脫氫樅胺對(duì)氟苯甲醛激活JNK/P38通路誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡

劉 玲，黃紫樂(lè)，何 玲

（1.河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，河南洛陽(yáng) 471003；2.中國(guó)藥科大學(xué)藥理學(xué)教研室，江蘇南京 210009）

脫氫樅胺對(duì)氟苯甲醛激活JNK/P38通路誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡

劉 玲1，黃紫樂(lè)1，何 玲2

（1.河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，河南洛陽(yáng) 471003；2.中國(guó)藥科大學(xué)藥理學(xué)教研室，江蘇南京 210009）

目的研究脫氫樅胺對(duì)氟苯甲醛（DHAA-F）對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞存活的影響，探討其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用機(jī)制。方法 用不同濃度DHAA-F處理HepG2細(xì)胞24，48和72 h，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活；DHAA-F 20，40和 80 μmol·L-1處理 HepG2細(xì)胞 24 h，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Western蛋白印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白BCL-2、BAX、活化的胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3蛋白表達(dá)水平，以及絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）家族中ERK，JNK和P38蛋白的表達(dá)。結(jié)果 與細(xì)胞對(duì)照組比較，DHAA-F可顯著抑制細(xì)胞存活（P＜0.01），24，48和72 h的IC50值分別為56.8±4.4，40.2±3.4和24.2±2.4 μmol·L-1；DHAA-F 20，40和80 μmol·L-1作用24 h后，核固縮程度加深，PI染色增多，細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.01），由細(xì)胞對(duì)照組的（6.4±0.6）%分別增加至（12.3±1.7）%，（28.8±3.2）%和（61.8±4.6）%；DHAA-F可以增加HepG2細(xì)胞中JNK和P38蛋白的磷酸化（P＜0.01），引起B(yǎng)CL-2表達(dá)下調(diào)（P＜0.01）、BAX及活化的胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）；與DHAA-F組相比，P38MAPK抑制劑SB203580和JNK抑制劑SP600125可逆轉(zhuǎn)DHAA-F引起的BCL-2表達(dá)下調(diào)、BAX表達(dá)上調(diào)和胱天蛋白酶3的活化（P＜0.01）。結(jié)論 DHAA-F可通過(guò)激活JNK/P38通路誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡。

脫氫樅胺對(duì)氧苯甲醛；絲裂原活化蛋白激酶；細(xì)胞凋亡；肝細(xì)胞癌

目前，我國(guó)肝癌發(fā)病人數(shù)約占全球肝癌患者的55%，其發(fā)病率和死亡率在不斷升高。據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，全世界每年新發(fā)肝癌患者約60萬(wàn)，居惡性腫瘤的第5位，已經(jīng)嚴(yán)重威脅人們的健康和生命［1］。目前肝癌治療方式包括手術(shù)切除、介入化療及靶向分子藥物治療等，其中手術(shù)切除是肝癌的主要治療手段，而術(shù)后高轉(zhuǎn)移率和高復(fù)發(fā)率是影響肝癌預(yù)后的主要因素。臨床上常用的抗腫瘤藥物大多是以傳統(tǒng)的核酸和蛋白質(zhì)為靶點(diǎn)的細(xì)胞毒性藥物，其缺點(diǎn)是選擇性差，毒性作用強(qiáng)，作用機(jī)制單一，易產(chǎn)生耐藥性。

脫氫樅胺（dehydroabietylamine，DHAA）是松香的重要改性產(chǎn)品之一，是一種三環(huán)菲結(jié)構(gòu)的光學(xué)活性堿。DHAA的許多衍生物也具有一定的生物活性，如局部抗炎、抗腫瘤和抗病毒等作用［2-4］。由于氟原子特有的模擬效應(yīng)、電子效應(yīng)和阻隔效應(yīng)，氟原子的引入可以大大提高化合物的生物活性。饒小平［5］等用直接縮合法合成了含氟的取代苯甲醛縮脫氫樅胺Schiff堿，脫氫樅胺對(duì)氟苯甲醛(DHAA-fluorobenzylidehyde，DHAA-F）是其中的衍生物之一。本課題組前期研究顯示，DHAA-F能顯著抑制肝癌細(xì)胞SMMC-7721,HepG2和BEL-7402細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［6］。

