紅系細胞發(fā)育相關miR-196b的靶基因預測及意義

丁謹，劉芳，胡彩艷，施繼禹

(青海大學醫(yī)學院，西寧810010)

紅系細胞發(fā)育相關miR-196b的靶基因預測及意義

丁謹，劉芳，胡彩艷，施繼禹

(青海大學醫(yī)學院，西寧810010)

目的 預測紅系細胞發(fā)育相關miR-196b的靶基因，并探討其作用機制。方法應用miRbase數(shù)據(jù)庫查找多物種已知的miR-196b成熟序列，比對后分析其在多物種間的保守性。應用miRanda、miRDB、Targetscan7.1、PITA和miRWalk數(shù)據(jù)庫對miR-196b的靶基因進行預測，篩選重復率較高的靶基因。應用Cytoscape3.3.0和KEGG對重復率較高的靶基因進行GO分類富集分析和信號通路富集分析。查閱文獻，再次篩選與紅系細胞發(fā)育相關的靶基因，采用Targetscan7.1和RNA22分析其與miR-196b的結(jié)合情況。結(jié)果22個物種具有miR-196b成熟序列，序列比對發(fā)現(xiàn)miR-196b在多物種間高度保守。靶基因預測結(jié)果顯示，共得到5 004個miR-196b的靶基因，其中重復率較高的靶基因有302個。GO分類富集分析結(jié)果顯示，miR-196b靶基因在生物學過程顯著富集于發(fā)育過程、細胞過程和定位等，在分子功能顯著富集于蛋白結(jié)合和物質(zhì)轉(zhuǎn)運等，在細胞組分顯著富集于細胞突起和細胞器膜等(P均<0.05)。結(jié)合信號通路富集分析結(jié)果，篩選出43個與紅系細胞發(fā)育相關miR-196b的靶基因，其信號通路富集于Ras信號通路、cAMP信號通路和PI3K-Akt信號通路等(P均<0.05)。結(jié)合文獻，最終篩選出與紅系細胞發(fā)育相關的miR-196b靶基因有5個，分別為GATA1、Cdkn1b、Pld1、Cdh1和Ntrk2，其中GATA1、Cdkn1b和Cdh1可與miR-196b直接結(jié)合。結(jié)論紅系細胞發(fā)育相關miR-196b的靶基因可能為GATA1、Cdkn1b、Pld1、Cdh1和Ntrk2；miR-196b可能通過對上述靶基因的直接或間接作用激活相應信號通路，在紅系細胞的發(fā)育過程中發(fā)揮生物學作用。

紅系細胞；miR-196b；靶基因；生物信息學

微小RNA(miRNAs)是一種約有22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，通過與靶mRNA的不完全性互補配對，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達，參與生命體發(fā)生、發(fā)展和死亡的生物學過程[1]。miR-196家族通過對其靶基因的調(diào)控，在機體正常發(fā)育和腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用[2]。miR-196b在不同的細胞中表達不同，靶基因和生物學作用也不同[3～5]。近年來，關于miR-196b在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用研究較多，但其在紅系細胞(簡稱紅系)發(fā)育中的作用尚未被證實。2016年3～6月，本研究通過在線工具預測紅系發(fā)育相關miR-196b的靶基因，為研究其在紅系發(fā)育中的作用提供依據(jù)。

1 材料、方法與結(jié)果

1.1 材料 數(shù)據(jù)庫及在線工具：miRbase(https://www.mirbase.org/)、miRanda(http://www.microrna.org/microrna/home.do)、miRDB(http://www.mirdb.org/miRDB/)、Targetscan7.1(http://www.targetscan.org/vert_71/)、PITA(http://www.pita.ps/)、miRWalk(http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/index.html)[6～8]、KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)、RNA22(https://cm.jefferson.edu/rna22/)。Cytoscape 3.3.0軟件從http://www.cytoscape.org/index.html官方網(wǎng)站下載。

1.2 紅系發(fā)育相關miR-196b的靶基因預測

1.2.1 序列保守性分析 應用miRbase數(shù)據(jù)庫查找多物種已知的miR-196b成熟序列，進行序列比對，查找高度相似序列(在不同物種中非常相似的DNA序列)，分析其在多物種間的保守性。結(jié)果顯示，有22個物種具有miR-196b成熟序列，序列比對發(fā)現(xiàn)miR-196b序列在22個物種中相似度極高，高度相似序列為“-uagguaguuuuauguuguugg-”，表明miR-196b在多物種間高度保守。

