膠滴腫瘤藥敏檢測技術(shù)對膀胱灌注化療藥物選擇的臨床研究

王美才周榮升周祥舉龐 昆▲韓從輝

1.江蘇省沭陽縣中心醫(yī)院泌尿外科，江蘇沭陽 223600；2.東南大學(xué)附屬徐州市中心醫(yī)院泌尿外科，江蘇徐州 221000

膠滴腫瘤藥敏檢測技術(shù)對膀胱灌注化療藥物選擇的臨床研究

王美才1周榮升2周祥舉2龐 昆2▲韓從輝2

1.江蘇省沭陽縣中心醫(yī)院泌尿外科，江蘇沭陽 223600；2.東南大學(xué)附屬徐州市中心醫(yī)院泌尿外科，江蘇徐州 221000

目的研究膠滴腫瘤藥敏檢測技術(shù)對膀胱灌注化療藥物選擇的作用。方法對145例行經(jīng)尿道等離子電切的膀胱癌患者進(jìn)行隨訪，根據(jù)是否采用腫瘤藥敏檢測分為兩組，A組根據(jù)藥敏檢測技術(shù)采用吡柔比星、表柔比星、絲裂霉素或吉西他濱灌注化療，B組不經(jīng)藥敏檢測，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)僅采用吡柔比星灌注化療。比較兩組患者的年齡、性別、是否吸煙、腫瘤級別、腫瘤大小等基線資料；采用生存分析模型比較組間腫瘤復(fù)發(fā)率和復(fù)發(fā)時間。結(jié)果兩組患者在年齡（P=0.2915）、性別（P=0.5268）、是否吸煙（P=0.8915）、腫瘤級別（P=0.1931）和腫瘤大小（P=0.1655）的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩組患者隨訪復(fù)發(fā)率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.0298＜0.05）。生存分析結(jié)果：兩組之間復(fù)發(fā)時間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.663，P=0.0098＜0.05）。結(jié)論使用CD-DST法對體外原代膀胱尿路上皮癌細(xì)胞進(jìn)行膀胱灌注化療藥物敏感度測定，可以有效選擇敏感化療藥物，有效降低膀胱癌復(fù)發(fā)率，并有效推遲膀胱癌復(fù)發(fā)時間，為膀胱灌注化療的個體化藥物選擇上，有重要意義。

膀胱灌注化療；膠滴腫瘤藥敏檢測技術(shù)；藥物選擇；復(fù)發(fā)率；生存曲線分析

淺表性膀胱癌的治療首選經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切除（TUR-Bt），但術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，40%～70%的膀胱癌患者在術(shù)后1年內(nèi)復(fù)發(fā)[1]。術(shù)后的膀胱灌注化療成為預(yù)防膀胱癌復(fù)發(fā)的關(guān)鍵治療措施。但是目前在膀胱灌注化療藥物的選擇上，臨床上具有盲目性和經(jīng)驗(yàn)用藥的隨眾性。目前國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道的膀胱灌注化療藥物的選擇方法有兩種：基因選擇法[2]和腫瘤藥敏法[3]。其中，腫瘤藥敏法作為一種較為經(jīng)濟(jì)、有效、方便的選擇方法，得到臨床醫(yī)生的重視。徐州市中心醫(yī)院自2012年起開始應(yīng)用膠滴腫瘤藥敏檢測技術(shù)（CD-DST法）作為膀胱灌注化療藥物的選擇依據(jù)；同時，部分患者未選擇該法，并采用吡柔比星經(jīng)驗(yàn)用藥。我科對共計(jì)145例淺表性膀胱癌患者進(jìn)行跟蹤隨訪，研究CD-DST法對膀胱灌注化療的指導(dǎo)作用。

