堿性成纖維細(xì)胞生長因子對(duì)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的影響

戶小偉，李巍，韋達(dá)隆，勞山

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

堿性成纖維細(xì)胞生長因子對(duì)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的影響

戶小偉，李巍，韋達(dá)隆，勞山

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

目的 觀察堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)對(duì)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)向成骨細(xì)胞分化的影響，并探討其最佳作用濃度。方法采用體外全血貼壁法培養(yǎng)兔BMSCs，進(jìn)行表面抗原(CD29、CD44、CD45，采用流式細(xì)胞術(shù))及成軟骨(HE染色和阿爾新藍(lán)染色)、成骨[茜素紅染色及堿性磷酸酶(ALP)染色]分化潛能鑒定。取第2代BMSCs，加入含0、1、5、10、50、100 ng/mL bFGF的成骨誘導(dǎo)液，分別于培養(yǎng)第4、7、10、14天采用PNP比色法檢測ALP表達(dá)，采用放射免疫分析法檢測骨鈣素(OC)表達(dá)。結(jié)果細(xì)胞表面抗原CD29陽性表達(dá)率為92.23%，CD44陽性表達(dá)率為80.01%，CD45陽性表達(dá)率為1.91%；HE染色見細(xì)胞形態(tài)為多角形或多邊形，有多個(gè)凸起，核周細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見黑色顆粒，阿爾新藍(lán)染色可見細(xì)胞間大量天藍(lán)色物質(zhì)彌漫分布；茜素紅染色可見大量紅色鈣結(jié)節(jié)，ALP染色可見細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕褐色的顆粒和塊狀沉淀；證實(shí)分離培養(yǎng)的細(xì)胞為BMSCs，并具有成軟骨和成骨分化潛能。隨著作用時(shí)間的延長，BMSCs經(jīng)不同濃度bFGF作用后ALP及OC表達(dá)均呈升高趨勢。相同作用時(shí)間下，BMSCs經(jīng)50 ng/mL bFGF作用后ALP及OC表達(dá)均高于0、1、5、10、100 ng/mL bFGF作用后(P均<0.01)。結(jié)論bFGF能促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，并呈時(shí)間依賴性；其最佳作用濃度為50 ng/mL。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；堿性成纖維細(xì)胞生長因子；成骨分化；兔

骨組織工程技術(shù)是目前治療骨壞死病變及修復(fù)骨缺損最有前景的方法，種子細(xì)胞作為組織工程的三要素之一，其選擇和培養(yǎng)更是該技術(shù)最基本的環(huán)節(jié)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)有多向分化的能力，被認(rèn)為是最具潛能的種子細(xì)胞[1]。但是自體BMSCs取材有限，因此如何短期內(nèi)促進(jìn)其增殖以達(dá)到治療數(shù)量并增強(qiáng)其成骨效果，是目前所面臨的問題。堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)是骨修復(fù)再生過程中重要的生長因子，但是關(guān)于其對(duì)BMSCs成骨分化的影響及最佳作用濃度研究較少。為此，我們于2015年7～10月進(jìn)行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 動(dòng)物：出生2～3 d的新西蘭白兔10只，雌雄不限，均購于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。主要試劑：培養(yǎng)基(DMEM-LG、DMEM-HG)購于美國Gibco公司，胎牛血清購于杭州四季清生物工程材料有限公司，β-甘油磷酸鈉、地塞米松、抗壞血酸均購于美國Sigma公司，TritonX-100購于北京Solarbio公司，轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、胰島素樣生長因子1(IGF-1)、bFGF均購于美國Peprotech公司，CD44抗體、CD45抗體、二抗sc-2010均購于美國Santa Cruz 公司，CD29-FITC購于美國Millipore公司，堿性磷酸酶(ALP)測定試劑盒購于南京建成生物科技有限公司。主要儀器：倒置生物顯微鏡購于日本Olympus公司，酶標(biāo)光度計(jì)(MK3型)購于美國Thermo Labsystems公司，流式細(xì)胞儀購于美國BD公司，紫外可見光分光光度計(jì)購于上海棱光技術(shù)有限公司，CO2恒溫培養(yǎng)箱購于美國SHEL LAB公司。

