替加環(huán)素微生物限度方法學(xué)驗證研究

陳偉娜王燕清陳嘉璐

1.遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬 （珠海）醫(yī)院，廣東珠海 519100；2.麗珠醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司研究院，廣東珠海 519090

替加環(huán)素微生物限度方法學(xué)驗證研究

陳偉娜1王燕清2▲陳嘉璐2

1.遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬 （珠海）醫(yī)院，廣東珠海 519100；2.麗珠醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司研究院，廣東珠海 519090

目的建立替加環(huán)素的微生物限度驗證方法。方法取本品5g，加入100mL營養(yǎng)肉湯，均勻分散，500r/min離心3min，取上清，為1∶20供試液。分別取供試液1mL，按薄膜過濾法分別處理，用含0.3%吐溫80的0.1%滅菌蛋白胨水溶液沖洗濾膜，沖洗量600mL，以消除替加環(huán)素樣品的抑菌活性，進(jìn)行替加環(huán)素的細(xì)菌及真菌的微生物限度驗證。結(jié)果采用上述方法進(jìn)行驗證，5種菌的回收率均達(dá)到70%以上。結(jié)論采用薄膜過濾法，用600mL含0.3%吐溫80的0.1%滅菌蛋白胨水溶液沖洗濾膜的方法可用于替加環(huán)素微生物限度的檢查。

替加環(huán)素；微生物限度；方法學(xué)驗證；吐溫80

替加環(huán)素由惠氏（Wyeth）公司研發(fā)，美國FDA于2005年6月和2006年7月批準(zhǔn)惠氏的替加環(huán)素（Tigecycline，商品名Tygacil注射用替加環(huán)素）為治療復(fù)雜腹腔內(nèi)感染和復(fù)雜皮膚感染的一線藥物[1]，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。該品種是甘氨酰四環(huán)素類抗生素中獲得批準(zhǔn)的第一個產(chǎn)品。替加環(huán)素對G+菌、G-菌、厭氧菌有廣譜抗菌活性[2-4]，包括多重耐藥性的G+菌，如MRSA、MRSE、抗青霉素的肺炎鏈球菌、VRE[5-6]。對不同耐藥機(jī)制的耐四環(huán)素致病菌同樣有效[7-9]，但對銅綠假單胞菌無抗菌活性[10]。替加環(huán)素是新型甘胺酰環(huán)素類抗生素，主要與細(xì)菌核糖體30S亞基結(jié)合，阻礙氨基酸肽延長，從而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成來發(fā)揮抗菌活性[11]。他克服或限制了很多抗菌藥物產(chǎn)生的兩種主要耐藥機(jī)制:外排泵和核糖體保護(hù)[12]。避免了四環(huán)素類抗生素耐藥機(jī)制對其產(chǎn)生作用。

因為替加環(huán)素的抑制細(xì)菌能力很強(qiáng)，所以我們在微生物限度方法學(xué)驗證中，采用了直接接種法及培養(yǎng)基稀釋法及不加吐溫的薄膜過濾法等常規(guī)方法，細(xì)菌的回收率均無法達(dá)到要求。為消除本品的抑菌活性，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)沖洗液中加入一定量的吐溫后，即可滿足細(xì)菌回收率的要求，我們通過對吐溫含量和沖洗量的考察，最終確定本品的微生物限度方法，即采用薄膜過濾法，取1ml的供試品溶液，用600mL pH7.0含0.3%吐溫80的0.1%無菌蛋白胨溶液作為沖洗液。具體研究如下。

圖1 替加環(huán)素結(jié)構(gòu)式

表1 不同吐溫濃度的影響

1 材料

1.1 實(shí)驗器材

YB-DX23D型電動吸引器[上海醫(yī)療器械工業(yè)（集團(tuán)）公司醫(yī)用吸引器廠]，800型離心機(jī)（上海手術(shù)器械廠），過濾器（浙江寧?？h城關(guān)白石醫(yī)藥儀器廠）。

1.2 樣品

替加環(huán)素，由麗珠醫(yī)藥集團(tuán)研究所提供。

1.3 培養(yǎng)基及沖洗液

培養(yǎng)基：胰酪大豆胨培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基均購自廣東環(huán)凱微生物有限公司。培養(yǎng)基適用性符合《中國藥典》2015版，四部(通則1105)規(guī)定[13]。沖洗液：pH 7.0含0.3%吐溫80的0.1%蛋白胨水溶液。