絲分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）家族是將細(xì)胞表面信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核的重要傳遞者，該家族通過(guò)影響動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控，從而影響細(xì)胞的生物學(xué)反應(yīng)（如增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等）［7］。其中JNK被激活后參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞衰亡和應(yīng)激反應(yīng)等一系列的細(xì)胞調(diào)控，通過(guò)使轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物激活蛋白-1活性增強(qiáng)進(jìn)一步促進(jìn)P53，BAX，F(xiàn)asL和腫瘤壞死因子等促凋亡蛋白的表達(dá)。P38存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，是真核細(xì)胞將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)至細(xì)胞內(nèi)引起細(xì)胞反應(yīng)的一類(lèi)重要信號(hào)系統(tǒng)，通過(guò)增強(qiáng)c-MYC表達(dá)、磷酸化P53、激活c-JUN和c-FOS，誘導(dǎo)BAX轉(zhuǎn)位等途徑調(diào)控凋亡。前期研究顯示，DHAA-F能引起線粒體膜電位降低，BCL-2表達(dá)減少，BAX、P53和細(xì)胞色素c表達(dá)增加，胱天蛋白酶3活力增加。為進(jìn)一步研究DHAA-F誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制，本研究將以人肝癌細(xì)胞HepG2為研究對(duì)象，重點(diǎn)考察DHAA-F誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程中對(duì)MAPK信號(hào)通路的影響，為其臨床應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物、試劑和主要儀器

人肝癌HepG2細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所提供，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中。RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）。DHAA-F（圖1）（純度≥98%），由中國(guó)林業(yè)科學(xué)院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所饒小平博士提供，用丙酮溶解配制成0.05 mol·L-1濃度的母液，貯存于4℃冰箱備用。）胰酶（北京索萊寶科技有限公司）；CCK-8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）；BCA蛋白定量試劑盒（江蘇海門(mén)碧云天生物技術(shù)研究所）；ERk1/2、p-ERk1/2、P38、p-P38、p-JNK、JNK、BAX、BCL-2、活化胱天蛋白酶3、活化胱天蛋白酶9、β肌動(dòng)蛋白抗體、SB203580、SP600125和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）；ECL檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物技術(shù)有限公司）；其余試劑均為市售分析純。SK3c細(xì)胞培養(yǎng)箱，日本Sanyo公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Device公司產(chǎn)品；Mini Trans-blot電轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)Clinx Chemicope2850，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

Fig.1 Chemical structure of dehydroabietylaminefluorobenzaldehyde(DHAA-F)

1.2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×107L-1，每孔100 μL接種于96孔板中，37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分為正常對(duì)照組（只加等量丙酮，終濃度＜1%）和DHAA-F 12.5，25，50，100和200 μmol·L-1給藥組，每孔100 μL，每組6孔。分別作用24，48和72 h后，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)吸光度。細(xì)胞存活抑制率（%）=（正常對(duì)照組A450nm-給藥組A450nm）/正常對(duì)照組A450nm×100%。

1.3 細(xì)胞分組和處理

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，消化后制成單細(xì)胞懸液，每孔1mL接種于6孔板中，調(diào)整濃度為5×108L-1，于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24 h。吸棄上清，將細(xì)胞分為正常對(duì)照組（只加等量丙酮，終濃度＜1%）和DHAA-F 20，40和80 μmol·L-1給藥組，作用24 h。

1.4 Hoechst33342/PI染色觀察細(xì)胞形態(tài)

培養(yǎng)細(xì)胞中加入Hoechst33342染液，終濃度5 mg·L-1；37℃，避光染色10 min；繼續(xù)加入PI染液，終濃度15 mg·L-1，4℃，避光反應(yīng)10 min；染色完畢后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.5 Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取1.3項(xiàng)處理的細(xì)胞，收集細(xì)胞，用冷PBS洗2次，緩沖液以三蒸水稀釋10倍，用緩沖液配成1×108L-1的細(xì)胞密度；吸取100 μL細(xì)胞至試管中，加入Annexin V試劑和PI各5 μL，混勻避光孵育15 min；加入400 μL染色緩沖液，混勻，30 min后流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為535nm。

1.6 Western蛋白印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)

取1.3項(xiàng)處理的細(xì)胞。收集細(xì)胞，加入含PMSF的裂解液，冰上裂解并收集細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。取50 μg蛋白質(zhì)，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫下5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗4℃封閉袋中孵育過(guò)夜；二抗室溫孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，將混合好的發(fā)光液滴加到膜上，用凝膠成像系統(tǒng)拍照成像。利用凝膠成像系統(tǒng)軟件，分析蛋白條帶積分吸光度。目的蛋白條帶積分吸光度值與內(nèi)參吸光度值的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以x±s來(lái)表示，經(jīng)SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，2組以上均數(shù)比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DHAA-F對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞存活的影響

圖2結(jié)果顯示，隨著DHAA-F濃度和時(shí)間的增加，對(duì)細(xì)胞存活的抑制作用逐漸增強(qiáng)。24，48和72 h的IC50值分別為 56.8±4.4，40.2±3.4和（24.2±2.4）μmol·L-1。

Fig.2 Effect of DHAA-F on HepG2 cell survival. HepG2 cells were treated for 24，48 or 72 h with different concentrations of DHAA-F.±s，n=3.

