感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)在耐多藥肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用價(jià)值

胡鈺卿潘愛(ài)珍王 靜朱 敏▲

1.杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院結(jié)核實(shí)驗(yàn)室 ，浙江杭州 310003；2.浙江省疾控中心結(jié)核病預(yù)防控制所結(jié)核實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310051

感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)在耐多藥肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用價(jià)值

胡鈺卿1潘愛(ài)珍2王 靜1朱 敏1▲

1.杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院結(jié)核實(shí)驗(yàn)室 ，浙江杭州 310003；2.浙江省疾控中心結(jié)核病預(yù)防控制所結(jié)核實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310051

目的分析探討感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（TSPOT.TB）在耐多藥肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法選擇2014年1月～2016年1月我院收治的耐多藥肺結(jié)核患者71例，另選擇35例同期健康體檢者作為對(duì)照組，比較各種檢測(cè)方法診斷的敏感性，并采用特異性、準(zhǔn)確度作為診斷試驗(yàn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)。結(jié)果T-SPOT.TB檢測(cè)診斷耐多藥肺結(jié)核敏感性最高，達(dá)95.6%，顯著高于其他各項(xiàng)檢測(cè)方法，差異具有顯著性（P＜0.05）。抗酸桿菌涂片、結(jié)核菌培養(yǎng)、T-SPOT.TB檢測(cè)用于診斷耐多藥肺結(jié)核的敏感性較高，達(dá)90%以上。T-SPOT. TB檢測(cè)用于診斷耐多藥肺結(jié)核的特異度最高，達(dá)91.9%，顯著高于其他各項(xiàng)檢測(cè)方法，差異具有顯著性（P＜0.05）。 T-SPOT.TB檢測(cè)用于診斷耐多藥肺結(jié)核的準(zhǔn)確度最高，達(dá)96.2%，顯著高于其他各項(xiàng)檢測(cè)方法，差異具有顯著性（P＜0.05）。結(jié)論與其他檢查方法相比，感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)對(duì)診斷耐多藥肺結(jié)核具有特異性高、準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)，值得廣泛推廣和應(yīng)用。

耐多藥肺結(jié)核；感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)

結(jié)核病是一種慢性傳染病，是由結(jié)核分支桿菌感染引起的疾病，其中最為常見(jiàn)的是肺部結(jié)核。近年來(lái)全球結(jié)核病疫情呈回升狀態(tài)，耐藥結(jié)核菌發(fā)生率不斷增加。其中，耐多藥肺結(jié)核指結(jié)核菌至少同時(shí)對(duì)利福平、異煙肼兩種抗結(jié)核藥物耐藥，發(fā)病率較高，約占全世界25.0%，還存在持續(xù)向外播散耐多藥結(jié)核菌情況[1]。耐多藥肺結(jié)核治療難度大，治療周期長(zhǎng)，治愈率低，因此，尋找特異的檢測(cè)方法，快速且準(zhǔn)確診斷是結(jié)核病控制的關(guān)鍵問(wèn)題，且對(duì)于監(jiān)測(cè)結(jié)核病的發(fā)展及轉(zhuǎn)歸及臨床治療具有重要意義。結(jié)核菌素試驗(yàn)（purified protein derivative tuberculin，PPD）為診斷結(jié)核病的主要方法，但假敏感性較高[2]。結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（TB infection of T cells spot test，TSPOT.TB）為一種新型的診斷方法，敏感性和特異性水平較高。本研究選取疑患結(jié)核病例，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2014年1月～2016年1月我院收治的耐多藥肺結(jié)核患者71例，入選研究對(duì)象均知情同意，均排除合并嚴(yán)重心、腦、肝、腎、消化系統(tǒng)等疾病者。其中男38例，女33例；年齡22～67歲，平均（41.2±6.2）歲；病史0.5～3年，平均 （14.1±3.2）月。疾病類(lèi)型：原發(fā)性肺結(jié)核 15例，繼發(fā)性肺結(jié)核40例，血型播散型肺結(jié)核16例。另選擇35例同期健康體檢者作為對(duì)照組，其中男18例，女17例；年齡20～58歲，平均（42.3±5.4）歲。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 T-SPOT.TB試驗(yàn) 取枸櫞酸鈉抗凝的靜脈血5mL，分離外周血單核細(xì)胞（PBMC） 放在包被IFN-7抗體的微孔板，加入結(jié)核分枝桿菌特異性抗原早期分泌靶向抗原（ESAT-6） 和培養(yǎng)基濾過(guò)蛋白（CFP-10）作為抗原，37℃溫箱培養(yǎng)24h后，洗去抗原致敏效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，加入生物素標(biāo)記的二抗，再經(jīng)酶聯(lián)顯色，在細(xì)胞因子分泌的地方形成斑點(diǎn)，通過(guò)記錄斑點(diǎn)數(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌特異抗原致敏的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞數(shù)量。采用上海復(fù)星科技有限公司提供的試劑盒。

