crane等[8]在此基礎(chǔ)上提出了骨組織工程學(xué)，即通過分離自體或異體組織細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)誘導(dǎo)其增殖分化為成骨細(xì)胞，再種植于具有良好的生物相容性、可被機(jī)體降解吸收的人工合成生物材料上，隨著支架降解吸收，逐漸形成新的骨組織而修復(fù)臨界及超臨界骨缺損(以下均簡(jiǎn)稱為骨缺損)。用于修復(fù)骨缺損的組織工程材料主要包括種子細(xì)胞、三維支架材料和細(xì)胞生長(zhǎng)因子，現(xiàn)對(duì)其研究進(jìn)展綜述如下。

1 種子細(xì)胞

骨組織工程學(xué)所應(yīng)用的種子細(xì)胞是可以增殖分化為具有成骨功能的細(xì)胞，可通過自體、異體的骨膜、骨髓或骨外組織分離培養(yǎng)獲得。理想的骨組織工程種子細(xì)胞應(yīng)具備以下特點(diǎn)[9]:①來源方便；②在體外具有很強(qiáng)的增殖能力且能連續(xù)穩(wěn)定傳代；③在細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的作用下能定向分化；④無免疫原性。目前所應(yīng)用的種子細(xì)胞以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞最為突出。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是指存在于骨髓腔內(nèi)，在特定誘導(dǎo)因子的作用下可以定向分化為骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的一類單核細(xì)胞。體外擴(kuò)增的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞雖不會(huì)發(fā)生異常分化，但人為選擇過程中可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞癌變。研究顯示，鼠骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出惡性改變，長(zhǎng)時(shí)間體外培養(yǎng)出現(xiàn)不斷累積的染色體變異[10]。據(jù)此國(guó)內(nèi)外學(xué)者提出了非細(xì)胞型組織工程化骨的概念，即紅骨髓不經(jīng)體外培養(yǎng)，與生長(zhǎng)因子復(fù)合后立即植入支架材料，該概念的提出使臨床上應(yīng)用組織工程技術(shù)修復(fù)骨缺損成為可能[11]。該方法操作簡(jiǎn)單，不存在感染、癌變及再次手術(shù)等問題，為骨缺損的修復(fù)治療提供了新的方向[12,13]。

2 三維支架材料

理想的骨組織工程三維支架材料應(yīng)具備以下特征：①有良好的生物相容性；②適中的三維多孔結(jié)構(gòu)，孔隙率>80%，便于種子細(xì)胞的長(zhǎng)入和增殖分化，同時(shí)有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、細(xì)胞生長(zhǎng)因子的擴(kuò)散及代謝產(chǎn)物的排出；④利于細(xì)胞生長(zhǎng)，具有良好的細(xì)胞界面和表面活性；⑤良好的機(jī)械強(qiáng)度和可塑性，植入體內(nèi)后能在一定時(shí)間內(nèi)保持其原有形狀；⑥無免疫原性。三維支架材料不僅對(duì)細(xì)胞、組織具有鏈接和支持作用，同時(shí)能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化，并可調(diào)節(jié)細(xì)胞的爬行替代，是骨組織工程的重要成分。目前應(yīng)用于骨組織工程的三維支架材料分為天然材料和人工合成材料，天然材料包括膠原蛋白、纖維蛋白、絲素蛋白、殼聚糖等，人工合成材料包括羥基磷灰石、聚乳酸及其聚合物等。

2.1 絲素蛋白 絲素蛋白是從蠶絲中提取獲得的，具有無毒、低免疫原性及良好的生物相容性等特點(diǎn)，是一種可吸收、可降解的高分子天然物質(zhì)。研究表明，使用絲素蛋白制備的支架材料能夠支持多種細(xì)胞的黏附、增殖及分化，已廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域[14]。也有報(bào)道認(rèn)為，單一應(yīng)用絲素蛋白制作的支架在干燥情況下機(jī)械強(qiáng)度低、易碎裂、溶失率高，需與其他生物材料復(fù)合制備來彌補(bǔ)其缺點(diǎn)[15]。