1.2 兔BMSCs分離培養(yǎng)及鑒定 取10只出生2～3天的新西蘭白兔，予頸椎脫臼處死，無菌條件下取出雙側(cè)股骨。在含15% FBS的DMEM-LG培養(yǎng)基中反復(fù)沖洗髓腔，將沖出物及培養(yǎng)基復(fù)合液以1 000 r/min離心5 min，棄上清液。用含15% FBS的DMEM-LG培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，吹打均勻，按1×106/mL接種于培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合至80%以上，棄去培養(yǎng)液，用PBS沖洗2遍，加入0.25%胰酶1 mL消化約3 min。待顯微鏡下發(fā)現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)縮后，用含15% FBS的DMEM-LG培養(yǎng)基終止消化。充分吹打，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。加入培養(yǎng)基吹打均勻，按1∶2接種于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。40倍倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長及形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果顯示，原代BMSCs接種24 h可見貼壁細(xì)胞，為梭形或三角形，呈集落樣生長，接種7～9天可融合至80%以上。傳代BMSCs細(xì)胞生長迅速，多數(shù)在接種12 h內(nèi)貼壁生長，接種3～4天可融合至80%以上，為典型的長梭型，呈魚群狀生長。

1.2.1 BMSCs表面抗原鑒定 采用流式細(xì)胞術(shù)。取融合至90%以上的第3代BMSCs，用含Ca2+、Mg2+的PBS沖洗2遍，胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清，F(xiàn)ACS buffer沖洗2遍[2]。再次1 000 r/min離心5 min，F(xiàn)ACS buffer重懸細(xì)胞。取4支EP管，分別編號(hào)為A、B、C、D，均加入200 μL細(xì)胞懸液。A管加入10 μL CD44抗體，B管加入10 μL CD45抗體，D管加入10 μL PBS作為陰性對(duì)照，4 ℃避光孵育40 min。離心后3管予FACS buffer重懸細(xì)胞，并加入20 μL熒光二抗。C管加入10 μL用FITC標(biāo)記的CD29抗體，4管在4 ℃條件下避光孵育20 min，1 000 r/min離心5 min，F(xiàn)ACS buffer重懸細(xì)胞。上流式細(xì)胞儀檢測BMSCs表面CD29、CD44、CD45表達(dá)情況，以cot fit軟件分析結(jié)果。BMSCs鑒定標(biāo)志為CD29、CD44高表達(dá)，CD45低表達(dá)。結(jié)果顯示，細(xì)胞表面抗原CD29陽性表達(dá)率為92.23%、CD44陽性表達(dá)率為80.01%，CD45陽性表達(dá)率為1.91%，證實(shí)其為BMSCs。

1.2.2 成軟骨分化潛能鑒定 取融合至90%以上的第2代BMSCs，給予成軟骨分化誘導(dǎo)液2 mL(含10% FBS的DMEM-HG培養(yǎng)基，加入10 ng/mL TGF-β1、10 ng/mL IGF-1、37.5 μg/mL維生素C、6.25 μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白)進(jìn)行培養(yǎng)，14天后常規(guī)進(jìn)行HE染色和阿爾新藍(lán)染色，400倍光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況并拍照記錄。HE染色顯示核周細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黑色顆粒、阿爾新藍(lán)染色顯示細(xì)胞間出現(xiàn)天藍(lán)色物質(zhì)則表明BMSCs出現(xiàn)軟骨分化。結(jié)果顯示，HE染色可見細(xì)胞形態(tài)為多角形或多邊形，有多個(gè)凸起，核周細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見黑色顆粒；阿爾新藍(lán)染色可見細(xì)胞間大量天藍(lán)色物質(zhì)彌漫分布；證實(shí)BMSCs具有成軟骨分化潛能。見插頁Ⅰ圖1。

1.2.3 成骨分化潛能鑒定 取融合至90%以上的第2代BMSCs，給予成骨分化誘導(dǎo)液(含10% FBS的DMEM-HG培養(yǎng)基，加入4×10-6g/L地塞米松、0.5 g/L維生素C、1 g/L β-磷酸甘油鈉)進(jìn)行培養(yǎng)，14天后常規(guī)行茜素紅染色及ALP染色，200倍光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況并拍照記錄。茜素紅染色顯示紅色鈣結(jié)節(jié)，ALP染色顯示細(xì)胞呈粉紅色或紅色、細(xì)胞核為藍(lán)色則表明BMSCs出現(xiàn)成骨分化。結(jié)果顯示，茜素紅染色可見大量紅色鈣結(jié)節(jié)，ALP染色可見細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕褐色的顆粒和塊狀沉淀；證實(shí)BMSCs具有成骨分化潛能。見插頁Ⅰ圖2。