1.2.2 結(jié)果判斷 當(dāng)空白對(duì)照孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)＜6時(shí)，任一實(shí)驗(yàn)孔斑點(diǎn)數(shù)減去空白孔斑點(diǎn)數(shù)≥6，結(jié)果即為陽(yáng)性；若空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)＞6，任一實(shí)驗(yàn)孔斑點(diǎn)數(shù)大于空白孔斑點(diǎn)數(shù)的兩倍，結(jié)果也表示陽(yáng)性[3]。

1.2.3 其他檢查方法 （1）PPD試驗(yàn)。采用Mantoux法，取PPD 0.1mL（含5單位結(jié)核菌素）行前臂尺側(cè)皮內(nèi)試驗(yàn)，48～72h后觀察結(jié)果。硬結(jié)直徑≥10mm為T(mén)ST陽(yáng)性結(jié)果。（2）血清結(jié)核抗體檢測(cè)。采用蛋白芯片閱讀儀，結(jié)核分枝桿菌蛋白芯片試劑盒均為南京大淵生物技術(shù)公司提供，結(jié)核分枝桿菌蛋白芯片試劑盒檢測(cè)結(jié)核桿菌三種特異性抗體， 即抗脂阿拉伯甘露糖（LAM）、16kDa 及38kDa抗體，如果任一抗體檢測(cè)為陽(yáng)性，結(jié)果則判為陽(yáng)性。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程不超過(guò)30min。（3）結(jié)核DNA檢測(cè)。將痰液中提取DNA模板加入PCR反應(yīng)管，按規(guī)定循環(huán)參數(shù)進(jìn)行PCR反應(yīng)。（4）其他。抗酸桿菌涂片與結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，具體檢測(cè)方法同中國(guó)防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專(zhuān)業(yè)委員會(huì)主編《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》2006版。

1.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)

采用敏感性、特異性、準(zhǔn)確度作為診斷試驗(yàn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)。（1）敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)／（真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%，（2）特異度=真陰性例數(shù)／（真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù)） ×100%。

準(zhǔn)確度=真陽(yáng)性＋真陰性/（真陽(yáng)性+真陰性＋假陽(yáng)性＋假陰性）×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)處理采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理和分析， 計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（）的形式表示，組間比較分析采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T-SPOT.TB檢測(cè)與其他各項(xiàng)檢測(cè)方法診斷耐多藥肺結(jié)核的敏感性、特異性、準(zhǔn)確度比較

表1結(jié)果顯示，抗酸桿菌涂片、結(jié)核菌培養(yǎng)、T-SPOT.TB檢測(cè)用于診斷耐多藥肺結(jié)核的敏感性較高，達(dá)90%以上。T-SPOT.TB檢測(cè)用于診斷耐多藥肺結(jié)核的特異度最高，達(dá)91.9%，顯著高于其他各項(xiàng)檢測(cè)方法，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。且表2結(jié)果還證實(shí)，T-SPOT.TB檢測(cè)用于診斷耐多藥肺結(jié)核的準(zhǔn)確度最高，達(dá)96.2%，顯著高于其他各項(xiàng)檢測(cè)方法，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各檢測(cè)方法診斷耐多藥肺結(jié)核的敏感性、特異性、準(zhǔn)確度比較[%（n/n）]

