中毒患者生物檢材中卡馬西平及其代謝物的氣相色譜質(zhì)譜分析

周麗屏，陳 糾，郭嘉明，劉移民

（廣州市職業(yè)病防治院職業(yè)衛(wèi)生評(píng)價(jià)檢測(cè)中心，廣東廣州 510620）

中毒患者生物檢材中卡馬西平及其代謝物的氣相色譜質(zhì)譜分析

周麗屏，陳 糾，郭嘉明，劉移民

（廣州市職業(yè)病防治院職業(yè)衛(wèi)生評(píng)價(jià)檢測(cè)中心，廣東廣州 510620）

目的 探討卡馬西平（CBZ）在中毒患者不同生物檢材中的主要代謝產(chǎn)物及其代謝途徑。方法 通過收集廣州市職業(yè)病防治院1例CBZ中毒患者服用CBZ約6 h后的胃液、血液及尿液，以未服用CBZ的正常人體液作為對(duì)照，采用氣相色譜質(zhì)譜法進(jìn)行分析，用NIST98譜庫(kù)檢索系統(tǒng)對(duì)所得質(zhì)譜圖進(jìn)行圖庫(kù)檢索，并根據(jù)質(zhì)譜裂解規(guī)律及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行圖譜解析，鑒定CBZ代謝物結(jié)構(gòu)，推斷其代謝途徑。結(jié)果在CBZ中毒患者胃液中檢出亞氨基茋（M1）1種代謝產(chǎn)物，血液中檢出M1、9-甲基吖啶（M2）、9-丙基-9，10-二氫化吖啶（M4）及未知代謝產(chǎn)物M3共4種代謝產(chǎn)物，尿液中檢出M1、M2、M4、吖啶（M5）、吖啶酮（M6）、9，10-二氫吖啶（M7）、10，11-環(huán)氧卡馬西平（M8）、9-吖啶甲醇（M9）、10，11-二羥卡馬西平（M10）、2-甲基-吖啶酮（M12）、4-甲基-吖啶酮（M13）及未知代謝產(chǎn)物M3和M11共13種代謝產(chǎn)物。M3和M11代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)仍需進(jìn)一步分離及鑒定。在胃液、血液和尿液中，CBZ的代謝物形式存在較大差異，且僅極少量以原藥形式在尿液中排出。結(jié)論 經(jīng)過氣相色譜質(zhì)譜分析和圖庫(kù)檢索，篩查鑒定出中毒患者體內(nèi)CBZ的13種代謝產(chǎn)物，并推斷其代謝途徑。

氣相色譜質(zhì)譜法；卡馬西平；代謝物

卡馬西平（carbamazepine，CBZ），化學(xué)名為5H-二苯并［b，f］氮雜卓艸-5-甲酰胺，是一種三環(huán)類抗驚厥藥物，臨床上常用于治療癲癇、三叉神經(jīng)痛以及雙相情感障礙等疾?。?］。服用CBZ后可引起頭暈、頭痛、乏力、復(fù)視及昏迷等不良反應(yīng)，超劑量使用可出現(xiàn)精神錯(cuò)亂、肌肉抽動(dòng)、震顫、角弓反張、反射異常、心跳加快、呼吸抑制、昏迷、休克甚至死亡［2］。Ju等［3］和朱旭等［4］認(rèn)為，CBZ在人體內(nèi)經(jīng)細(xì)胞色素P450酶系代謝為其活性代謝產(chǎn)物，環(huán)氧化CBZ及羥基化CBZ，它們?cè)俳?jīng)肝微粒體環(huán)氧化物酶進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為無活性的CBZ二元醇等代謝產(chǎn)物，最后通過尿液排出。Mathieu等［5］認(rèn)為，環(huán)氧化物酶的缺乏可能是引起CBZ不良反應(yīng)的主要原因，其毒性是由活性芳香環(huán)氧化中間代謝產(chǎn)物引起。目前，生物檢材中CBZ及其代謝物最常用的檢測(cè)方法為液相色譜法［6-7］、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法［8-9］和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法［10-11］，也有氣相色譜法［12］和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrome?try，GC-MS）［13-14］等檢測(cè)方法。但目前，鮮見對(duì)CBZ在人體中代謝產(chǎn)物的定性鑒定及代謝機(jī)制的深入研究。對(duì)不明原因的昏迷患者，快速確認(rèn)昏迷原因是臨床診治的迫切需求，考慮到GC-MS具有圖庫(kù)檢索功能，因此首選用GC-MS對(duì)中毒患者的生物檢材進(jìn)行定性分析。本研究選用CBZ中毒患者的胃液、血液及尿液同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，旨在研究CBZ進(jìn)入人體后的代謝途徑及機(jī)制。本研究采用GC-MS聯(lián)用儀，液液萃取簡(jiǎn)單快速的樣品前處理方法，經(jīng)圖庫(kù)檢索準(zhǔn)確快速鑒定中毒患者生物檢材中的未知毒物及其代謝物，為毒物鑒定提供推斷基礎(chǔ)，為臨床快速診治提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