表1 兩組基線資料比較結(jié)果

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2012年7月～2014年7月在沭陽縣中心醫(yī)院泌尿外科和徐州市中心醫(yī)院泌尿外科因膀胱癌行經(jīng)尿道等離子電切術(shù)的145例患者進(jìn)行跟蹤隨訪。兩組患者在年齡（P=0.2915）、性別（P=0.5268）、是否吸煙（P=0.8915）、腫瘤級別（P=0.1931）和腫瘤大?。≒=0.1655）的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性（見表1）。根據(jù)是否行腫瘤藥敏實(shí)驗(yàn)檢測分為兩組，A組藥敏實(shí)驗(yàn)組，根據(jù)藥敏檢測技術(shù)采用吡柔比星、表柔比星、絲裂霉素或吉西他濱灌注化療；B組非藥敏實(shí)驗(yàn)組，不經(jīng)藥敏檢測，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)僅采用吡柔比星灌注化療，對隨訪結(jié)果進(jìn)行比較，采用生存分析模型對復(fù)發(fā)率進(jìn)行比較分析。注射用鹽酸表柔比星（速溶）（輝瑞制藥有限公司，H20000496）注射用鹽酸吡柔比星（海正輝瑞制藥有限公司，H20045983）絲裂霉素注射粉針（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，H33020786）注射用鹽酸吉西他濱（江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，H20030105）。

1.2 CD-DST法

將新鮮的膀胱尿路上皮癌組織在無菌條件下將腫瘤組織剪碎，膠原酶消化，獲得單細(xì)胞懸液。離心后接種于I型膠原蛋白包被的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)出原代膀胱尿路上皮癌細(xì)胞；棄去未貼壁的死細(xì)胞，獲得單細(xì)胞懸液。在冰浴的條件下，將I型膠原蛋白溶液、10×F12培養(yǎng)基和緩沖溶液按8：1：1體積比混合制成膠原蛋白混合溶液，將腫瘤細(xì)胞懸液加入膠原蛋白混合溶液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/mL。在冰浴的條件下，將膠原蛋白-細(xì)胞混合溶液接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，形成膠滴后加入培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)24h后，分別加入THP及 EPI，同時設(shè)陰性對照孔。藥物作用下培養(yǎng)24h，洗去抗癌藥物，加入培養(yǎng)基，繼續(xù) 培養(yǎng)7d。并通過中性紅染色固定干燥后，利用Scion Image分析系統(tǒng)通過倒置顯微鏡對膠滴中細(xì)胞的染色情況進(jìn)行掃描，結(jié)果傳輸?shù)接?jì)算機(jī)。通過圖像軟件，設(shè)定亮度值128為閾值，可以排除染色較淺的成纖維細(xì)胞，直接計(jì)算腫瘤細(xì)胞形成的克隆進(jìn)行吸光度（A）值測定，計(jì)算出藥物的抑制率。

1.3 膀胱灌注化療

表柔比星采用50mg溶于40mL無菌5%葡萄糖溶液中經(jīng)導(dǎo)尿管灌入膀胱，并囑患者立位、左側(cè)臥位、右側(cè)臥位、仰臥位、俯臥位各持續(xù)12min，共計(jì)1小時后排空膀胱；吡柔比星采用30mg溶于40mL無菌生理鹽水溶液中；吉西他濱采用1g溶于40mL無菌生理鹽水溶液中；絲裂霉素20mg溶于40mL無菌生理鹽水溶液中，后三者灌注、體位與保留時間均同表柔比星。

藥敏實(shí)驗(yàn)組每位患者均術(shù)后即刻（8小時內(nèi)）灌注吡柔比星1次，然后術(shù)后1周根據(jù)藥敏結(jié)果進(jìn)行灌注化療，每周1次共計(jì)8次，然后每月1次滿2年。非藥敏實(shí)驗(yàn)組術(shù)后即可灌注吡柔比星1次，其余灌藥時間同藥敏實(shí)驗(yàn)組，但灌注藥物均為吡柔比星。兩組患者均每月進(jìn)行膀胱彩超檢查，可疑者進(jìn)行膀胱鏡檢查，每3個月進(jìn)行一次膀胱鏡檢查確定是否復(fù)發(fā)，隨訪期為2年，因2年未復(fù)發(fā)者無需膀胱灌注，失訪率較高，隨訪2年后結(jié)果未納入研究。

