莪芪抗瘤方對二乙基亞硝胺（DEN）誘導(dǎo)肝癌模型鼠腫瘤微環(huán)境調(diào)控機制的研究

申秀云，陳曦，趙雁力

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院， 福建 福州 350122

莪芪抗瘤方對二乙基亞硝胺（DEN）誘導(dǎo)肝癌模型鼠腫瘤微環(huán)境調(diào)控機制的研究

申秀云1，陳曦1，趙雁力2

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院， 福建 福州 350122

目的：研究莪芪抗瘤方對二乙基亞硝胺（DEN）誘導(dǎo)肝癌模型鼠腫瘤微環(huán)境的調(diào)控機制。方法：建立DEN誘導(dǎo)大鼠肝癌模型，造模4周后，70只大鼠隨機分成7組，空白組，模型組，順鉑治療組，單純祛邪中藥組，莪芪抗瘤方組隨機分為高、中、低劑量組。每組10只?？瞻捉M正常喂養(yǎng)，模型組每日12.5 mg/kg體重維持DEN攝入量喂養(yǎng)，莪芪抗瘤方中劑量組、單純祛邪中藥組、順鉑治療組，分別以8 mL/kg體重劑量灌藥；莪芪抗瘤方高、低劑量組分別以12 mL/kg體重、4 mL/kg體重劑量灌藥。16周實驗結(jié)束，測定大鼠血清白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達。結(jié)果：莪芪抗瘤方組IL-1β與單純祛邪中藥組、空白組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與順鉑治療組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；莪芪抗瘤方組IL-2與單純祛邪中藥組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；莪芪抗瘤方組IL-2、TNF-α與空白組、順鉑治療組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：莪芪抗瘤方能抑制肝癌大鼠模型血清中IL-1β表達，抑制腫瘤組織血管的形成和浸潤，促進IL-2的分泌，增強免疫力，抑制腫瘤的形成，在肝癌形成過程中具有一定的延緩和保護作用

莪芪抗瘤方；肝癌；白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）；白細(xì)胞介素-2（IL-2）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）

原發(fā)性肝癌是危害人類健康的重要惡性腫瘤之一，全球每年肝癌新發(fā)病例數(shù)約為78.25萬人，居所有惡性腫瘤發(fā)病率的第6位[1]。全世界每年新發(fā)肝癌約42%出現(xiàn)在我國，肝癌在我國每年發(fā)病和死亡人數(shù)分別約在36萬和35萬，其發(fā)病率是僅次于肺癌排第2位的惡性腫瘤。由于肝癌發(fā)病率高，治療難度大，死亡率高，預(yù)后差，故對其防治工作尤為重要。然而針對肝癌的治療，至今仍缺少確切有效的藥物，首選仍為手術(shù)治療，或局部消融治療、經(jīng)肝動脈介入治療、分子靶向藥物治療、系統(tǒng)化療、生物治療等[2]。由于大部分病人確診時已為晚期，病人肝功能和體質(zhì)較差，上述方法毒副反應(yīng)大，患者很難耐受上述治療，故限制了其應(yīng)用。

中醫(yī)藥在肝癌的藥物防治中越來越受到重視。莪芪抗瘤方是臨床效驗方，經(jīng)多年臨床實踐驗證療效確切。綜合前期的研究成果，通過檢測增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、抑癌基因(P53)等相關(guān)基因蛋白的陽性細(xì)胞數(shù)，已揭示莪芪抗瘤方在大鼠誘癌過程中，具有抑制或延緩肝癌形成的作用[3]。為進一步探討該方在肝癌形成過程中的作用機制，本實驗在二乙基亞硝胺(DEN)誘導(dǎo)大鼠肝癌過程中，通過檢測各組大鼠間的腫瘤相關(guān)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達，以揭示莪芪抗瘤方對肝癌模型鼠腫瘤形成過程中的治療作用機制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級Wistar大鼠，體重(160±10)g，共70只，雄性，鼠齡6周，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。DEN 0.95 g/mL(美國sigma公司產(chǎn)品，產(chǎn)品貨號：N0756-10 ML，Lot#049K1613V，PCode：1001789545)；順鉑凍干粉，(美國sigma公司產(chǎn)品，產(chǎn)品貨號：P4394-25MG，Lot# MKBS6001V，PCode：1001875623)；莪芪抗瘤方中藥顆粒，購自福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院；單純祛邪中藥顆粒，購買自福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院；IL-1β放射免疫分析藥盒(批號：20150617)；IL-2放射免疫分析藥盒(批號：1507-0708-0806)；TNF-α 放射免疫分析藥盒(批號：150620)；均購自北京北方生物技術(shù)研究所。

