益氣化痰方對慢性阻塞性肺疾病小鼠肺功能及IL-17、TNF-α的影響

詹少鋒，單麗囡，馮立志

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006

益氣化痰方對慢性阻塞性肺疾病小鼠肺功能及IL-17、TNF-α的影響

詹少鋒1，單麗囡2，馮立志2

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006

目的：觀察益氣化痰方對慢性阻塞性肺疾病小鼠的肺功能及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）的影響。方法：將60只C57BL小鼠隨機(jī)分成6組，分別是正常對照組、COPD模型組、低劑量中藥組、中劑量中藥組、高劑量中藥組、地塞米松組，每組10只。香煙煙熏方法建立慢性阻塞性肺疾病小鼠模型，給藥后分別觀察小鼠肺功能以及對肺泡灌洗液中TNF-α、IL-17的變化。結(jié)果：與正常對照組相比，COPD模型組吸氣峰流量（PIF）、呼氣峰流量（PEF）及每分鐘通氣量（MV）數(shù)值均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），低、中、高劑量的益氣化痰方均能明顯改善COPD小鼠氣道的高反應(yīng)狀態(tài)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。與COPD模型組比較，中、高劑量組肺泡灌洗液中IL-17和TNF-α逐漸降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論：益氣化痰方能明顯改善COPD小鼠的氣道高反應(yīng)，同時降低氣道炎癥反應(yīng)。

慢性阻塞性肺疾?。灰鏆饣捣?；肺功能；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）；動物實驗

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是我國呼吸系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病，患病率居高不下，目前尚無確切方法阻斷慢性阻塞性肺疾病肺功能下降的進(jìn)程。雖然現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療方法在本病急性加重期較為多樣化和效果顯著，但從本病全程防治來講，中醫(yī)藥療法仍然有重要的地位和作用。主要體現(xiàn)在穩(wěn)定期扶助正氣，減少未來急性加重急性發(fā)作次數(shù)和風(fēng)險，提高運(yùn)動耐量，減少合并癥和改善生活質(zhì)量[1]。本研究從中醫(yī)學(xué)“肺主氣”“肺主通調(diào)水道”的理論出發(fā)，通過觀察益氣化痰方對肺功能及氣道炎性作用，探討益氣化痰方對COPD可能的作用機(jī)制，結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物分組 60只C57BL小鼠(廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為正常對照組，COPD模型組，低劑量中藥組，中劑量中藥組，高劑量中藥組，地塞米松組。

1.2 試劑 小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)(上海依科賽生物制品有限公司)、白細(xì)胞介素-17(IL-17)ELISA試劑盒(上海依科賽生物制品有限公司)。

1.3 方藥組成及制備 益氣化痰方選自(《時氏醫(yī)道》保元湯)：由黃芪、黨參、炙甘草組成；合二陳湯(取自《太平惠民和劑局方》)：由陳皮、半夏、茯苓組成。具體實驗動物用藥量折算標(biāo)準(zhǔn)如下[2]：小鼠(20 g)用量 =中藥總量 /人的劑量× 0.0028=0.147 g；0.147/2 mL=0.735 g/mL，即為中劑量；0.147 g/mL即為高劑量；0.367 g/mL即為低劑量。中藥煎劑制作過程如下：將上方中藥置8倍溫水中浸泡0.5 h，沸騰后文火煎煮4 h，注意均勻攪拌，取汁后經(jīng)三層紗布過濾；第2次和第3次煎煮均分別以6倍水文火煎煮2 h，同樣方法取汁，合并3次藥液，置水浴箱內(nèi)濃縮。藥液常溫冷卻后，至4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 COPD小鼠模型建立 采用熏煙的方法建立小鼠COPD模型[3]，將小鼠置于PAB-S200被動吸煙動物染毒系統(tǒng)的染毒箱內(nèi)，箱體的頂部有兩個1.5 cm×1.5 cm的小孔，可以讓箱體內(nèi)空氣與箱外保持相通，有效避免箱內(nèi)的小鼠因缺氧而導(dǎo)致死亡。點燃10根椰樹牌香煙(焦油量12 mg，煙氣煙堿量1.2 mg，煙氣一氧化碳量14 mg)，放入染毒箱內(nèi)，關(guān)閉染毒箱，1 h后將小鼠取出，休息15 min后，再次點燃10根香煙，將小鼠繼續(xù)放置染毒箱內(nèi)1 h。每天熏煙1次，每次2 h，每周連續(xù)熏煙6天，熏煙20周。