乙酸乙酯（色譜純），德國(guó)Merck公司；甲醇（色譜純），德國(guó)CNW科技公司；CBZ（純度≥99.5%），德國(guó)Dr.Ehrensorfer公司。

6890-5973N氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀和DB-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），美國(guó)Agilent公司；HGC-12A氮吹濃縮儀，天津恒奧科技發(fā)展有限公司；TG20臺(tái)式離心機(jī)，長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司；V8渦旋混合器，美國(guó)安勝（Essenscien）儀器公司；AX200萬分之一天平，日本島津公司；10和50 μL微量注射器，澳大利亞SGE公司。

1.2 樣品來源

患者，男，72歲，不明原因昏迷被送入廣州市職業(yè)病防治院。家屬述患者有精神病史，曾服用CBZ 3年，停藥近半年。家屬發(fā)現(xiàn)患者出現(xiàn)惡心嘔吐癥狀，嘔吐物有白色粉末，逐漸意識(shí)不清，被家屬送院救治。入院后以胃管經(jīng)鼻抽取患者胃液；采集靜脈血約4 mL于普通干燥采血管中；用導(dǎo)尿管采集尿液，樣品采集時(shí)距離患者口服毒物約6 h。該患者的胃液、血液及尿液送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1.3 樣品前處理

1.3.1 尿液和胃液的前處理

取2 mL尿液或胃液，加入3 mL乙酸乙酯，渦旋3 min，離心（1073×g，25℃）3 min，準(zhǔn)確量取上清2 mL，氮吹濃縮至近干，用微量注射器準(zhǔn)確加入50 μL乙酸乙酯，待進(jìn)樣分析。

1.3.2 血樣的前處理

普通干燥管采血后，離心（1073×g，25℃）3 min，取2 mL血清，其他步驟按1.3.1操作。

1.4 GC-MS檢測(cè)條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：230℃；柱溫：80℃，保持3 min，以10℃?min-1升到220℃，保持2 min，再以15℃?min-1升到250℃，保持15 min，以5∶1的分流比進(jìn)樣；進(jìn)樣量：2 μL；載氣：高純氦氣；采用恒流模式，柱流量：1.0 mL?min-1。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電子轟擊（EI）源；離子源溫度：230℃；輔助接口溫度：280℃；EI電壓：69.9 eV；掃描方式：Scan；掃描質(zhì)荷比（m/z）范圍：33~400 amu；質(zhì)譜調(diào)諧：自動(dòng)調(diào)諧；溶劑延遲：3.5 min。

1.5 GC-MS圖譜解析

用EI源GC-MS聯(lián)用儀對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)質(zhì)譜圖進(jìn)行圖庫(kù)（美國(guó)國(guó)家科技研究所NIST 98質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)）檢索和特征離子峰分析，結(jié)合分子結(jié)構(gòu)和裂解規(guī)律及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的代謝物進(jìn)行圖譜解析。本文所有分子結(jié)構(gòu)圖均采用ChemDraw Ultra 7.0軟件繪制。

2 結(jié)果

2.1 GC-MS分析結(jié)果

按1.4項(xiàng)下GC-MS條件對(duì)患者處理后的體液樣本進(jìn)行分析，胃液、血液和尿液中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾樣品的分離測(cè)定（圖1）。圖庫(kù)檢索結(jié)果見表1。

2.2 圖譜解析CBZ的代謝產(chǎn)物

Fig.1 Total ion chromatorgrams of human gastric juice（A），human serum（B）and human urine（C）by gas chromatorgraphy-mass spectrometry.Black line：total ion chromatorgraphy of test samples；red line：total ion chromatorgraphy of blank samples.

