脂肪干細胞移植對兔前交叉韌帶損傷的修復(fù)作用及其機制

劉銘，王宇，劉欣偉，劉憲民，張玉彪，項良碧，劉松波

(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院，沈陽110016)

·基礎(chǔ)研究·

脂肪干細胞移植對兔前交叉韌帶損傷的修復(fù)作用及其機制

劉銘，王宇，劉欣偉，劉憲民，張玉彪，項良碧，劉松波

(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院，沈陽110016)

目的 觀察脂肪干細胞(ADSCs)移植對兔前交叉韌帶(ACL)損傷的修復(fù)作用，并探討其對韌帶組織轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)和Ⅰ型膠原表達的影響。方法無菌條件下切取1只新西蘭大白兔的腹股溝下脂肪組織，分離提取ADSCs(經(jīng)CD43免疫熒光染色證實)。將45只新西蘭大耳白兔隨機分為假手術(shù)組、模型組和移植組，每組15只。模型組和移植組均切斷75%的ACL，移植組同時在韌帶損傷處注入10 μL第3代ADSCs懸液，假手術(shù)組只暴露韌帶、不切開。記錄術(shù)后各組動物飲食、飲水、運動等一般情況，術(shù)后第4周處死后采集ACL標(biāo)本，分別采用實時熒光定量PCR法和Western blotting法檢測TGF-β、Ⅰ型膠原mRNA和蛋白相對表達量。結(jié)果假手術(shù)組麻醉恢復(fù)后即可正常飲水飲食，被毛有光澤，精神狀態(tài)良好，運動情況與術(shù)前比較無變化。模型組飲食飲水較少，被毛無光澤，精神狀態(tài)差，存在運動障礙。移植組飲食飲水情況與假手術(shù)組相近，被毛光澤度不佳，精神狀態(tài)較模型組好，存在輕微運動障礙，但運動能力恢復(fù)情況較模型組好。與假手術(shù)組比較，模型組和移植組TGF-β mRNA和蛋白相對表達量均升高，Ⅰ型膠原mRNA和蛋白相對表達量均降低(P均<0.05)。與模型組比較，移植組TGF-β mRNA和蛋白相對表達量均降低，Ⅰ型膠原mRNA和蛋白相對表達量均升高(P均<0.05)。結(jié)論ADSCs移植可以促進ACL損傷兔的韌帶修復(fù)；降低TGF-β表達、升高Ⅰ型膠原表達可能是其作用機制。

前交叉韌帶損傷；脂肪干細胞；轉(zhuǎn)化生長因子β；Ⅰ型膠原；兔

隨著全民健身運動的開展，韌帶損傷在創(chuàng)傷骨科中的比例逐漸升高，其中以前交叉韌帶(ACL)損傷發(fā)病率最高[1～3]。研究表明，干細胞移植可以在移植區(qū)域產(chǎn)生新的血管，為創(chuàng)傷恢復(fù)和治療提供了條件[4]。脂肪干細胞(ADSCs)來源比較廣泛，容易獲取，是目前干細胞移植的研究熱點。2014年5月～2015年7月，本研究觀察了ADSCs移植修復(fù)兔ACL損傷的效果及其對韌帶組織轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)和Ⅰ型膠原表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：健康成年新西蘭大白兔46只，雌雄不限，體質(zhì)量2.0～3.0 kg，由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院動物實驗科提供。試劑：戊巴比妥鈉購于成都化學(xué)制劑廠，DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素、胎牛血清均購于美國Hyclone公司，Ⅰ型膠原酶購于美國Sigma公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于日本TaKaRa公司，caspase-3和c-fos大鼠抗兔抗體、二抗山羊抗鼠均購于北京索來寶生物科技有限公司。