2.2 T-SPOT.TB檢測(cè)與其他各項(xiàng)檢測(cè)方法診斷耐多藥肺結(jié)核敏感性比較

表2結(jié)果顯示，PPD、結(jié)核PCR、結(jié)核菌培養(yǎng)、T-SPOT.TB檢測(cè)方法用于耐多藥肺結(jié)核檢測(cè)的敏感性顯著高于對(duì)照組，組間比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。且表1數(shù)據(jù)分析顯示，T-SPOT.TB檢測(cè)診斷耐多藥肺結(jié)核敏感性最高，達(dá)95.6%，顯著高于其他各項(xiàng)檢測(cè)方法，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

結(jié)核病是全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，據(jù)WHO估計(jì)，全球有約20億人感染結(jié)核分枝桿菌，每年有約200萬(wàn)人死于結(jié)核[4]。我國(guó)是結(jié)核病高發(fā)國(guó)家之一，2000年全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查顯示，全國(guó)受結(jié)核菌感染人數(shù)約5.5億，其中傳染性肺結(jié)核病患者150萬(wàn)人，每年因結(jié)核病死亡的人數(shù)達(dá)13萬(wàn)人。近年來(lái)結(jié)核病的發(fā)病率有上升趨勢(shì)，且耐藥趨勢(shì)較嚴(yán)重。因此，如何及早發(fā)現(xiàn)疾病并快速精準(zhǔn)的進(jìn)行診斷成為臨床研究的重點(diǎn)。

表2 T-SPOT.TB檢測(cè)與其他各項(xiàng)檢測(cè)方法診斷耐多藥肺結(jié)核敏感性比較[n（%）]

結(jié)核菌素試驗(yàn)（TST）是臨床常用于結(jié)核篩查的常用方法之一，但假陽(yáng)性率高，且易受患者身體狀況影響而影響結(jié)果。體外核酸擴(kuò)增技術(shù)即聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）自1989年法國(guó)學(xué)者Brissonneol等首先報(bào)道用于診斷結(jié)核病，為結(jié)核病的快速診斷開(kāi)辟了新途徑，但由于其假陽(yáng)性率較高影響了結(jié)果的可靠性。結(jié)核抗體檢測(cè)試驗(yàn)敏感度較差、對(duì)潛伏性肺結(jié)核的篩查意義不大、價(jià)格昂貴。TSPOT.TB技術(shù)通過(guò)計(jì)算斑點(diǎn)的數(shù)量推測(cè)出患者體內(nèi)結(jié)核桿菌產(chǎn)生反應(yīng)的效應(yīng)T細(xì)胞是否存在[5-7]。T.SPOT實(shí)驗(yàn)結(jié)合酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（即ELISPOT技術(shù)）與r-干擾素釋放試驗(yàn)，通過(guò)檢測(cè)受結(jié)核分枝桿菌抗原刺激而活化的效應(yīng)T細(xì)胞來(lái)診斷結(jié)核感染[8-10]。結(jié)核感染后體內(nèi)長(zhǎng)期存在抗原特異性T細(xì)胞，當(dāng)再次遇到抗原刺激時(shí)，能迅速活化增殖，釋放r-干擾素[11-13]。實(shí)驗(yàn)中利用ESAT6和CFP10兩種結(jié)核特異性抗原刺激外周血中結(jié)核特異性T淋巴細(xì)胞分泌 r-干擾素，并通過(guò)ELISPOT方法檢測(cè)r-干擾素的釋放水平，從而判斷機(jī)體是否感染結(jié)核桿菌。對(duì)活動(dòng)性結(jié)核分枝桿菌感染具有較高的敏感性[14-16]。且TSPOT.TB的檢測(cè)價(jià)格便宜、簡(jiǎn)單易行[17-19]。將TSPOT.TB與PPD試驗(yàn)相比，TSPOT.TB屬于體外試驗(yàn)，PPD 試驗(yàn)屬于體內(nèi)試驗(yàn)；PPD試驗(yàn)的結(jié)果受多重因素制約，其臨床應(yīng)用受到一定的局限性，在肺結(jié)核感染的高發(fā)地帶為患者進(jìn)行PPD 試驗(yàn)的假陽(yáng)性呈不斷增多的趨勢(shì)[20-22]；本研究選擇71例耐多藥肺結(jié)核患者作為研究對(duì)象，另選擇35例同期健康體檢者作為對(duì)照組，比較各種檢測(cè)方法診斷的敏感性，并采用特異性、準(zhǔn)確度作為診斷試驗(yàn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)。結(jié)果證實(shí)，T-SPOT.TB檢測(cè)診斷耐多藥肺結(jié)核敏感性最高，達(dá)95.6%， T-SPOT.TB檢測(cè)用于診斷耐多藥肺結(jié)核的特異度最高，達(dá)91.9%， T-SPOT.TB檢測(cè)用于診斷耐多藥肺結(jié)核的準(zhǔn)確度最高，達(dá)96.2%，顯著高于其他各項(xiàng)檢測(cè)方法，差異具有顯著性（P＜0.05）。與張玉平等[23]報(bào)道觀點(diǎn)相符，與其他檢查方法相比，TSPOT.TB對(duì)診斷耐多藥肺結(jié)核具有特異性高、準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)。