2.2 DHAA-F對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響

染色結(jié)果顯示（圖3），細(xì)胞對(duì)照組中多為正常細(xì)胞，形態(tài)呈圓形，淡藍(lán)色，細(xì)胞核被Hoechst著色；而經(jīng)DHAA-F處理后的細(xì)胞，核呈固縮狀、團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)，隨著化合物濃度升高，核固縮程度加深，PI染色增多（PI著色呈紅色），表明細(xì)胞凋亡程度加劇。表明DHAA-F對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡有一定的誘導(dǎo)作用。

Fig.3Effect of DHAA-F on morphology of HepG2 cells（200×）HepG2 cells were treated with DHAA-F for 24 h. Red in color represent late apoptotic cells.

2.3 DHAA-F對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響

圖4結(jié)果顯示，與細(xì)胞對(duì)照組總凋亡率（6.4±0.6）%比較，DHAA-F 20，40和80 μmol·L-1作用24 h后，凋亡率升高（P＜0.05，P＜0.01），分別為（12.3±1.7）%，（28.8±3.3）%和（61.8±4.6）%，提示DHAA-F能明顯誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。

Fig.4 Effect of DHAA-F on apoptosis of HepG2 cells. See Fig.3 for cell treatment.±s，n=3.*P＜0.05，**P＜0.01，compared with normal control group.

2.4 DHAA-F對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖5結(jié)果顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，DHAA-F作用24 h，BCL-2蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.01），BAX蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.01），BAX/BCL-2比值升高，分別由0.18±0.05升高至0.72±0.08，1.09±0.13和1.37±0.25?；罨滋斓鞍酌?表達(dá)增加（P＜0.01），由細(xì)胞對(duì)照組的0.26±0.05升高至0.45±0.11，1.07±0.09和1.35±0.08；活化胱天蛋白酶3由細(xì)胞對(duì)照組的0.84±0.12升高至1.31±0.16，1.67±0.19和2.32±0.26。提示DHAA-F對(duì)凋亡蛋白具有明顯的誘導(dǎo)作用。

2.5 DHAA-F對(duì)MAPK通路的影響及JNK/P38阻斷劑對(duì)其作用的逆轉(zhuǎn)

圖6結(jié)果顯示，隨著DHAA-F濃度的增加，JNK和P38蛋白的磷酸化水平也相應(yīng)增加（P＜0.01），p-JNK/JNK和p-P38/P38比值升高（P＜0.01）。p-JNK/JNK比值由0.23±0.05升高至0.35±0.07，0.69±0.16和1.02±0.06。p-P38/P38比 值 由 0.46±0.09分別升高至 0.91±0.10，1.27±0.14和1.73±0.19。但是不影響ERK蛋白的磷酸化。

Fig.5 Effect of DHAA-F on expression of apoptosis related proteins in HepG2 cells by Western blotting. See Fig.3 for cell treatment.±s，n=3.*P＜0.05，**P＜0.01，com?pared with normal control group.

Fig.6 Effect of DHAA-F on protein phosphorylation of mitogen-activated protein kinases（MAPK）apoptotic pathway in HepG2 cells by Western blotting.See Fig.3 for cell treatment.±s，n=3.*P＜0.05，**P＜0.01，compared with normal control group.

圖7結(jié)果顯示，JNK阻斷劑SP600125可以明顯下調(diào)p-JNK蛋白表達(dá)（P＜0.01），并對(duì)DHAA-F引起的BCL-2表達(dá)下調(diào)、BAX和活化胱天蛋白酶9和3的表達(dá)上調(diào)具有逆轉(zhuǎn)作用（P＜0.01）。圖8結(jié)果顯示，P38阻斷劑SB203580可以明顯下調(diào)p-P38蛋白表達(dá)，并且明顯逆轉(zhuǎn)DHAA-F引起的BCL-2表達(dá)下調(diào)、BAX和活化胱天蛋白酶9和3表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）。提示MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路在DHAA-F誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞線粒體凋亡途徑中發(fā)揮調(diào)控作用。

Fig.7 Effect of SP600125 on MAPK proteins expression and phosphorlation in DHAA-F treated HepG2 cells by Western blotting.HepG2 cells were treated with the JNK inhibitor SP600125 10 μmol·L-1before treatment with DHAA-F 80 μmol·L-1for 24 h.±s，n=3.*P＜0.05，**P＜0.01,compared with normal control group.