Tab.1 Summary of metabolites of carbamazepine detected in three biological samples using NIST98 mass spectral library search system

根據(jù)謝岑等［15］報(bào)道的反應(yīng)性代謝物分析原理，結(jié)合文獻(xiàn)［6，8，16-17］報(bào)道的CBZ及其主要代謝物的代謝途徑及機(jī)制，對(duì)胃液、尿液及血液提取液的總離子流圖進(jìn)行圖譜解析。由GC-MS圖庫(kù)檢索可得到11種CBZ代謝產(chǎn)物，而M3和M11未有與之匹配的化合物圖庫(kù)，根據(jù)圖2A和2B的特征離子圖結(jié)合文獻(xiàn)資料推斷其分子結(jié)構(gòu)的可能存在形式（圖2C和2D），但具體結(jié)構(gòu)確認(rèn)還有待進(jìn)一步分離及鑒定。13種CBZ代謝產(chǎn)物中，M8和M10是最常被報(bào)道的，且已有較多文獻(xiàn)報(bào)道以高效液相色譜及其聯(lián)用技術(shù)對(duì)M8和M10進(jìn)行定量分析。Breton等［8］已報(bào)道CBZ代謝產(chǎn)物亞氨基茋（iminostilbene，M1），M3，吖啶（acridine，M5）和吖啶酮（acridone，M6）在體內(nèi)的代謝途徑。其他7種化合物則很少被報(bào)道為CBZ的代謝產(chǎn)物。從表1可見，在胃液提取液中未檢出9-甲基吖啶（M2）~4-甲基-吖啶酮（M13），表明這12種化合物不是以CBZ的雜質(zhì)存在，而是經(jīng)過人體代謝所產(chǎn)生的。

Fig.2 Mass spectra of M3（A），M11（B）and chemical structures of M3（C）and M11（D）.RMM：relative molecular mass.

由圖2A和2C推斷，m/z207為M3的分子離子峰，物質(zhì)較穩(wěn)定。因此分子離子峰較為明顯，m/z207為奇數(shù)，分子含氮數(shù)為奇數(shù)，符合“氮律”。m/z207首先失去CO（m/z28）使六元環(huán)開環(huán)并重排，因此得m/z179的碎片峰，再失去C2H4（m/z28）得m/z151碎片峰。由圖2B和2D推斷，m/z283為M11的分子離子峰，物質(zhì)較穩(wěn)定。因此分子離子峰較為明顯，m/z283為奇數(shù)，分子含氮數(shù)為奇數(shù)，符合“氮律”。m/z283首先失去OH（m/z17）得m/z266的碎片峰，再失去NCONH2（m/z58）得m/z208碎片峰，最后環(huán)氧脫H2O（m/z18），形成m/z為180的碎片峰。

本研究在CBZ中毒患者的尿液中檢出M2，9-丙基-9，10-二氫吖啶（M4），9，10二氫吖啶（M7），9-吖啶甲醇（M9），M11，2-甲基-吖啶酮（M12）及M13，并對(duì)其代謝途徑進(jìn)行推斷及解釋。從表1和圖1C可見，CBZ進(jìn)入人體后，經(jīng)過代謝，只有極少量以CBZ形式在尿液中排出，且大多以M1，M2，M3和M5的代謝產(chǎn)物形式排出；其次以M4，M8和M11的代謝產(chǎn)物形式排出；從圖1B可見，CBZ在血清中的主要代謝產(chǎn)物為M1和M3，而M2和M4的含量很低。

2.3 CBZ代謝途徑分析

依據(jù)本研究結(jié)果推斷，CBZ其他代謝產(chǎn)物的生成途徑如圖3。從表1可見，胃液的提取物成分比較簡(jiǎn)單，除常見的有機(jī)酸外，檢出的主要成分為M1和CBZ，其中M1是合成CBZ的主要藥物中間體，根據(jù)藥物在人體的反應(yīng)代謝原理推斷，CBZ進(jìn)入人體胃部中受胃酸的作用，發(fā)生去N-氨基甲?；磻?yīng)，生成亞氨基茋。CBZ在細(xì)胞色素P450的作用下，發(fā)生環(huán)氧化反應(yīng)生成M8，而M8在人體內(nèi)又可發(fā)生水解反應(yīng)生成M10。Breton等［8］報(bào)道了在白細(xì)胞的氧化作用下，CBZ和M1更傾向于生成M9，M5和M6，這一結(jié)果與本研究結(jié)果一致。

Fig.3 Proposed metabolic pathways of carbamazepine in humans.