1.2.2 靶基因預測 應用miRanda、 miRDB、Targetscan7.1、PITA和miRWalk數(shù)據(jù)庫對miR-196b的靶基因進行預測，共得到5 004個miR-196b的靶基因。篩選重復率較高的靶基因，其中在3個及以上數(shù)據(jù)庫中出現(xiàn)的靶基因有302個。

1.2.3 GO分類富集分析 應用Cytoscape3.3.0軟件中的BINGO插件對1.2.2中重復率較高的302個miR-196b靶基因進行GO生物學過程、分子功能和細胞組分的富集分析，共得到202個靶基因的生物學過程注釋信息、212個靶基因的分子功能注釋信息、218個靶基因的細胞組分注釋信息。GO分類富集結(jié)果采用超幾何分布檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果顯示，miR-196b靶基因在生物學過程顯著富集于發(fā)育過程、細胞過程和定位等(P均<0.05)，見表1；在分子功能顯著富集于蛋白結(jié)合和物質(zhì)轉(zhuǎn)運等(P均<0.05)，見表2；在細胞組分顯著富集于細胞突起和細胞器膜等(P均<0.05)，見表3。

表1 miR-196b靶基因的GO生物學過程分析結(jié)果

1.2.4 信號通路富集分析 應用KEGG對302個靶基因進行信號通路分析，從中篩選出29個與紅系發(fā)育相關的miR-196b靶基因，包括Calm1、Cdkn1b、Grin1、Cyp7a1、Il13ra1、Ibsp、Acsl4、Pld1、Smad9、Il2rg、Rasgrp1、Ralbp1、Gnai2、Cdc25a、Cftr、Ets1、Gabbr2、 Npy1r、 Pdgfra、 Ccng1、 Cdh1、 Ctsb、 Itgb6、Tbl1x、Gabarap、Nras、Pla2g2d、Capn1、Ntrk2。GO分類富集分析篩選出與紅系發(fā)育相關miR-196b的靶基因有17個：DGKG、CLIC5、NTRK2、UBE2B、LHFPL5、LRP4、ACSL4、GATA1、DCLK1、GAP43、CNP1、CDH1、MAP1B、NRCAM、NCDN、APBB1、GAS7。取上述靶基因的合集，共得到43個與紅系發(fā)育相關的miR-196b靶基因。對43個靶基因進行信號通路富集分析，結(jié)果比較采用Fisher精確檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果顯示，紅系發(fā)育相關miR-196b的靶基因信號通路富集于Ras信號通路、cAMP信號通路和PI3K-Akt信號通路等(P均<0.05)，見表4。

表2 miR-196b靶基因的GO分子功能分析結(jié)果

表3 miR-196b靶基因的GO細胞組分分析結(jié)果

表4 紅系發(fā)育相關miR-196b靶基因的信號通路富集分析結(jié)果

1.3 靶基因篩選 查閱文獻，結(jié)合miR-196b靶基因的GO分類富集分析和KEGG信號通路富集分析結(jié)果，再次篩選與紅系發(fā)育相關miR-196b的靶基因，結(jié)果顯示其靶基因為GATA1、Cdkn1b、Pld1、Cdh1和Ntrk2[9～13]。采用Targetscan7.1、RNA22對miR-196b和上述5個基因進行序列匹配分析。結(jié)果顯示，GATA1、Cdkn1b和Cdh1可與miR-196b直接結(jié)合。

2 討論

miRNAs可影響多種生物學過程，如細胞增殖、分化和凋亡，激素分泌，多種器官正常發(fā)育等，并與人類多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關。miR-196b定位于同源區(qū)域(HOX)基因簇內(nèi)，迄今為止已有諸多研究探討其作用。研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌中miR-196b與HOXA10(同源基因A10)的表達及不良預后呈正相關，亦有研究證實miR-196b能促進胃癌細胞的侵襲和遷移[14]；Rebucci等[15]證實，原發(fā)性肝癌組織過表達miR-196b，生長因子2結(jié)合蛋白1(IGF2BP1)表達被抑制，細胞增殖率也明顯降低。在胃癌發(fā)病中，miR-196b可通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR通路促進癌細胞增殖[16]；在結(jié)腸癌發(fā)病中，miR-196b可通過抑制Fas表達而抑制細胞凋亡[3]；在慢性粒細胞白血病發(fā)病中，miR-196b可抑制BCR-ABL1和HOXA9表達，降低細胞增殖率，并延緩細胞周期[17]。由此可見，miR-196b在細胞增殖、分化與凋亡的生物學過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。采用生物信息學方法預測miRNAs的靶基因并分析其相互作用，對研究miRNAs的生物學作用具有重要指導意義。