1.2 動物模型的制作 自行制作DEN誘導(dǎo)大鼠肝癌模型，取新鮮定量配制100 ppm濃度的DEN水溶液作為大鼠自由飲用水，避光存放，隔日更換，每日維持DEN攝入量約12.5 mg/kg，連續(xù)給藥16周至實驗結(jié)束，同時給予標(biāo)準(zhǔn)塊狀食料喂養(yǎng)。

1.3 莪芪抗瘤方藥物的制備 莪芪抗瘤方組成：莪術(shù)、黃芪各15 g，白術(shù)、白花蛇舌草、巴戟天、菟絲子、鱉甲各12 g，青皮9 g(成人量)等組成，制成中藥顆粒，使用時蒸餾水溶解，每1 mL約含原生藥1 g。

1.4 分組給藥 造模4周后，70只大鼠隨機分成7組，空白組，模型組，順鉑治療組，單純祛邪中藥組(莪術(shù)15 g、白花蛇舌草12 g)，莪芪抗瘤方組隨機分為高、中、低劑量組。每組10只。空白組正常喂養(yǎng)，模型組每日仍以12.5 mg/kg體重維持DEN攝入量繼續(xù)喂養(yǎng)，莪芪抗瘤方中劑量組、單純祛邪中藥組、順鉑治療組，分別以8 mL/kg體重劑量灌藥；莪芪抗瘤方高、低劑量組分別以12 mL/kg體重、4 mL/kg體重劑量灌藥，每周6次，直到16周實驗結(jié)束。

1.5 免疫系統(tǒng)指標(biāo)檢測 造模第16周末，各組實驗鼠均進行心臟采血3mL，4℃離心取血清，將分離后的血清放在-20℃冰箱保存，統(tǒng)一采用放射免疫分析法測定各組IL-1β、IL-2、TNF-α等，操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明進行。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 運用SPSS20.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以()表示，行t檢驗；計數(shù)資料以率表示，行χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察 造模4周后各組大鼠均出現(xiàn)不同程度的體重減輕，食欲不振，活動減少，精神萎靡，豎毛等表現(xiàn)。莪芪抗瘤方高、中、低劑量組及單純祛邪中藥組于用藥干預(yù)后大鼠體重有所回升；順鉑治療組大鼠消瘦，活動極少，并出現(xiàn)大鼠死亡；模型組大鼠消瘦，活動情況尚可；正常組大鼠生長良好，未見病態(tài)表現(xiàn)。造模10周后模型組、順鉑治療組大鼠出現(xiàn)不同程度的恐懼，畏聲，暴躁，攻擊性增加等表現(xiàn)；莪芪抗瘤方組、單純祛邪中藥組大鼠情緒相對穩(wěn)定。造模15周后，由于氣候變化，大鼠受到驚嚇等因素，個別大鼠出現(xiàn)驚悸，怔忡，反應(yīng)遲鈍，耳部、爪部皮膚色淡白等表現(xiàn)，同時可見心動過速，偶見隨心臟搏動出現(xiàn)的點頭運動，考慮肝癌導(dǎo)致的血液動力學(xué)改變，有效循環(huán)血容量下降引起大鼠死亡。實驗第16周末將大鼠處死。