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Application value of T.SPOT-TB test in the diagnosis of Multidrug Resistant Patients with Pulmonary Tuberculosis

HU Yuqing1PAN Aizhen2WANG Jing1ZHU Min1
1.Tuberculosis laboratory, Hangzhou Red Cross Hospital, Hangzhou 310003, China; 2.Tuberculosis Laboratory, Zhejiang Provincial Center for Disease Control and prevention, Hangzhou 310051, China

ObjectiveTo analyze and discuss the application value of T.SPOT-TB test in the diagnosis of Multidrug Resistant Patients with Pulmonary Tuberculosis.Methods71 multi-drug resistant patients with pulmonary tuberculosis in our hospital from January 2014 to January 2016 were selected,In addition, 35 healthy persons were selected as control group. The sensitivity of the various diagnostic methods was compared. Specificity and accuracy were used as the evaluation indexes of diagnostic tests.Resultsthe positive rate of T-SPOT.TB in the diagnosis of multi drug resistant pulmonary tuberculosis was the highest, reaching 95.6%, which was significantly higher than other detection methods, and the difference was significant(P＜ 0.05). The sensitivity of acid-fast bacilli sputum smear, culture of bacteria and T-SPOT.TB testing in the diagnosis of multi drug resistant pulmonary tuberculosis were high, reached more than 90%. The specificity of T-SPOT.TB detection for the diagnosis of multi drug resistant pulmonary tuberculosis was the highest, up to 91.9%, significantly higher than other detection methods, and the difference was significant(P＜ 0.05). The accuracy of T-SPOT.TB detection in the diagnosis of multi drug resistant pulmonary tuberculosis was the highest, up to 96.2%, significantly higher than other detection methods, and the difference was significant(P＜0.05).ConclusionCompared with other examination methods, T.SPOT-TB test has the advantages of high specificity and high accuracy in the diagnosis of multi drug resistant pulmonary tuberculosis. It is worth popularizing and applying. It is worth popularizing and applying.

Multi drug resistant pulmonary tuberculosis; T.SPOT-TB test

R446.1

B

2095-0616（2016）21-147-04

2016-09-10）

▲通訊作者