1.2 兔ADSCs分離、鑒定 ①兔ADSCs分離：隨機選取1只新西蘭大白兔，采用3%戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射麻醉處死，將動物進行消毒，于無菌條件下切取腹股溝下脂肪組織。在體視顯微鏡下去除脂肪組織上可見的血管和筋膜，無菌預(yù)冷PBS緩沖液沖洗3遍，用手術(shù)眼科剪將其剪成泥狀。加入0.15% Ⅰ型膠原酶3 mL，置于CO2培養(yǎng)箱中消化60 min，消化后將懸液過100目細胞篩。將濾液放入離心機中，1 000 r/min離心10 min；棄上清，采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行重懸，接種于培養(yǎng)皿中，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。②兔ADSCs鑒定：待細胞生長融合至80%～90%時進行傳代，細胞傳代至第3代時采用載玻片制作細胞爬片，95%乙醇脫水固定。PBS沖洗后吸干水分，滴加一抗放入濕盒內(nèi)4 ℃過夜，PBS沖洗，加入二抗37 ℃孵育，最后PBS洗凈封片，嚴(yán)格按照CD43免疫熒光試劑盒說明進行操作。熒光顯微鏡下進行觀察，以CD43免疫熒光染色呈綠色定義為陽性染色。鑒定結(jié)果顯示，分離出來的細胞中有較多的雜細胞；培養(yǎng)2天后培養(yǎng)皿中能夠見到三角形或小多角形的細胞，大小不一，細胞核較大，傳代后細胞分布均勻；ADSCs表面標(biāo)志因子CD43染色結(jié)果呈現(xiàn)陽性。證實分離培養(yǎng)的細胞為ADSCs。

1.3 造模與分組處理 將剩余45只健康新西蘭大白兔隨機分為假手術(shù)組、模型組和移植組，每組15只。各組均采用3%戊巴比妥鈉1 mL/kg耳緣靜脈緩慢注射麻醉，將動物仰臥位固定于動物解剖臺上，剃毛，局部碘伏消毒，切開皮膚，暴露膝關(guān)節(jié)腔和ACL。模型組將ACL中部切斷75%，縫合修復(fù)韌帶后逐層縫合切口。移植組將ACL中部切斷75%，縫合腱膜組織，于韌帶損傷處注入10 μL第3代ADSCs懸液(細胞密度為1×106個/μL)，逐層縫合切口。假手術(shù)組僅暴露ACL，不切斷，然后逐層縫合切口。

1.4 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.4.1 一般情況及ACL損傷修復(fù)情況 記錄各組術(shù)后飲水飲食、運動等一般情況。術(shù)后4周，各組均采用3%戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射麻醉處死，取出ACL組織，肉眼觀察損傷修復(fù)情況后置于-80 ℃保存。

1.4.2 ACL組織TGF-β和Ⅰ型膠原mRNA表達 采用實時熒光定量PCR法。取出ACL組織，于液氮中進行研磨，加入TRIzol試劑，提取總RNA。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為10 μL，反應(yīng)條件為37 ℃、15 min，85 ℃、5 s。TGF-β上游引物：5′-TGCTTCAGCTCCACAGAGAA-3′，下游引物：5′-TGGTTGTAGAGGGCAAGGAC-3′，片段長度125 bp；Ⅰ型膠原上游引物：5′-GCGGTGGTTACGAC-TTTGGTT-3′，下游引物：5′-AGTGAGGAGGGTCTCAATCTG-3′，片段長度144 bp。以β-actin為內(nèi)參，上游引物：5′-AGGGAAATCGTGCGTGACAT-3′，下游引物：5′-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3′，片段長度141 bp。反應(yīng)體系25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，變性、退火和延伸共40個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。以2-ΔΔCt法計算TGF-β和Ⅰ型膠原mRNA相對表達量。

1.4.3 ACL組織TGF-β和Ⅰ型膠原蛋白表達 采用Western blotting法。取各組ACL組織，于冰浴條件下采用勻漿機進行勻漿，提取總蛋白，對提取蛋白進行定量，然后進行蛋白變性、電泳轉(zhuǎn)膜、一抗和二抗孵育，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。顯影定影，拍照后采用圖像分析軟件對電泳條帶灰度值進行分析，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示TGF-β和Ⅰ型膠原蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物一般情況及ACL損傷修復(fù)情況 假手術(shù)組麻醉恢復(fù)后即可正常飲食飲水，被毛有光澤，精神可，運動情況與術(shù)前比較無變化。模型組飲食飲水較少，被毛無光澤，精神狀態(tài)差，存在明顯運動障礙，自主運動能力較差。移植組飲食飲水情況與假手術(shù)組相近，被毛光澤度不佳，精神狀態(tài)較模型組好，存在輕微運動障礙，但運動能力恢復(fù)情況較模型組好。移植組肉眼觀察不到ACL損傷，與假手術(shù)組相近；模型組可見明顯的ACL損傷。