Fig.8 Effect of SB203580 on MAPK proteins expression and phosphorlation in DHAA-F treated HepG2 cells by Western blotting.The HepG2 cells were treated with the p38 inhibitor SB203580 10 μmol·L-1before treatment with DHAA-F 80 μmol·L-1for 24 h.±s.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01，compared with normal control group.

3 討論

本研究結(jié)果表明，DHAA-F可顯著抑制HepG2細(xì)胞增殖，細(xì)胞核呈現(xiàn)固縮、團(tuán)塊狀形態(tài)，PI染色凋亡細(xì)胞增加，細(xì)胞凋亡率明顯增加；同時(shí)DHAA-F可激活MAPK家族中JNK和P38，使其磷酸化水平升高，增加BAX/BCL-2比值，激活胱蛋白酶9和3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在內(nèi)源性基因的調(diào)控下，產(chǎn)生一系列形態(tài)和生化方面的改變而發(fā)生的自然或生理性死亡的過(guò)程，對(duì)于細(xì)胞而言，凋亡與增殖共同維持其正常的生長(zhǎng)發(fā)育和內(nèi)環(huán)境平衡［8］?？鼓[瘤藥物可通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。凋亡發(fā)生時(shí)，細(xì)胞也表現(xiàn)出某些典型的形態(tài)學(xué)特征和生化特征，可作為鑒定細(xì)胞凋亡發(fā)生的標(biāo)準(zhǔn)，如細(xì)胞膜破裂，核固縮，DNA降解，凋亡小體形成和胱天蛋白酶活化等［9-10］。本研究觀察到DHAA-F對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用，可引起HepG2細(xì)胞發(fā)生形態(tài)的改變，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與前期研究結(jié)果一致，對(duì)進(jìn)一步研究該化合物的作用機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

線粒體是真核細(xì)胞中重要的細(xì)胞器，是主要合成ATP、為細(xì)胞生命活動(dòng)提供能量的場(chǎng)所，是多種促凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的靶點(diǎn)，對(duì)各種損傷較為敏感［11-12］。在凋亡過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)BAX與BCL-2比值決定了線粒體外膜孔道的形成，促凋亡蛋白Bax表達(dá)增加，從胞漿移位到線粒體膜上，與BCL-2形成二聚體，使內(nèi)膜通透性增加，破壞細(xì)胞質(zhì)與線粒體基質(zhì)之間的化學(xué)平衡，最終使外膜破裂，促使線粒體膜內(nèi)的細(xì)胞色素c釋放至胞漿。而B(niǎo)CL-2蛋白則起抑制作用［13］。DHAA-F可顯著升高BAX/BCL-2比值，活化的胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3的表達(dá)隨著DHAA-F濃度增加而升高，提示其抗腫瘤作用與其誘導(dǎo)線粒體凋亡通路有關(guān)。MAPK家族是將細(xì)胞表面信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞核的重要傳遞者，該家族通過(guò)影響動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控，從而影響細(xì)胞的生物學(xué)反應(yīng)（如增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等），是多數(shù)抗腫瘤藥物的作用靶點(diǎn)之一［14］。通過(guò)檢測(cè)MAPK信號(hào)通路能進(jìn)一步闡釋化合物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制。本研究檢測(cè)了DHAA-F對(duì)MAPK家族蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)DHAA-F能激活MAPK家族中JNK和P38磷酸化水平，而對(duì)ERK蛋白的磷酸化無(wú)明顯影響，提示JNK和P38通路的激活參與了DHAA-F刺激下所誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。JNK在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中起重要作用，激活后主要參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞衰亡和應(yīng)激反應(yīng)等一系列的細(xì)胞調(diào)控，因此在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，可上調(diào)促凋亡蛋白如胱天蛋白酶3的表達(dá)及激活；而P38是真核細(xì)胞將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)至細(xì)胞內(nèi)引起細(xì)胞反應(yīng)的一類(lèi)重要信號(hào)系統(tǒng)，可能影響細(xì)胞代謝較大。因此，這2條通路對(duì)于細(xì)胞增殖均起著重要的作用［15］。ERK廣泛存在于各種組織，參與細(xì)胞的增殖分化的調(diào)控。多種生長(zhǎng)因子受體和營(yíng)養(yǎng)相關(guān)因子受體等都需要ERK的活化來(lái)完成信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。本研究結(jié)果提示，生長(zhǎng)因子等介導(dǎo)的細(xì)胞增殖在DHAA-F誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中未發(fā)揮主要作用。為了進(jìn)一步確定JNK和P38在DHAA-F誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用，本研究分別應(yīng)用JNK和P38特異性阻斷劑SP600125和SB203580對(duì)其蛋白磷酸化進(jìn)行有效抑制，發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制p-JNK和p-P38蛋白表達(dá)能逆轉(zhuǎn)DHAA-F誘導(dǎo)的活化胱蛋白酶9/3上調(diào)和BAX/BCL-2比值升高，更加證明了JNK和P38在DHAA-F誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡中起到一定的調(diào)節(jié)作用。因此，MAPK信號(hào)通路在DHAA-F誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起著重要的調(diào)控作用。