1.3 bFGF對(duì)BMSCs成骨分化的影響 取第2代BMSCs，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/L，接種于24孔板，每孔200 μL。常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞貼壁融合至90%以上，將細(xì)胞隨機(jī)分為6組，分別加入含0、1、5、10、50、100 ng/mL bFGF的成骨誘導(dǎo)液(成分同1.2.3)。分別于培養(yǎng)第4、7、10、14天抽取培養(yǎng)液200 μL，采用PNP比色法檢測ALP表達(dá)，放射免疫分析法檢測骨鈣素(OC)表達(dá)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

2 結(jié)果

隨著作用時(shí)間的延長，BMSCs經(jīng)不同濃度bFGF作用后ALP及OC表達(dá)均呈升高趨勢。相同作用時(shí)間下，BMSCs經(jīng)50 ng/mL bFGF作用后ALP及OC表達(dá)均高于0、1、5、10、100 ng/mL bFGF作用后(P均<0.01)。見表1、2。

表1 BMSCs經(jīng)不同濃度bFGF作用后ALP表達(dá)

注：與0、1、5、10、100 ng/mL bFGF作用后相同時(shí)間比較，*P<0.01。

表2 BMSCs經(jīng)不同濃度bFGF作用后OC表達(dá)

注：與0、1、5、10、100 ng/mL bFGF作用后相同時(shí)間比較，*P<0.01。

3 討論

BMSCs具有干細(xì)胞的共同特性，能夠自我增殖并具有多向分化潛能；其在特定條件和細(xì)胞因子誘導(dǎo)下，可分化為中胚層成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肌細(xì)胞等，也可跨越胚層界限，向外胚層神經(jīng)元樣細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化[2, 3]。同時(shí)BMSCs滿足了組織工程種子細(xì)胞的基本要素：①具有良好的成骨能力，增殖能力強(qiáng)；②容易建立較穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系，易于分離培養(yǎng)；③取材方便，抗原性低，對(duì)機(jī)體損傷小[4]。將體外培養(yǎng)的BMSCs植入體內(nèi)可修復(fù)骨組織缺損，為骨缺損、骨疾病的再生修復(fù)開辟新途徑。Ma等[5]建立股骨頭缺血性壞死的動(dòng)物模型，將骨形成蛋白2和血管生長因子修飾后的自體BMSCs植入病灶，發(fā)現(xiàn)有明顯的新骨形成。但單獨(dú)使用BMSCs取材數(shù)量有限，且難以達(dá)到滿意的成骨效果。本研究分離兔BMSCs后采用體外全血貼壁法進(jìn)行培養(yǎng)，鑒定結(jié)果顯示其高表達(dá)CD29、CD44，低表達(dá)CD45，且染色結(jié)果顯示其具有成軟骨和成骨分化潛能，證實(shí)分離的細(xì)胞為BMSCs。生長因子是一類具有控制細(xì)胞生長和活性，促進(jìn)或抑制細(xì)胞增殖、分化、遷移和基因表達(dá)等生物效應(yīng)的多肽類物質(zhì)[6]。目前發(fā)現(xiàn)的骨生長因子主要包括骨形成蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子、酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF)和bFGF、血小板源生長因子、胰島素生長因子等[7]。bFGF可刺激成纖維母細(xì)胞的生成，是目前發(fā)現(xiàn)的最有效的血管生成因子之一，能促進(jìn)骨、軟骨、神經(jīng)和軟組織修復(fù)[8，9]；可激發(fā)促進(jìn)BMSCs向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化的潛能，具有體內(nèi)外誘導(dǎo)成骨和成血管作用，因此可以促進(jìn)骨修復(fù)[10，11]。Kuroda等[12]研究發(fā)現(xiàn)，bFGF能明顯增加BMSCs的增殖速度。鄭磊等[13]研究也證實(shí)，bFGF可增加骨髓基質(zhì)細(xì)胞的貼壁率，隨著bFGF濃度(0～10 ng/mL)的上升，細(xì)胞貼壁率逐漸升高。