1.5 方法 正常對照組小鼠，正常飼養(yǎng)，除生理鹽水灌胃外，不加任何其他干預(yù)；COPD模型組小鼠，按照上述造模方法，連續(xù)熏煙20周；低、中、高劑量中藥組小鼠，按照上述造模方法連續(xù)熏煙4周，第5周開始，每天在熏煙前1 h，低、中、高劑量中藥組小鼠分別按照0.147 g/mL、0.735 g/mL、0.367 g/mL的3個劑量給予灌胃益氣化痰中藥湯劑處理，給藥處理一直持續(xù)16周到實驗結(jié)束；地塞米松組小鼠則在熏煙處理的第5周開始，每天在熏煙前30 min，按照10 μg/10 g體重的劑量腹腔注射地塞米松針劑，一直持續(xù)16周到實驗結(jié)束。

1.6 肺功能檢測 小鼠肺功能測定：采用Buxco的非束縛清醒動物全身體積描記系統(tǒng)檢測各組小鼠的肺功能，具體檢測指標(biāo)為吸氣峰流量(peak inspiratory flow，PIF)、呼氣峰流量(peak expiratory flow，PEF)及每分鐘通氣量(minute volume， MV)。

1.7 肺泡灌洗液檢測 小鼠支氣管肺泡灌洗液((Bronchial Alveolar Lavage Fluid，BALF)的收集及處理：用細(xì)棉線在左肺門根部結(jié)扎左側(cè)肺葉。在胸部切口處向上沿正中線剪開頸部皮膚，鈍性分離軟組織，暴露氣管，在甲狀腺位置做T型切口切開氣管，用頭皮留置針的塑料管做氣管插管，用注射器吸取PBS溶液0.5 mL通過插管緩慢注入右肺，可見右側(cè)肺部逐漸膨脹，顏色由暗紅色變成粉白色，待所有PBS注入完畢，輕輕按摩肺部，10 s后回抽液體，重復(fù)此過程2次，回收率在80%左右，回抽的液體放入1.5 mL無菌EP管中，1500 rpm，離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移到EP管，-80℃冷凍保存。

2 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 基本情況 在建模開始前，模型組和對照組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，建模開始后對照組小鼠體質(zhì)量呈穩(wěn)定上升趨勢，而建模組小鼠在熏煙開始的第1月精神萎靡、厭食水，體質(zhì)量進(jìn)行性下降，直到1月之后才逐漸適應(yīng)，體質(zhì)量緩慢上升，至建模成功的6月后模型組小鼠和對照組小鼠體質(zhì)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

3.2 各組小鼠肺功能數(shù)值情況比較 見表1。與正常對照組比較，COPD模型組PIF、PEF和MV均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；與COPD模型組比較，低、中、高劑量中藥組PIF，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.05)。低、中、高劑量中藥組PEF和MV比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。地塞米松組PIF、PEF和MV，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各組小鼠肺功能數(shù)值情況比較()

表1 各組小鼠肺功能數(shù)值情況比較()

與正常對照組比較，①P＜0.01；與COPD模型組比較，②P＜0.05，③P＜0.01

組別正常對照組C O P D模型組低劑量中藥組中劑量中藥組高劑量中藥組地塞米松組n 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 P I F ( m L / s ) 4 . 4 9 ± 0 . 2 3 2 . 7 3 ± 0 . 2 7①2 . 9 7 ± 0 . 1 9②3 . 2 1 ± 0 . 2 3③3 . 4 4 ± 0 . 1 3③2 . 6 5 ± 0 . 1 4 P E F ( m L / s ) 3 . 2 0 ± 0 . 1 5 1 . 8 3 ± 0 . 1 8①2 . 0 2 ± 0 . 1 6③2 . 2 3 ± 0 . 1 6③2 . 4 8 ± 0 . 1 0③1 . 9 4 ± 0 . 1 5 M V ( m L / s ) 3 8 . 9 0 ± 2 . 3 9 2 5 . 3 1 ± 1 . 9 9①2 9 . 0 5 ± 1 . 9 4③3 2 . 3 3 ± 1 . 4 4③3 5 . 1 ± 0 . 8 6③2 5 . 9 4 ± 1 . 7 6

3.3 各組小鼠BALF中IL-17和TNF-α含量情況比較 見表2。與正常對照組比較，COPD模型組BALF中IL-17和TNF-α，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；與COPD模型組比較，低、中、高劑量中藥組及地塞米松組BALF中IL-17，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；中、高劑量中藥組及地塞米松組BALF中TNF-α，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

表2 各組小鼠BALF中IL-17和TNF-α含量情況()pg/mL

表2 各組小鼠BALF中IL-17和TNF-α含量情況()pg/mL

與正常對照組比較，①P＜0.01；與COPD模型組比較，②P＜0.01

組別正常對照組C O P D模型組低劑量中藥組中劑量中藥組高劑量中藥組地塞米松組n 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 I L -1 7 1 8 . 9 6 ± 5 . 8 1 1 5 8 . 8 1 ± 2 0 . 3 0①1 2 1 . 0 8 ± 1 8 . 0 0②9 8 . 0 0 ± 1 2 . 6 9②6 6 . 2 2 ± 1 3 . 0 3②4 0 . 8 1 ± 1 0 . 1 5②T N F -α 2 2 . 0 5 ± 4 . 3 3 1 5 1 . 2 2 ± 3 0 . 0 0①1 2 3 . 1 1 ± 2 2 . 7 9 9 2 . 8 0 ± 1 5 . 5 6②5 3 . 9 4 ± 1 5 . 5 1②3 7 . 8 6 ± 1 0 . 6 9②