綜述所述，DHAA-F對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞促凋亡作用主要是通過(guò)激活JNK和P38應(yīng)激途徑，進(jìn)而使BAX與BCL-2的比值升高，激活胱天蛋白酶途徑，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

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Dehydroabietylamine-fluorobenzaldehyde induces apoptosis by activating JNK/P38 signal pathway in human hepatocellular carcinoma HepG2 cells

LIU Ling1，HUANG Zi-le1，HE Ling2
（1.Department of Pharmacy，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China；2.Department of Pharmacology，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China）

OBJECTIVE To investigate the effects and mechanisms of dehydroabietylamine-fluoro?benzaldehyde（DHAA-F）on cell proliferation and apoptosis in human hepatocellular carcinoma HepG2 cells.METHODS Survival of HepG2 cells treated with DHAA-F 12.5，25，50，100 and 200 μmol·L-1was measured with Cell Counting Kit-8 assay.HepG2 cells were treated with DHAA-F 20，40 and 80 μmol·L-1for 24 h，the morphological features were observed under the fluorescence microscope. Apoptosis was determined by Annexin V-FITC staining and PI labeling，white protein expressions of BCL-2，BAX，cleaved caspase-9/3，ERK，JNK，and P38MAPK were measured by Western blotting analysis.Furthermore.HepG2 cells were treated with SP600125（an inhibitor of JNK）or SB203580（an inhibitor of P38），and then treated with DHAA-F.JNK/P38 pathway was measured to confirm its involvement in the DHAA-F-induced apoptosis.RESULTS Compared with control group，DHAA-F could obviously inhibit the proliferation of HepG2 cells（P＜0.01）.IC50values of HepG2 cells treated with DHAA-F for 24，48 and 72 h were 56.8±4.4，40.2±3.4 and（24.2±2.4）μmol·L-1，respectively.Cells treated with DHAA-F 20，40 and 80 μmol·L-1for 24 h became round，deformative and shrunken.Apop?tosis rates of DHAA-F groups increased to（12.3±1.7）%，（28.8±3.2）%and（61.8±4.6）%from（6.4±0.6）%of control group（P＜0.01）.Compared with control group，phosphorylation of JNK and P38 was increased after DHAA-F treatment（P＜0.01）that down-regulated BCL-2，up-regulated BAX and activated cleaved caspase-9/3，but the phosphorylation of the extracellular signal-regulated protein kinase（ERK1/2）was not affected.Addition of 10 μmol·L-1SP600125（JNK inhibitor）and 10 μmol·L-1SB203580（P38 inhibitor）remarkably suppressed JNK and P38 phosphorylation induced by DHAA-F 80 μmol·L-1.Moreover，SP600125 or SB203580 treatment blocked DHAA-F-can induced down-regulation of BCL-2，up-regulation of Bax and caspase-3 activation.CONCLUSION DHAA-F inhibit the proliferation of HepG2 cells and induce apoptosis，which may be related to JNK/P38-mediated pathway.

dehydroabietylamine-fluorobenzaldehyde；mitogen-activated protein kinase；apoptosis；hepatocellular carcinoma

LIU Ling，E-mail：liuling921@126.com

R979.1

A

1000-3002-（2016）11-1149-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.11.04

Foundation item：The project supported by Doctoral Scientific Research Fund of Henan University of Science and Tech?nology（4020/13480023）

2016-06-22 接受日期：2016-10-26）

（本文編輯：賀云霞）

河南科技大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金（4020/13480023）

劉 玲，博士，副教授，從事藥理學(xué)教學(xué)與科研工作。

劉 玲，E-mail：liuling921@126.com