2.2 肝組織學(xué)檢查 見圖1～4。觀察莪芪抗瘤方對肝癌發(fā)生、肝組織形態(tài)改變及大鼠死亡的影響。實驗第16周末，模型組10只大鼠除2只死于急性重癥肝炎外，余下8只均形成肝癌，可見癌細(xì)胞向周圍組織和血管大面積浸潤，伴有癌灶內(nèi)出血、壞死等。順鉑治療組有6只大鼠均形成肝癌，伴有灶內(nèi)出血、壞死。單純祛邪中藥組有5只大鼠均形成肝癌，病灶面積較大，可見癌細(xì)胞向周圍組織和血管浸潤。莪芪抗瘤方組有22只大鼠全部形成肝癌，但癌結(jié)節(jié)較其余各組數(shù)量少，且病灶較小、壞死和出血程度較輕，莪芪抗瘤方組給藥劑量越大，癌結(jié)節(jié)就越少。正常組大鼠肝組織細(xì)胞形態(tài)及排列正常。實驗16周末，順鉑治療組10只大鼠死亡4只，死亡率40%，單純祛邪中藥組10只大鼠死亡5只，死亡率50%，模型組10只大鼠死亡10只，死亡率100%；莪芪抗瘤方高、中、低劑量組共30只大鼠死亡8只，死亡率26.7%，正常組大鼠出現(xiàn)恐懼怔忡表現(xiàn)，未出現(xiàn)死亡。

圖1 莪芪抗瘤方組（光鏡×10）

圖2 順鉑治療組（光鏡×10）

圖3 單純祛邪中藥組（光鏡×10）

圖4 空白組（光鏡×10）

2.3 各組大鼠血清IL-1β、IL-2、TNF-α變化比較 見表1。莪芪抗瘤方組IL-1β與單純祛邪中藥組、空白組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與順鉑治療組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；莪芪抗瘤方組IL-2與單純祛邪中藥組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；莪芪抗瘤方組IL-2、TNF-α與空白組、順鉑治療組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各組大鼠血清IL-1β、IL-2、TNF-α變化比較()

表1 各組大鼠血清IL-1β、IL-2、TNF-α變化比較()

與單純祛邪中藥組比較，①P＜0.05，順鉑治療組比較，②P＞0.05；與空白組比較，③P＜0.05

組別順鉑治療組單純祛邪中藥組莪芪抗瘤方組空白組n 6 5 2 2 6 I L -1 β ( n g / m L ) 0 . 2 5 ± 0 . 0 1 0 . 3 6 ± 0 . 0 9 0 . 2 3 ± 0 . 0 1①②③0 . 3 4 ± 0 . 0 8 I L -2 ( n g / m L ) 3 . 6 2 ± 0 . 5 6 1 . 8 9 ± 0 . 2 7 4 . 2 4 ± 0 . 5 9 6①②3 . 3 8 ± 0 . 3 4 T N F -α ( f m o l / m L ) 3 5 . 9 3 ± 1 . 0 9 3 4 . 3 6 ± 9 . 9 4 3 4 . 9 9 ± 6 . 9 7②4 6 . 5 0 ± 2 1 . 6 4

3 討論

莪芪抗瘤方針對原發(fā)性肝癌具有虛、瘀、毒的基本病機特點研創(chuàng)，具有補虛扶正、祛瘀解毒之功。主藥莪術(shù)活血化瘀，以消癥瘕癌腫；黃芪益氣健脾，補虛扶正。經(jīng)多年臨床驗證，防治肝癌療效確切。在DEN誘導(dǎo)大鼠肝癌實驗過程中，中藥治療組大鼠一般情況及精神狀況明顯好于其余各組，死亡率明顯低于各對照組。在誘癌過程中，肝癌大鼠模型血清中IL-1β、IL-2、TNF-α的水平變化提示，莪芪抗瘤方能明顯抑制大鼠血清中IL-1β的分泌，促進IL-2的分泌，能抑制大鼠的誘癌過程，在大鼠肝癌形成過程中確有一定延緩和保護作用。