1.4 試驗用菌種

金 黃 色 葡 萄 球 菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003]；銅 綠 假 單 胞 菌(pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10104]；枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]；白 色 念 珠 菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]；黑曲霉(Aspergillus niger) [CMCC(F)98003]。菌種均來自中國食品藥品檢定研究院醫(yī)學(xué)菌種保藏中心。

2 方法與結(jié)果

參照2015版《中國藥典》方法及注射用替加環(huán)素進(jìn)口注冊標(biāo)準(zhǔn)。

2.1 菌液制備

參照2015版《中國藥典》四部(通則1105)規(guī)定的檢查法操作，取30～35℃培養(yǎng)24h的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌,20至25℃培養(yǎng)3d的白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成50～100CFU/mL的菌懸液，備用。取20～25℃培養(yǎng)6d黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物加入0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液4mL洗下孢子，吸出轉(zhuǎn)移至空試管作為原液，用含有0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋，得到50～100CFU/mL的孢子懸液，備用。

2.2 供試品溶液的制備

因原料成本較高而且抑菌活性較強(qiáng)，因此在制備供試液時選擇1∶20供試液而不選用1∶10的，具體操作如下：取本品5g，加入100mL營養(yǎng)肉湯，均勻分散，500r/min離心3min，取上清，為1∶20供試液。

2.3 試驗步驟

因為替加環(huán)素對真菌沒有抑菌活性，所以在方法學(xué)摸索的過程中只選取細(xì)菌進(jìn)行驗證，待方法確定后，再進(jìn)行5種菌的驗證，具體步驟如下：（1）吐溫濃度的選擇 在參考替加環(huán)素原料廠家提供的微生物限度檢測方法的基礎(chǔ)上，我們考察了沖洗液中加入不同濃度吐溫80的細(xì)菌回收率情況，分別考察了3.0%（原料廠家提供的濃度）、1.0%、0.5%、0.3%及0.1%五種濃度，沖洗量均為800mL的回收率情況，見表1。

結(jié)果顯示，當(dāng)吐溫的濃度達(dá)到0.3%以上時，三種菌的回收率均可達(dá)到70%以上。由于在配制溶液，當(dāng)吐溫的濃度越大，吐溫越難溶解，而且，在過濾過程中會產(chǎn)生大量的氣泡從而影響試驗操作，因此選定0.3%的吐溫濃度。

表2 不同沖洗量的影響

表3 細(xì)菌、霉菌及酵母菌回收率菌落計數(shù)

沖洗量的確定 為了確定沖洗液的沖洗量，本試驗用含0.3%吐溫80的沖洗液，選擇了800mL、600mL、500mL及400mL的四種沖洗體積，以確定微生物限度驗證的沖洗量，見表2。

從試驗結(jié)果可知，當(dāng)沖洗液的沖洗體積在500mL以上時即可滿足回收率的要求，為了確保試驗結(jié)果，我們確定選用600mL的沖洗液進(jìn)行沖洗。

驗證方法學(xué)的確定 從以上試驗結(jié)果可知，選用600mL的pH 7.0含0.3%吐溫80的0.1%蛋白胨水溶液作為沖洗液可保證各種菌的回收率均達(dá)到70%以上，為了驗證該方法，我們用以上確定的方法，進(jìn)行細(xì)菌、真菌的驗證，共進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗：試驗方法，試驗組用少量稀釋液先將孔徑為0.45μm的薄膜過濾器潤濕，取供試液1mL，加至50mL的稀釋液中，直接通過過濾器，用稀釋液沖洗濾膜，每次100mL，共沖洗6次，在最后一次沖洗液剩余約15mL時加入50～100cfu/mL驗證菌株，取出濾膜，菌面朝上貼于已凝固的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上。每種菌株制備兩個平皿。菌液對照組：用少量稀釋液先將孔徑為0.45μm的薄膜過濾器潤濕，用稀釋液50mL沖洗濾膜，在沖洗液剩余約15mL時加入50～100cfu/mL驗證菌株，取出濾膜，菌面朝上貼于已凝固的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上。每種菌株制備兩個平皿。供試液對照組：用少量稀釋液先將孔徑為0.45μm的薄膜過濾器潤濕，取供試液1mL，加至50mL的稀釋液中，直接通過過濾器，沖洗、培養(yǎng)方法同試驗組。稀釋劑對照組取營養(yǎng)肉湯稀釋液替代供試品，沖洗、培養(yǎng)方法同試驗組。培養(yǎng) 將細(xì)菌平皿倒置于30～35℃下培養(yǎng)48h，霉菌平皿倒置于23～28℃下培養(yǎng)72h。觀察和計數(shù)：對每個平皿逐日檢查計數(shù)，結(jié)果以培養(yǎng)終了時的計數(shù)為準(zhǔn)，并將每組試驗中接有相同試驗菌株的平皿計數(shù)進(jìn)行平均，取平均值，見表3。觀察微生物的菌落形態(tài)并做革蘭氏染色，以確認(rèn)生長菌與接入的微生物相同。