本研究首先分析了miR-196b的保守性，提示miR-196b與生物體的基礎生命功能密切相關。其次，采用生物信息學方法預測得到302個重復率較高的靶基因，對上述靶基因進行功能富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其主要富集于發(fā)育過程、細胞過程等。信號通路富集分析結(jié)果顯示，miR-196b靶基因富集于Ras信號通路、cAMP信號通路和PI3K-Akt信號通路等。既往研究表明，紅系特異轉(zhuǎn)錄因子1能抑制MEK活性，進而阻抑Ras信號通路，促進紅細胞生成[18]。cAMP信號通路可誘導γ-球蛋白基因表達、抑制c-myb蛋白表達，從而促進造血干細胞向紅系分化。在紅系祖細胞中，促紅細胞生成素(EPO)可以激活PI3K-Akt信號通路，促進cyclin D3、E和A表達，從而促進紅細胞生成。以上說明Ras、cAMP和PI3K-Akt信號通路均參與了紅系的正常發(fā)育過程。結(jié)合本研究預測結(jié)果，說明miR-196b可能通過與靶基因的相互作用參與Ras、cAMP和PI3K-Akt信號通路的調(diào)控，從而在紅系發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。

本研究通過進一步查閱文獻，篩選出與紅系發(fā)育相關miR-196b的靶基因有GATA1、Cdkn1b、Pld1、Cdh1和Ntrk2；序列匹配分析結(jié)果表明，GATA1、Cdkn1b和Cdh1可能受miR-196b的直接調(diào)控，而Pld1和Ntrk2可能受miR-196b的間接調(diào)控。研究表明，GATA1可以通過招募其他輔助因子, 調(diào)控下游紅系特異性靶基因的表達, 保障紅細胞分化的順利進行[19]。Cdkn1b可抑制CDK2，使終末分化的幼紅細胞退出細胞周期，從而形成成熟的紅細胞[12]。Cdh1是EPO的下游靶基因，在早期CD34+祖細胞中，EPO誘導Cdh1表達，從而促進造血祖細胞向紅系分化[14]。以上均提示，miR-196b可能通過對GATA1等下游靶基因的直接或間接作用調(diào)控紅系的發(fā)育過程。

綜上所述，與紅系發(fā)育相關miR-196b的靶基因可能是GATA1、Cdkn1b、Pld1、Cdh1和Ntrk2；miR-196b可能通過對上述靶基因的直接或間接作用激活相應信號通路，在紅系的發(fā)育過程中發(fā)揮生物學作用。本研究為后期驗證miR-196b及其下游靶基因在紅系發(fā)育過程中的生物學作用提供了一定依據(jù)。

[1] Arnold CP, Tan R, Zhou B, et al. MicroRNA programs in normal and aberrant stem and progenitor cells[J]. Genome Res, 2011,21(5):798-810.

[2] Chen C, Zhang Y, Zhang L, et al. MicroRNA-196： critical roles and clinical applications in development and cancer[J]. J Cell Mol Med, 2011,15(1):14-23.

[3] Mo JS, Alam KJ, Kang IH, et al. MicroRNA 196B regulates FAS-mediated apoptosis in colorectal cancer cells[J]. Oncotarget, 2015,6(5):2843-2855.

[4] 尹虹,劉玥,鄭文嶺,等.miRNA-196b過表達對K562細胞增殖、凋亡及survivin、Cox-2表達的影響[J].中國癌癥雜志,2013,23(5):341-346.

[5] 劉玥,帥春,尹虹,等.miR-196b慢病毒表達載體的構(gòu)建和功能鑒定[J].基礎醫(yī)學與臨床,2014,34(5):674-678.

[6] 麥秀英,徐柳,李萍.MiR-21靶基因預測和生物信息學分析[J].生物學雜志,2014,31(6):89-93.

[7] 楊立濤,杜義安,俞鵬飛,等.腫瘤相關hsa-miR-95-3p的靶基因預測及生物信息學分析[J].腫瘤學雜志,2016,22(5):374-379.

[8] 李武,賀慶芝,孫詩博,等.has-miR-16靶基因預測及生物信息學分析[J].中華疾病控制雜志,2016,20(2):193-197.

[9] Randle SJ, Nelson DE, Patel SP, et al. Defective erythropoiesis in a mouse model of reduced Fbxo7 expression due to decreased p27 expression[J]. J Pathol, 2015,237(2):263-272.

[10] Yamamoto ML, Clark TA, Gee SL, et al. Alternative pre-mRNA splicing switches modulate gene expression in late erythropoiesis[J]. Blood, 2009,113(14):3363-3370.