2.2 殼聚糖 殼聚糖是甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物，因其無毒、無氣味、可吸收降解、易于加工整形和良好的生物特性，在醫(yī)用材料領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，如制作人工皮膚、可吸收線、止血海綿等。軟骨基質(zhì)的主要化學(xué)成分是蛋白多糖，而氨基葡萄糖(GAGs)是其干鏈上許多短鏈蛋白的共價(jià)結(jié)合物。殼聚糖與GAGs分子式相似，因此有研究將殼聚糖制成支架，并應(yīng)用于骨缺損的修復(fù)，取得了滿意效果[16]。但單一應(yīng)用殼聚糖制備的支架機(jī)械強(qiáng)度較弱，降解吸收速度難以同組織細(xì)胞的生長(zhǎng)速度相匹配。

2.3 羥基磷灰石 羥基磷灰石本身即為骨的無機(jī)成分之一，有良好的穩(wěn)固性，但不能被降解吸收；能復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化成骨；具有良好的生物相容性，可與骨組織支架形成骨性結(jié)合，但無誘導(dǎo)成骨作用。有研究通過機(jī)械混合法、表面包覆法等人工合成納米羥基磷灰石，發(fā)現(xiàn)其比傳統(tǒng)羥基磷灰石更有利于成骨細(xì)胞的種植，并可加快其增殖、礦化成骨[17]。但是納米羥基磷灰石仍存在降解差、脆性大、難以塑性及生物力學(xué)特性較差等缺點(diǎn)，需復(fù)合其他材料制備支架。朱美忠等[18]通過納米羥基磷灰石與聚酰胺66制成具有復(fù)合生物活性的人工骨，在肢體骨缺損的修復(fù)治療中取得了滿意效果。

2.4 聚乳酸 聚乳酸是一種可降解的高分子材料，主要是以再生乳酸為原料進(jìn)行人工合成而得到的，其降解產(chǎn)物為水和二氧化碳，具有良好的生物相容性。1997年美國(guó)藥品食品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)聚乳酸應(yīng)用臨床，可用于骨組織工程支架的制備及作為藥物載體材料制備緩釋劑。目前靜電紡絲法被認(rèn)為是制備聚乳酸支架最簡(jiǎn)單有效的方法，制備出來的支架孔徑及孔隙率可接近松質(zhì)骨[19]。

應(yīng)用單一材料制備出的三維支架具有明顯的局限性，將兩種及以上具有不同理化性質(zhì)及力學(xué)性能的材料以一定比例混合可制備出復(fù)合三維支架，具有良好的生物相容性以及適中的孔徑、孔隙率、降解速度、力學(xué)性能，更符合骨組織工程對(duì)支架的要求。佘榮峰等[20]將絲素蛋白和殼聚糖以1∶1的比例制備出復(fù)合支架，在體外細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的生物相容性。朱現(xiàn)瑋等[21]應(yīng)用多孔型絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，在兔半月板無血運(yùn)區(qū)的軟骨修復(fù)中取得了滿意效果。目前尚無公認(rèn)的能作為種子細(xì)胞理想載體的三維支架，仍需深入研究。

3 細(xì)胞生長(zhǎng)因子

骨的修復(fù)過程十分復(fù)雜，受多種激素、細(xì)胞生長(zhǎng)因子共同調(diào)控，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGFs)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)和核心結(jié)合因子α1(Cbfα1)等。

3.1 BMP BMP是一種疏水酸性糖蛋白，主要由氨基酸、絲氨酸、天門氨酸及甘氨酸等組成，對(duì)羥基磷灰石有較大的親和性。目前為止已發(fā)現(xiàn)20余種BMP組成成員，除BMP-1屬于蝦紅素家族，為蛋白酶外，其余均屬于TGF-β超家族成員。骨的修復(fù)程度與BMP表達(dá)呈正相關(guān)，但機(jī)體中BMP含量少，提取很困難。目前已克隆出9種BMP，稱為重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白。其中骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)具有高效的成骨作用，是公認(rèn)的最重要的成骨誘導(dǎo)因子[22]。動(dòng)物模型研究顯示，BMP-2能明顯促進(jìn)骨缺損的修復(fù)進(jìn)程[23,24]。