4 討論

慢性阻塞性肺疾病是一種氣流受限的慢性氣道炎癥性疾病。有毒顆粒或氣體(如香煙煙霧、生物燃料等)刺激支氣管黏膜上皮，募集中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等天然免疫細(xì)胞，并進(jìn)一步激活獲得性免疫細(xì)胞，天然免疫與獲得性免疫協(xié)同作用，造成持續(xù)的炎癥損傷與異常修復(fù)，從而造成不可逆性氣流受限，導(dǎo)致黏液高分泌狀態(tài)[2]。目前認(rèn)為，COPD的發(fā)病是由遺傳、環(huán)境、感染及免疫等多因素相互作用所致，己知氣道免疫系統(tǒng)異常所致的炎癥反應(yīng)在COPD發(fā)病中起著重要作用，其中細(xì)胞炎癥因子是多種氣道類疾病如哮喘、COPD和肺部感染的重要介質(zhì)之一。研究發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子IL-17在COPD發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用[4]。

IL-17具有強(qiáng)大的致炎和免疫趨化的作用，能夠誘導(dǎo)早期炎癥發(fā)生，使氣道中性粒細(xì)胞募集和活化增強(qiáng)，促進(jìn)氣道炎癥的發(fā)生[5]。IL-17還可協(xié)同活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)，刺激支氣管上皮杯狀細(xì)胞與黏膜下腺體使黏液分泌增加，導(dǎo)致氣流受限，從而在氣道重塑中發(fā)揮作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，在COPD小鼠模型的BALF及肺組織中IL-17濃度較正常組升高，且肺組織中IL-17的濃度與BALF的中性粒細(xì)胞百分比呈正相關(guān)[7]。使用IL-17氣道給藥刺激后，支氣管肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞的絕對數(shù)量增加，但以IL-17中和抗體預(yù)處理的小鼠組肺灌洗液中中性粒細(xì)胞絕對數(shù)量則顯著減少。IL-17是中性粒細(xì)胞強(qiáng)效的活化劑，研究發(fā)現(xiàn)IL-17能夠上調(diào)趨化因子的表達(dá)升高，招募中性粒細(xì)胞和炎癥因子到達(dá)靶部位，從而造成感染部位的組織破壞[8]。本研究結(jié)果提示，益氣化痰方能夠降低COPD小鼠BALF的IL-17、TNF-α的含量，減輕COPD小鼠肺組織病理損害，保護(hù)肺通氣功能。隨著炎癥指標(biāo)的改善，益氣化痰方可以降低COPD小鼠肺通氣功能PIF、PEF和MV數(shù)值，從而改善COPD小鼠氣道的氣流受限狀態(tài)。

根據(jù)COPD的中醫(yī)病因病機(jī)特點，外邪襲肺或痰濁阻肺，引發(fā)咳喘，久咳久喘必傷肺氣，肺氣耗傷，宣肅無力，通調(diào)失司，又致痰濁內(nèi)生，如此肺虛與痰濁互為因果，往復(fù)無端循環(huán)，遷延不愈，故氣虛痰阻貫穿整個疾病過程。肺脹病既是肺氣虛痰阻的結(jié)果，又是再致肺氣耗傷的直接原因。因此，益氣化痰方治療肺之本虛兼以痰阻標(biāo)實，有利于肺氣的恢復(fù)。

綜上所述，通過對COPD中西醫(yī)學(xué)特點的剖析，探討益氣化痰中藥對COPD小鼠模型氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性的調(diào)節(jié)作用，深入挖掘中醫(yī)藥療法的優(yōu)點，并結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)進(jìn)行研究作用機(jī)制，為中醫(yī)“肺主氣”“肺主通調(diào)水道”理論與益氣化痰治法的科學(xué)內(nèi)涵提供實驗依據(jù)。同時這對于發(fā)揮中醫(yī)藥治療優(yōu)勢，提高本病的防治效果有著重要的現(xiàn)實意義。

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（責(zé)任編輯：劉淑婷）

R285.5

A

0256-7415（2016）03-0221-03

10.13457/j.cnki.jncm.2016.02.087

2015-11-20

廣東省中醫(yī)藥局項目（20121231）；廣州中醫(yī)藥大學(xué)鄧鐵濤基金項目（25012604）

詹少鋒（1979-），男，醫(yī)學(xué)博士，主治醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥防治慢性阻塞性肺疾病。