由實(shí)驗結(jié)果可知，利用該方法，五種菌的回收率均達(dá)到70%以上，因此確定該驗證方法可行。

3 討論

因為替加環(huán)素對G+菌、G-菌、厭氧菌有廣譜抗菌活性， 包括多重耐藥性的G+菌，如MRSA、MRSE、抗青霉素的肺炎鏈球菌、VRE，所以不能使用常規(guī)方法進(jìn)行微生物限度驗證。替加環(huán)素原料廠家已提供有微生物限度驗證方法，其采用培養(yǎng)基稀釋法，采用的是0.3%大豆卵磷脂3%吐溫80胰蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基。但其存在一定的問題，我們按其提供的方法進(jìn)行方法學(xué)研究時發(fā)現(xiàn)，因其培養(yǎng)基顯白色，所以菌落無法計數(shù)，從而無法進(jìn)行微生物限度驗證。

當(dāng)藥品本身具有抗菌活性時，應(yīng)當(dāng)首先消除其抗菌活性，才能保證檢驗結(jié)果的真實(shí)性和有效性[14]。對于一些抑菌活性較強(qiáng)的抗生素，要消除其抑菌活性，可在沖洗液中加入一定濃度的吐溫80[15-16]。原料廠家提供的方法中采用的沖洗液中含有3.0%的吐溫80，過濾過程中會產(chǎn)生大量的氣泡而影響試驗操作。我們通過對沖洗液中吐溫80的濃度進(jìn)行摸索，發(fā)現(xiàn)當(dāng)吐溫80的濃度達(dá)到0.3%以上時，實(shí)驗菌的回收率均可達(dá)到70%以上，所以我們將沖洗液中吐溫80的濃度從3.0%降低為0.3%，從而避免了過濾過程中會產(chǎn)生大量的氣泡而影響試驗操作。

沖洗液的用量對于很多抑菌活性強(qiáng)的藥品的微生物限度驗證至關(guān)重要，太少了無法消除抑菌活性，太多了有可能會致使濾膜破裂。我們通過對不同沖洗液體積的研究，確定使用600mL含0.3%吐溫80的沖洗液即可消除替加環(huán)素的抑菌活性，達(dá)到微生物驗證的目的。

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Research of microbial limit methodology validation of tigecycline

CHEN Weina1WANG Yanqing2CHEN Jialu2
1.The Fifth Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Zhuhai 519100,China;2.The Institute of Livzon Pharmaceutical Group Inc.,Zhuhai 519020,China

ObjectiveTo establish a method for microbial limit test on tigecycline.MethodsThe sample (5g) was dispersed uniformly to the nutrient broth medium (100mL),which was centrifuged for 3 minutes at 500r/min.The supernatant was diluted with the ratio of 1:20 as the test solution,and the filter membranes were incubated with the test solution (1mL) respectively,which was rinsed by the sterile solution(600mL) containing 0.3% tween-80 and 0.1% peptone,with the aim of eliminating the interference of tigecycline's bacteriostatic activity,to verify the method of Tigecycline's microbial limit test.ResultsWith the method above,the recoveries of all the five validated bacteria were over 70%.ConclusionThe membrane filtration method,which is that the membrane-filter is rinsed by the sterile solution (600mL) containing 0.3% tween-80 and 0.1% peptone,and it can be applied for the test of Tigecycline’s microbial limit.

Tigecycline;Microbial limit test;Methodology validation;Tween-80

R446.5

B

2095-0616（2016）21-67-04

2016-09-07）

廣東省珠海市高新技術(shù)領(lǐng)域科技攻關(guān)及高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)化項目（2012D0201990040）。

▲通訊作者