1.4 基線數(shù)據(jù)比較

比較兩組患者的年齡、性別、是否吸煙；比較兩組數(shù)據(jù)的腫瘤級別（低、中、高）、腫瘤大?。╩m）。

1.5 結(jié)果比較

比較兩組之間腫瘤復(fù)發(fā)概率和復(fù)發(fā)時間。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

表3 兩組不同時間累積治愈數(shù)與治愈率比較[n（%）]

2 結(jié)果

兩組患者隨訪復(fù)發(fā)率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0298＜0.05，表2）。療效分析，兩組患者在不同治療階段復(fù)發(fā)狀況見表3，生存曲線（治愈曲線）不交叉（圖1），采用Log-Rank檢驗(yàn)，兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=6.663，P=0.0098＜0.05）。采用COX生存曲線分析模型將兩組復(fù)發(fā)患者進(jìn)行治愈曲線分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩組間比較結(jié)果見表4。采用藥敏法選擇敏感藥物行膀胱灌注，會推遲腫瘤復(fù)發(fā)時間。

表2 兩組復(fù)發(fā)率比較結(jié)果[n（%）]

表4 兩組復(fù)發(fā)患者治愈曲線

3 討論

膀胱癌是美國男性排名第四、女性排名第九的惡性腫瘤，在我國是排名第十的惡性腫瘤[4]。其中，膀胱尿路上皮癌占93.2%，分期Tis、T1、T2占88.6%[5]。術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，40%～70%的膀胱癌患者在術(shù)后1年內(nèi)復(fù)發(fā)[1]。行TUR-Bt的Tis及T1患者，三年復(fù)發(fā)率為45.2%，復(fù)發(fā)時間平均為（11.0±9.0）個月，三年生存率為T1以下93.4%，T2期72.2%[5]。

圖1 兩組患者累積治愈曲線

目前膀胱癌的治療方式有很多，TUR-Bt仍然是Tis、T1、T2期手術(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)，目前還有膀胱部分切除術(shù)[6]、鈥激光膀胱腫瘤切除術(shù)[7]和綠激光膀胱腫瘤切除術(shù)[8]等。術(shù)后的膀胱灌注化療成為預(yù)防膀胱癌復(fù)發(fā)的關(guān)鍵治療措施。目前在膀胱灌注化療藥物的選擇有很多[9-13]：（1）吡柔比星；（2）吉西他濱；（3）絲裂霉素；（4）表柔比星；（5）吉西他濱和吡柔比星交替膀胱灌注化療；（6）其他聯(lián)合灌注化療。但目前膀胱灌注化療的選擇仍靠臨床經(jīng)驗(yàn)或某些研究成果，無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，中國泌尿外科疾病診斷與治療指南也未提供灌注藥物的選擇方法。以往我們一般膀胱癌術(shù)后灌注藥物根據(jù)自己的經(jīng)驗(yàn)或參考相關(guān)文獻(xiàn)選擇灌注藥物，膀胱尿路上皮癌的術(shù)后復(fù)發(fā)率較高。復(fù)發(fā)后再次均選擇經(jīng)尿道腫瘤腔鏡切除術(shù)（電切或激光），更換另外一種藥物進(jìn)行灌注，但是選擇的藥物具有隨機(jī)性，因?yàn)椴恢来嘶颊邔κ裁此幬锩舾?。膀胱灌注化療藥物選擇上具有盲目的、經(jīng)驗(yàn)性、隨機(jī)性。自從引入CD-DST后，手術(shù)中切除腫瘤送病理前常規(guī)留取部分腫瘤組織行腫瘤藥敏實(shí)驗(yàn)，然后根據(jù)藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳藥物，明顯降低腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)率、推遲腫瘤復(fù)發(fā)時間。