IL-1β是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，研究發(fā)現(xiàn)IL-1β是腫瘤組織血管形成和浸潤的重要因素。同時IL-1β基因多態(tài)性與乙型肝炎病毒感染導(dǎo)致的肝細(xì)胞癌有關(guān)IL-2通過增加細(xì)胞毒T細(xì)胞活性、促進NK細(xì)胞增殖并產(chǎn)生干擾素、促進B細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白而發(fā)揮抗腫瘤作用。研究顯示肝癌及肝硬化患者血清IL-2水平較慢性乙型肝炎患者及正常人明顯降低，因而了解肝癌患者IL-2水平對判斷病情及預(yù)后是非常重要的。TNF-α是一種具有直接抗腫瘤作用的細(xì)胞因子，主要參與抗感染、免疫調(diào)節(jié)與直接調(diào)節(jié)單核細(xì)胞的成熟及增強其活性，在機體的免疫防御系統(tǒng)中起重要作用[4]。顧星等[5]研究表明，肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化于TNF-α和NF-κB具有明顯相關(guān)性。研究結(jié)果顯示，莪芪抗瘤方在DEN誘導(dǎo)大鼠肝癌形成和發(fā)展的過程中，IL-1β水平明顯低于各對照組，IL-2水平明顯高于其余各對照組，TNF-α水平與其余各組未見明顯差異，說明莪芪抗瘤方在DEN誘導(dǎo)的大鼠肝癌形成和發(fā)展過程中的延緩和保護作用，可能與其抑制IL-1β的表達，抑制腫瘤組織血管的形成和浸潤，同時促進IL-2分泌，增強免疫功能，直接殺傷腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。

大量實踐證明，肝癌是中醫(yī)藥治療效果較好的腫瘤之一。中藥及其復(fù)方能促進多種細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，進而促進免疫活性細(xì)胞的生長、分化、活化，發(fā)揮免疫監(jiān)視效應(yīng)。隨著對肝癌認(rèn)識的不斷深入，中醫(yī)藥治療肝癌的作用越發(fā)突顯，在肝癌治療過程中，中醫(yī)藥學(xué)在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，采用辨證論治、扶正祛邪兼顧的方法治療肝癌，扶正可提升機體的免疫力，祛邪可殺滅腫瘤細(xì)胞；與此同時，亦減輕了各種治療手段如化療藥物的毒副作用，從而減輕了患者的痛苦，提高了患者的生存質(zhì)量和時間。另據(jù)文獻記載，中醫(yī)不同治法對癌基因表達水平存在差異，活血化瘀類中藥，能夠抑制血管內(nèi)皮生長因子，同時造成抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的Bcl-2表達下降，從而降低了腫瘤的生長的時間與其發(fā)生轉(zhuǎn)移的概率[6]。益氣活血化瘀法通過對TGF-β1[7]及Smad4的表達水平的調(diào)節(jié)[8]，可對肝癌的生成產(chǎn)生抑制作用，同時對癌前病變具有一定的修復(fù)作用。健脾益氣法對肝癌的治療是多方位的，其可以下調(diào)TGF-β1誘導(dǎo)的腫瘤的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，抑制肝癌細(xì)胞的快速生長、浸潤和轉(zhuǎn)移，同時可以下調(diào)Gq蛋白激活的花生四烯酸-HETEs代謝通路，促進肝癌細(xì)胞凋亡，對肝癌的生成和凋亡具有重要作用[9]。實驗表明，不同中醫(yī)治法干預(yù)治療肝癌的靶點不同，這可能成為揭示中醫(yī)辨證論治的一個途徑。由此可見，中醫(yī)學(xué)的整體觀與現(xiàn)代綜合治療腫瘤的觀點相一致，今后應(yīng)在不同中藥處方之間進行比較研究，從中找出差異，篩選出治療肝癌的最佳中藥組方，為今后重要的研究方向之一。

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（責(zé)任編輯：馬力）

R285.5

A

0256-7415（2016）03-0234-03

10.13457/j.cnki.jncm.2016.03.091

2015-10-25

福建省自然科學(xué)基金項目（2012J01395）

申秀云（1960-），女，教授，主要從事《內(nèi)經(jīng)》病證理論及臨床應(yīng)用研究工作。