ALP在多種人體組織細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞成骨活動(dòng)時(shí)，其ALP水平和活力均升高，可作為反映細(xì)胞成骨活性的相關(guān)指標(biāo)[14]。OC是由成骨細(xì)胞分泌的一種活性多肽，在骨代謝調(diào)節(jié)中起重要作用，其水平亦能反映成骨細(xì)胞活性。本研究結(jié)果顯示，隨著作用時(shí)間的延長，BMSCs經(jīng)不同濃度bFGF作用后ALP及OC表達(dá)均呈升高趨勢，說明bFGF促進(jìn)BMSCs成骨分化的作用呈時(shí)間依賴性；但相同作用時(shí)間下BMSCs經(jīng)50 ng/mL bFGF作用后ALP及OC表達(dá)均高于0、1、5、10、100 ng/mL bFGF作用后，說明bFGF的最佳作用濃度為50 ng/mL。Varkey[15]研究發(fā)現(xiàn)，bFGF的濃度以10 ng/mL為分界，低于10 ng/mL可促進(jìn)鈣鹽沉積，而高于10 ng/mL則表現(xiàn)為抑制作用。在對(duì)人牙組織干細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，bFGF對(duì)ALP的表達(dá)有抑制作用[16]。因此，bFGF的濃度可能會(huì)對(duì)BMSCs的生物特性和分化能力產(chǎn)生不同影響；低濃度時(shí)可促進(jìn)鈣鹽沉積，而高濃度時(shí)則可抑制成骨活性[17]。

綜上所述，bFGF能促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，并呈時(shí)間依賴性；其最佳作用濃度為50 ng/mL。bFGF與BMSCs的相互作用過程相當(dāng)復(fù)雜，加入因子的時(shí)間、劑量、作用持續(xù)時(shí)間等目前尚不明確，仍需進(jìn)一步研究。

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Influence of basic fibroblast growth factor on differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells into osteoblasts

HUXiaowei1,LIWei,WEIDalong,LAOShan

(FirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To investigate the effects of basic fibroblast growth factor (bFGF) on differentiation of the rabbit′s bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) into osteoblasts, and to explore the optimal concentration of bFGF. Methods The BMSCs were cultured by the whole blood adherent method and then surface antibody (CD29, CD45 and CD45 by flow cytometry) and osteoblasts (by HE staining and alcian blue staining), and cartilage cells [by alizarin red staining and alkaline phosphatase (ALP) staining] were identified. The 2nd generated BMSCs were cultured with different concentrations (0， 1, 5, 10, 50, and 100 ng/mL) of bFGF. detecting alkaline phosphatase (ALP) with PNP colorimetric method and osteocalcin (OC) expression with radioimmunoassay (RIA) method on day 4, 7, 10 and 14 of culture. Results The positive rate of cell surface antigen CD29 was 92.23%, CD44 was 80.01%, and CD45 was 1.91%. HE staining showed that the cell morphology became polygonal or polygonal and there were multiple protrusions, the black particles could be seen within perinuclear cytoplasm. Alcian blue staining showed that a large number of azure materials diffused. A large number of red calcium nodules were seen by Alizarin red staining. The brown granules and massive precipitation in the cytoplasm were seen by ALP staining, which confirmed the cells were BMSCs with the potential of differentiating into cartilages and osteoblasts. The expression of ALP and OC in the 2nd generation of BMSCs was increased with different concentrations of bFGF as the time passes by. The expression of ALP and OC in BMSCs treated with 50 ng/mg bFGF was higher than that of BMSCs treated with 0, 1, 5, 10 and 100 ng/mL bFGF at the same time (allP<0.01). Conclusion The bFGF promotes BMSCs differentiating into osteoblasts which is in a time-dependent manner and the optimal concentration is 50 ng/mg.

bone marrow mesenchymal stem cells; basic fibroblast growth factor; osteoblast differentiation; rabbit

廣西中醫(yī)藥民族醫(yī)藥自籌經(jīng)費(fèi)科研課題(GZZC15-33)。

戶小偉(1982-)，男，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)楣撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及骨壞死修復(fù)。E-mail： huxiaowei555@qq.com

李巍(1984-)，男，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)橥诵行躁P(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)骨壞死及軟骨損傷的修復(fù)。E-mail： lw5hj@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.48.003

R329

A

1002-266X(2016)48-0008-04

2016-02-15)