陳震[3]和肖振東等[14]早在2009年就對MTT法腫瘤藥敏試驗(yàn)在膀胱灌注化療藥物的選擇上做出研究，初步證實(shí)了腫瘤藥敏實(shí)驗(yàn)在膀胱灌注化療藥物選擇中起到的重要作用。徐州市中心醫(yī)院病理科采用新式腫瘤藥敏檢測方法，即CD-DST法應(yīng)用于臨床，指導(dǎo)膀胱灌注化療用藥。本研究中，使用腫瘤藥敏實(shí)驗(yàn)來選擇膀胱灌注化療的藥物，可以明顯降低膀胱癌復(fù)發(fā)率，并可以推遲中位復(fù)發(fā)時間。

CD-DST體外腫瘤藥敏檢測技術(shù)是一種較好的藥敏檢測方法，其所需標(biāo)本量較小，約1mm3即可，不會影響常規(guī)病理標(biāo)本的留取，彌補(bǔ)了目前其他藥敏技術(shù)的不足[15]。而且原代培養(yǎng)成功率高、能夠排除成纖維細(xì)胞對實(shí)驗(yàn)的干擾，在體外對抗癌藥物的特異性殺傷作用做出客觀評價。CD-DST體外腫瘤藥敏檢測技術(shù)可反映患者對不同抗腫瘤藥物敏感性的差異，檢測結(jié)果與臨床經(jīng)驗(yàn)有效率有較好的符合性，對抗腫瘤藥物的體外篩選和對個體化治療具有較高的實(shí)用性意義。

本研究表明，使用CD-DST法腫瘤藥敏檢測技術(shù)對體外原代膀胱尿路上皮癌細(xì)胞進(jìn)行膀胱灌注化療藥物敏感度測定，可以有效選擇敏感化療藥物，有效降低膀胱癌復(fù)發(fā)率，并有效推遲膀胱癌復(fù)發(fā)時間，為膀胱灌注化療的個體化藥物選擇上，有重要意義。

[1] 張國輝，鄭清友，關(guān)亞偉，等.保留膀胱綜合方法治療肌層浸潤性膀胱癌的療效評價[J].現(xiàn)代泌尿外科雜志，2012，17（4）：374-376.

[2] 李耀軍.GSPT1、MDR1、NQO1基因多態(tài)性與膀胱灌注化療藥物的選擇[D].蘇州：蘇州大學(xué)，2013.

[3] 陳震，浦金賢，陳衛(wèi)國，等.膀胱腫瘤化療藥物敏感性試驗(yàn)對個體化治療的指導(dǎo)作用[J].腫瘤研究與臨床，2009，21（3）：178-179，182.

[4] 王月生，鐘惟德.現(xiàn)代膀胱癌發(fā)病因素的流行病學(xué)分析[J].現(xiàn)代泌尿生殖腫瘤雜志，2010，2（6）：363-367.

[5] 劉剛，宋東奎，楊小明，等.膀胱癌576例流行病學(xué)分析[J].中國實(shí)用醫(yī)刊，2010，37（7）：63-64.

[6] Mai HX，Liu JL，Pei SJ，et al.Comparison of the shortterm efficacy of sequential treatment with intravesical single-port laparoscopic partial cystectomy with bladder preservation or open partial cystectomy in combination with cisplatin plus gemcitabine chemotherapy[J].Exp Ther Med，2015，10（1）：74-80.

[7] 陳偉.經(jīng)尿道鈥激光膀胱腫瘤切除術(shù)與經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)治療表淺層膀胱癌的療效和安全性：對比研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2014，17（2）：223-225.

[8] He D，F(xiàn)an J，Wu K，et al.Novel green-light KTP laser en bloc enucleation for nonmuscle-invasive bladder cancer：technique and initial clinical experience[J].J Endourol，2014，28（8）：975-979.