3 討論

一般用于液液萃取的溶劑首先要與被萃取基質(zhì)互不相溶，其次根據(jù)相似相溶原理需考慮目標(biāo)提取物的極性、水溶性及脂溶性等特點(diǎn)。對(duì)于大多數(shù)藥物來說，在研發(fā)過程中為了提高其生物利用度，要求藥物在吸收部位必須具有一定的水溶解度，因?yàn)槿梭w的介質(zhì)是水，水是藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的載體，而細(xì)胞膜的雙脂質(zhì)層的結(jié)構(gòu)，要求藥物有一定的脂溶性才能穿透細(xì)胞膜。本研究對(duì)比了三氯甲烷、正己烷和乙酸乙酯的相對(duì)萃取效率。結(jié)果表明，乙酸乙酯對(duì)尿液和胃液有較高的萃取效率，原因在于CBZ易溶于乙醇和丙酮等極性溶劑，難溶于水，而乙酸乙酯水溶解性和極性較三氯甲烷和正己烷強(qiáng)。因此，在尿液和胃液中的分散程度較好，對(duì)CBZ的溶解度也較三氯甲烷和正己烷高。由于受采血量限制，本研究并未對(duì)血清的提取進(jìn)行優(yōu)化對(duì)比，但本研究旨在快速篩查中毒原因以及毒物進(jìn)入人體后的代謝途徑及機(jī)制。因此，乙酸乙酯作為提取溶劑已能滿足要求。

綜上所述，該法前處理簡(jiǎn)單，通過GC-MS分離及圖庫(kù)檢索，可快速篩查中毒患者的中毒原因，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。CBZ進(jìn)入人體后，經(jīng)過代謝，在尿中極少以CBZ形式排出，其主要以M1，M2，M3和M5代謝物形式排出。在尿中的13種CBZ代謝產(chǎn)物中有11種經(jīng)圖庫(kù)檢索可確定結(jié)構(gòu)，另2種（M3和M11）代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)仍需進(jìn)一步分離及鑒定。

［1］Yang JD，Elphick M，Sharpley AL，Cowen PJ. Effects of carbamazepine on sleep in healthy volunteers［J］.Biol Psychiatry，1989，26（3）：324-328.

［2］Lo JCY.Carbamazepine［M］∥Wexler P.Encyclo?pediaof Toxicology.3rd ed.San Diego：Elsevier Publishing House，2014：665-667.

［3］Ju C，Uetrecht JP.Detection of 2-hydroxyiminostilbene in the urine of patients taking carbamazepine?and its oxidation to a reactive iminoquinone intermediate［J］.J Pharmacol Exp Ther，1999，288（1）：51-56.

［4］Zhu X，He XJ，Zhao LM.Research progress on pathogenesis of carbamazepine-induced severe cutaneous adverse reactions［J］.Chin Pharm J（中國(guó)藥學(xué)雜志），2012，47（18）：1462-1464.

［5］Mathieu O，Picot MC，Gelisse P，Breton H，Demoly P，Hillaire-Buys D.Effects of carbamaze?pine and metabolites on IL-2，IL-5，IL-6，IL-10 and IFN-γ secretion in epileptic patients：the influ?ence of co-medication［J］.Pharmacol Rep，2011，63（1）：86-94.

［6］Mandrioli R，Albani F，Casamenti G，Sabbioni C，Raggia MA.Simultaneous high-performance liquid chromatography determination of carbamazepine and five of its metabolites in plasma of epileptic patients［J］.J Chromatogr B Biomed Sci Appl，2001，762（2）：109-116.

［7］Zhu X，Liu M，Liu LM，Li XL，Sun YX，Zhao LM. Determination of carbamazepine and its major metabolites in human serum by HPLC-UV［J］.Chin J Clin Pharmacol（中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志），2013，29（11）：853-856.

［8］Breton H，Cociglio M，Bressolle F，Peyriere H，Blayac JP，Hillaire-Buys D.Liquid chromatographyelectrospray mass spectrometry determination of carbamazepine，oxcarbazepine and eight of their metabolites in human plasma［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2005，828（1-2）：80-90.

［9］Dai B，Zhang HF，Song Q，Xu FC.Determination the concentrations of phenobarbital，sodium valproate，phenytoin sodium and carbamazepine in human plasma for simultaneous quatification by HPLC-MS［J］.Chin J Clin Pharmacol（中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志），2011，27（3）：213-215.

［10］Guo JQ，Shi YT，Wang HJ，Zhang P，Zheng J，Wang JW.Simultaneous determination of 5 antide?pressants in blood by automated solid phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.Chin J Anal Chem（分析化學(xué)），2014，42（5）：701-705.