2.2 TGF-β和Ⅰ型膠原mRNA表達 與假手術(shù)組比較，模型組和移植組TGF-β mRNA相對表達量均升高、Ⅰ型膠原mRNA相對表達量均降低(P均<0.05)。與模型組比較，移植組TGF-β mRNA相對表達量降低、Ⅰ型膠原mRNA相對表達量升高(P均<0.05)。見表1。

表1 各組TGF-β和Ⅰ型膠原mRNA相對表達量比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.3 TGF-β和Ⅰ型膠原蛋白表達 與假手術(shù)組比較，模型組和移植組TGF-β蛋白相對表達量均升高、Ⅰ型膠原蛋白相對表達量均降低(P均<0.05)。與模型組比較，移植組TGF-β蛋白相對表達量降低、Ⅰ型膠原蛋白相對表達量升高(P均<0.05)。見表2。

表2 各組TGF-β和Ⅰ型膠原蛋白相對表達量比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討論

韌帶損傷是指由于各種原因造成韌帶撕裂或者斷裂，可導(dǎo)致運動功能受限。韌帶的主要成分是細胞外基質(zhì)和基質(zhì)中間的成纖維細胞，韌帶損傷后的愈合期主要是成纖維細胞發(fā)揮修復(fù)作用[3]。韌帶損傷后首先是局部發(fā)生出血、炎癥反應(yīng)和細胞增殖，由于韌帶是結(jié)締組織，所以損傷時韌帶出血導(dǎo)致的血塊形成并不明顯[2]。在炎癥反應(yīng)初期階段，損傷部位會出現(xiàn)大量巨噬細胞，其作用是調(diào)整促進韌帶愈合所必需的環(huán)境；炎癥反應(yīng)的后期可出現(xiàn)細胞增殖和膠原產(chǎn)生。因此韌帶損傷的愈合是一個長期過程，一般會持續(xù)數(shù)月至數(shù)年[4～6]。

干細胞具有在一定條件下分化成其他細胞的能力，目前已經(jīng)逐漸應(yīng)用于臨床疾病的治療，例如造血干細胞移植治療白血病、脊髓損傷后利用神經(jīng)干細胞移植促進脊髓神經(jīng)元再生和功能恢復(fù)等。研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞移植能夠促進大鼠韌帶損傷處干細胞向成纖維細胞分化，從而促進韌帶損傷處的愈合[7，8]。但是臨床上對于干細胞治療韌帶損傷的研究比較少，尤其是ADSCs移植[9，10]。本研究結(jié)果顯示，模型組出現(xiàn)明顯運動障礙，而移植組僅存在輕微運動障礙，且運動能力恢復(fù)情況較模型組好。說明ADSCs移植可促進ACL損傷的修復(fù)。

Ⅰ型膠原是韌帶的重要組成部分，在韌帶中的干重比可達80%，是提高組織伸拉強度的重要因素。在韌帶損傷的愈合過程中，Ⅰ型膠原表達可間接反映韌帶的愈合情況[11～13]。研究發(fā)現(xiàn)，韌帶損傷后會產(chǎn)生大量TGF-β，主要是由傷口處釋放，可促進瘢痕成熟和抑制韌帶愈合[14～16]。本研究結(jié)果顯示，假手術(shù)組、移植組、模型組TGF-β mRNA和蛋白表達依次升高，Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達依次降低。證實ADSCs移植可降低TGF-β表達、升高Ⅰ型膠原表達，可能是其促進損傷韌帶修復(fù)的機制之一。

綜上所述，ADSCs移植可促進ACL損傷兔的韌帶修復(fù)；降低TGF-β表達、升高Ⅰ型膠原表達可能是其作用機制。本研究為干細胞治療韌帶損傷提供了一定的理論基礎(chǔ)，但更多的作用機制還需要深入研究。

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遼寧省科技攻關(guān)計劃項目(2013020175)；遼寧省自然科學(xué)基金資助項目(2013225089)。

劉松波(E-mail： luzongguke@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.48.008

R686.5

A

1002-266X(2016)48-0028-03

2015-12-14)