[9] 鄭紅淑，范海濤，馮樹強(qiáng)，等.表淺性膀胱癌TURBT術(shù)后吉西他濱和吡柔比星交替膀胱灌注預(yù)防復(fù)發(fā)的療效[J].中國老年學(xué)雜志，2015（16）：4579-4580.

[10] Huang W，Wang F，Wu C，et al.Efficacy and safety of pirarubicin combined with hyaluronic acid for non-muscle invasive bladder cancer after transurethral resection：a prospective，randomized study[J].Int Urol Nephrol. 2015，47（4）：631-636.

[11] 龔強(qiáng)，朱金海，張小馬，等.TURBt聯(lián)合術(shù)后灌注化療治療淺表性膀胱癌的療效分析[J].安徽醫(yī)藥，2014（11）：2122-2124.

[12] Lailler G，Neuzillet Y，Rouanne M，et al.Assessment of the optimization of the conditions of mitomycin C intravesical instillation completion in the setting of nonmuscle invasive bladder cancer treatment[J].Prog Urol，2016，26（2）：79-82.

[13] Pan XW，Li L，Huang Y，et al.Icaritin acts synergistically with epirubicin to suppress bladder cancer growth through inhibition of autophagy[J].Oncol Rep，2016，35（1）：334-342.

[14] 肖振東，李長嶺，田軍，等.利用體外藥敏試驗(yàn)指導(dǎo)膀胱癌臨床個體化灌注化療[J].現(xiàn)代泌尿生殖腫瘤雜志，2009，1（4）：207-209.

[15] 梁智，田海梅，李艷芬，等.膠滴腫瘤藥敏檢測技術(shù)（CD-DST）的建立及初步臨床應(yīng)用研究[J].癌癥進(jìn)展，2006，4（6）：545-549.

Clinical study of collagen gel droplet culture-drug sensitivity test for choosing intravesical chemotherapy of bladder cancer

WANG Meicai1ZHOU Rongsheng2ZHOU Xiangju2PANG Kun2HAN Conghui2
1.Department of Urology,Shuyang County Central Hospital,Shuyang 223600,China;2.Department of Urology,Xuzhou Central Hospital,Xuzhou 221000，China

ObjectiveTo study the collagen gel droplet culture-drug sensitivity test （CD-DST） for choosing intravesical chemotherapy of bladder cancer.MethodsAccording to the drug susceptibility testing technology,145 transurethral bladder cancer patients were divided into two groups.Group A used topiramate,doxorubicin,epirubici n, mitomycin,or gemcitabine chemotherapy and Group B used topiramate or doxorubicin without drug susceptibility testing.Comparing the basic data of patients,such as age,sex,smoking,tumor grade and tumor size.Tumor recurrence and recurrence interval can be found by using cox survival curve model.ResultsThere were not significant differences in age（P=0.2915）, sex（P=0.5268）, smoking（P=0.8915）,tumor grade（P=0.1931）,and tumor size（P=0.1655）,while it was statistically significant （P=0.0298＜0.05） in terms of relapse rate.The use of the drug susceptibility method to select sensitive bladder perfusion,would delay tumor recurrence （χ2=6.663,P=0.0098＜0.05）.ConclusionCDDST method of primary urothelial bladder cancer infusion chemotherapy sensitivity assay can effectively choose the sensitive chemotherapy drugs to effectively reduce the recurrence rate of bladder cancer in vitro.It is important to postpone the time of bladder cancer recurrence and effectively to choose intravesical individualized chemotherapy.

Intravesical chemotherapy;The collagen gel droplet culture-drug sensitivity test （CD-DST）;Drug selection;Recurrence rate;Cox survival curve model

R737.33

B

2095-0616（2016）21-80-04

2016-09-12）

江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（BE2015623）；江蘇省“科教興衛(wèi)”工程醫(yī)學(xué)重點(diǎn)人才科研項(xiàng)目（RC2011046）。

▲通訊作者