［11］Zhu Y，Chiang H，Wulster-Radcliffe M，Hilt R，Wong P，Kissinger CB，et al.Liquid chromatography/ tandem mass spectrometry for the determination of carbamazepine and its main metabolite in rat plasma utilizing an automated blood sampling system［J］.J Pharm Biomed Anal，2005，38（1）：119-125.

［12］Chen GZ，Wang P.Determinationofcarbama zepine in gastric juice by GC［J］.Chin J Healt Lab Tec（中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志），2014，24（22）：3340-3341.

［13］Shen M，Wu HJ，Xiang P，Shen BH，Huang ZJ. Detection of psychotropic drugs and their metabolitesin human hair［J］.J Chin Mass Spectrom Soc（質(zhì)譜學(xué)報(bào)），2001，22（1）：32-38.

［14］Cai MZ，Jin YC，Wu HQ，Huang XL，Zhu ZX. Simultaneous analysis of eight mental drugs with amide structure by GC-MS［J］.Chin J Anal Lab（分析試驗(yàn)室），2007，26（9）：46-50.

［15］Xie C，Zhong DF，Chen XY.Applications of liquid chromatography-tandem mass spectrometry to detection and characterization of reactive metabo?lites［J］.J Chin Mass Spectrom Soc（質(zhì)譜學(xué)報(bào)），2011，32（1）：1-12.

［16］Datar PA.Quantitative bioanalytical and analytical method development of dibenzazepine derivative，carbamazepine：a review［J］.J Pharm Anal，2015，5（4）：213-222.

［17］Pearce RE，Uetrecht JP，Leeder JS.Pathways of carbamazepine bioactivationin vitro.Ⅱ.The role of human cytochrome P450 enzymes in the formation of 2-hydroxyiminostilbene［J］.Drug Metab Dispos，2005，33（12）：1819-1826.

Determination of carbamazepine and its metabolites in biological samples from a poisoned patient by GC-MS analysis

ZHOU Li-ping，CHEN Jiu，GUO Jia-ming，LIU Yi-min
（Evaluation and Testing Center for Occupational Hygiene，Hospital of Prevention and Treatment for Occupational Diseases，Guangzhou 510620，China）

OBJECTIVE To investigate the forms of carbamazepine and its metabolites in the gastric juice，blood and urine samples from a poisoned patient and its metabolic pathways.METHODS The gastric juice，blood and urine samples were obtained from a patient who was rushed to the Hospital of Prevention and Treatment for Occupational Diseases to be treated for an overdose of carbamazepine for about six hours.The samples were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry.The metabolites were identified from their mass spectra by comparison with spectra in NIST 98 libraries. The metabolic pathways were inferred by fragmentation regularities of mass spectra and the published data.RESULTS The results showed that only M1 was found in the gastric juice sample.Four metabo?lites，such as iminostilbene（M1），9-methyl-acridine（M2），9-propyl-acridan（M4）and M3，were found in the blood sample and thirteen metabolites，including M1，M2，M4，acridine（M5），acridone（M6），9，10-dihydro Acridine（M7），1a，10b-dihydro-6H-dibenz［b，f］oxireno［d］azepine-6-carboxamide（M8），9-acridinemethanol（M9），10，11-dihydrodiol-carbamazepine（M10），2-methyl-acridone（M12），4-methyl-acridone（M13），undetermined M3 and M11，were found in the urine from the poi?soned patient.The forms of carbamazepine metabolites in the gastric juice，blood and urine were different. Little carbamazepine was found in the urine after metabolism.CONCLUSION Based on the analysis by gas chromatography-mass spectrometry and identification of NIST 98 libraries，the metabolites could be identified accurately，which can help analyze the metabolic mechanism and pathways of carbam?azepine.

gas chromatography-mass spectrometry；carbamazepine；metabolites

LIU Yi-min，E-mail：ymliu61@163.com，Tel：（020）38981264

R969.1

A

1000-3002-（2016）09-0961-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.09.009

Foundation item：The project supported by Laboratory Construction Project of Occupational Environment and Health Effect in Guangzhou City（2014SY000020）

2015-12-18接受日期：2016-07-11）

（本文編輯：沈海南）

廣州市職業(yè)環(huán)境與健康效應(yīng)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)項(xiàng)目（2014SY000020）

周麗屏，（1981-），女，碩士研究生，分析化學(xué)工程師，理化檢驗(yàn)主管技師，主要從事職業(yè)衛(wèi)生檢測(cè)及化學(xué)中毒應(yīng)急救援檢測(cè)工作。

劉移民，E-mail：ymliu61@163.com，Tel：（020）38981264