[11] Armeanu S, Müller CA, Klein G. Involvement of E-cadherin in the development of erythroid cells subject heading[J]. Hematology, 2000,5(4):307-316.

[12] Anam K, Davis TA. Comparative analysis of gene transcripts for cell signaling receptors in bone marrow-derived hematopoietic stem/progenitor cell and mesenchymal stromal cell populations[J]. Stem Cell Res Ther, 2013,4(5):337-338.

[13] Rylski M, Welch JJ, Chen YY, et al. GATA-1-mediated proliferation arrest during erythroid maturation[J]. Mol Cell Biol, 2003,23(14):5031-5042.

[14] Lim JY, Sun OY, Seol SY, et al. Overexpression of miR-196b and HOXA10 characterize a poor-prognosis gastric cancer subtype[J]. World J Gastroenterology, 2013,19(41):7078-7088.

[15] Rebucci M, Sermeus A, Leonard E, et al. miRNA-196b inhibits cell proliferation and induces apoptosis in HepG2 cells by targeting IGF2BP1[J]. Mol Cancer, 2015,14(1):1-17.

[16] Li N, Wang W, Xu B, et al. miR-196b regulates gastric cancer cell proliferation and invasion via PI3K/AKT/mTOR signaling pathway[J]. Oncol Lett, 2016,11(3):1745-1749.

[17] Liu Y, Zheng W, Song Y, et al. Low expression of miR-196b enhances the expression of BCR-ABL1 and HOXA9 oncogenes in chronic myeloid leukemogenesi[J]. PLoS One, 2013,8(7):61.

[18] Platanias LC. Map kinase signaling pathways and hematologic malignancies[J]. Blood, 2003,101(12):4667-4679.

[19] Zheng J, Kitajima K, Sakai E, et al. Differential effects of GATA-1 on proliferation and differentiation of erythroid lineage cells[J]. Blood, 2006,107(2):520-527.

Target gene prediction of erythroid cells-related miR-196b

DingJin,LIUFang,HUCaiyan,SHIJiyu

(MedicalCollegeofQinghaiUniversity,Xining810010,China)

Objective To predict the target genes of miR-196b related to erythroid cells and to explore their mechanism. Methods We applied miRbase database to search for miR-196b mature sequence of multiple species and analyze its conservation. MiRanda, miRDB, Targetscan7.1, PITA and miRWalk databases were used to predict the target genes of miR-196b, and we screened the target genes with high repetition rate. GO annotation and signal pathway enrichment analysis on target genes with high repetition rate were performed using Cytoscape3.3.0 and KEGG. Combined with literature, the target genes related to erythroid cells were screened out, and we applied Targetscan7.1 and RNA22 to analysis their combination with miR-196b. Results Twenty-two species had miR-196b mature sequence, and we found that miR-196b was highly conserved among different species by sequence alignment. Target gene prediction results showed that a total of 5 004 miR-196b target genes were chosen, of which 302 target genes had a high repetition rate. GO enrichment analysis showed that the target genes of miR-196 in biological process were significantly enriched in the developmental process, cellular process and localization; as for the molecular function, they were significantly enriched in protein binding and material transport, and as for the cell component, they were significantly enriched in cell projection and organelle membrane (allP<0.05). Signal pathway enrichment analysis showed that 43 target genes-associated with cell development were screened out, and their signal pathways were enriched in Ras signaling pathway, cAMP signaling pathway and PI3K-Akt signaling pathway (P<0.05). Finally, 5 target genes were screened out, which were Ntrk2, Cdkn1b, Pld1, Cdh1 and GATA1, in which Cdh1, Cdkn1b and GATA1 could be directly combined with miR-196b. Conclusions The erythroid cells-related miR-196b target genes may be GATA1, Cdkn1b, Pld1, Cdh1 and Ntrk2. Meanwhile, miR-196b can activate the corresponding signaling pathway through the direct or indirect effect of the target genes, and plays a biological role in the development of erythroid cells.

erythroid cells; miR-196b; target genes; bioinformatics

國家自然科學基金資助項目(81441116)；青海省科技廳(應用)基礎研究計劃項目(2012-Z-729)；青海大學“123高層次人才培養(yǎng)工程”-中青年學術帶頭人基金資助項目；青海大學醫(yī)學院中青年科研基金團隊項目(2014-KT-1)。

丁謹(1992-)，女，碩士在讀，研究方向為慢性高原病的發(fā)病機制。E-mail： jin11146@163.com

劉芳(1972-)，女，教授，研究方向為慢性高原病的發(fā)病機制。E-mail： qhxnlf2006@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.48.004

R555.1

A

1002-266X(2016)48-0012-04

2016-07-21)