3.2 TGF-β TGF-β是一種多肽，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等；同時(shí)也是一種免疫調(diào)節(jié)因子，對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖、活動(dòng)及巨噬細(xì)胞的激活均具有抑制作用。TGF包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，其中以TGF-β1在骨缺損修復(fù)中的作用最顯著。研究證實(shí)，TGF-β可以刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、分化，誘導(dǎo)促進(jìn)成骨和軟骨細(xì)胞增殖，并刺激Ⅰ型膠原合成，誘導(dǎo)膜內(nèi)成骨及軟骨內(nèi)成骨[25]。

3.3 IGFs IGFs是一種由兩條肽鏈構(gòu)成的活性蛋白多肽，可分為IGF-1和IGF-2。IGFs能促進(jìn)不同來源的軟骨細(xì)胞增殖分化，其中以IGF-1作用較強(qiáng)。在骨缺損修復(fù)的重建過程中，IGFs可通過刺激成骨細(xì)胞和成骨前體細(xì)胞的增殖分化而促進(jìn)骨缺損的修復(fù)。鄧江等[26]采用IGF-1復(fù)合羥基磷灰石修復(fù)兔橈骨骨缺損，結(jié)果顯示其能誘導(dǎo)成骨分化而促進(jìn)骨缺損的修復(fù)。

3.4 FGF FGF廣泛存在骨基質(zhì)中，是一種具有廣泛生物活性的多肽，可促進(jìn)軟骨及成骨細(xì)胞的增殖、分化及膠原的合成。骨缺損患者的早期修復(fù)骨痂組織中FGF表達(dá)升高，隨著骨痂成熟為板層骨，其表達(dá)逐漸降低；FGF還能促進(jìn)毛細(xì)血管的生成，為骨痂的生長(zhǎng)及成熟提供營(yíng)養(yǎng)支持。研究表明，F(xiàn)GF可以誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞增殖分化，并能明顯促進(jìn)BMP-2的成骨誘導(dǎo)能力，與BMP-2有協(xié)同修復(fù)骨缺損的作用[27]。

3.5 HIF-1α和Cbfα1HIF是一種異二聚蛋白質(zhì)，由α 、β兩個(gè)亞基構(gòu)成。HIF-1α可直接調(diào)節(jié)骨細(xì)胞的功能，也可通過誘導(dǎo)血管生成因子的表達(dá)而促進(jìn)骨折愈合過程。Cbfα1也稱RunX2，屬于Run基因家族中的一員，其被證實(shí)具有調(diào)控成骨細(xì)胞發(fā)育、分化和骨形成的功能，在成骨細(xì)胞動(dòng)員、膜內(nèi)成骨、軟骨內(nèi)成骨和牙齒的形成過程中發(fā)揮重要作用。柏小金等[28]研究發(fā)現(xiàn)，股骨骨折合并腦損傷模型大鼠HIF-1α和Cbfα1表達(dá)明顯升高，可能是加速骨折愈合的機(jī)制之一。

綜上所述，雖然骨組織工程在種子細(xì)胞分離、支架制備及細(xì)胞生長(zhǎng)因子提取等方面取得了較大發(fā)展，但仍有許多問題需進(jìn)一步研究解決，比如需要建立標(biāo)準(zhǔn)化種子細(xì)胞，使研究結(jié)果更科學(xué)、更可靠；在材料方面，雖然復(fù)合支架更符合骨組織工程的要求，但是臨床上對(duì)復(fù)合支架方面的研究仍處于探索階段；生長(zhǎng)因子方面，雖然目前結(jié)合多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子修復(fù)骨缺損逐漸成為骨組織工程的研究熱點(diǎn)，但是相關(guān)生長(zhǎng)因子的選擇仍存在爭(zhēng)議。此外，關(guān)于骨組織工程修復(fù)骨缺損的效果多在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)，其臨床應(yīng)用研究較少，尚需進(jìn)一步證實(shí)。

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鄧江(E-mail： DJ3666@126.com)

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R683.4

A

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2016-06-01)