毒熱清顆粒提取工藝優(yōu)選

施鈞瀚秦會(huì)珍，2Δ鄭 弘孟祥樂(lè)，2▲

1.河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南鄭州 450000；2.河南大學(xué)藥學(xué)院，河南開(kāi)封 475004

毒熱清顆粒提取工藝優(yōu)選

施鈞瀚1秦會(huì)珍1，2Δ鄭 弘1孟祥樂(lè)1，2▲

1.河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南鄭州 450000；2.河南大學(xué)藥學(xué)院，河南開(kāi)封 475004

目的優(yōu)選毒熱清顆粒的水提工藝條件。方法以黃芩苷，綠原酸為指標(biāo)，HPLC測(cè)定含量，Agilent ZORBAX XDB-C18色譜柱（4.6mm×150mm，5μm)，流動(dòng)相甲醇-0.4%磷酸梯度洗脫，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm（黃芩苷）、327nm（綠原酸）。選加水量、提取次數(shù)、提取時(shí)間為考察因素，采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)選毒熱清顆粒的水提取工藝。結(jié)果最佳水提取工藝為加12倍量水提取2次，每次2h。結(jié)論該工藝有效成分提取完全，工藝簡(jiǎn)單，適合于工業(yè)生產(chǎn)的需要。

毒熱清顆粒；黃芩苷；正交試驗(yàn)；高效液相色譜法；提取工藝

毒熱清顆粒方是醫(yī)院臨床經(jīng)驗(yàn)方。該方藥具有清熱解毒、瀉火散結(jié)之功效。用于熱毒壅盛證，癥見(jiàn)壯熱口渴，心胸?zé)帷⒖谏嗌?，瘰疬痰核，疔瘡腫毒，小便黃赤等。方中黃芩清熱燥濕，瀉火解毒；金銀花清熱解毒，疏散風(fēng)熱，連翹、紫花地丁清熱解毒，涼血消腫散結(jié)，甘草清熱解毒，調(diào)和諸藥。全方共奏清熱解毒、瀉火散結(jié)之功。本文對(duì)該方的提取工藝進(jìn)行研究，擬制成醫(yī)院制劑。

1 儀器與試藥

Waters e2695高效液相色譜儀；色譜柱：Agilent XDB-C18柱（4.6mm×150mm，5μm）；Sartorius CP225D電子天平，科導(dǎo)臺(tái)式超聲波清洗器（Hk250型），AP-01P型真空泵（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)：110715-201318）、綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：110753-201314）均來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院，用于流動(dòng)相試劑均為色譜純，西格瑪公司生產(chǎn)，水為純化水，其它試劑為分析純。飲片來(lái)源于安徽普仁藥業(yè)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝的選擇

根據(jù)處方中藥材的成分參照參照參考文獻(xiàn)[1-2]，采用水煎煮提取工藝，用正交試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)選。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)文獻(xiàn)[3-7]，指標(biāo)成分選取黃芩苷 、綠原酸，采用L9（34）正交表安排實(shí)驗(yàn)，對(duì)加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)進(jìn)行考察。因素水平表見(jiàn)表1。

2.3 樣品制備

稱(chēng)取藥材9份（按處方比例），按表 2試驗(yàn)分別提取，合并提取液，冷卻（室溫）后測(cè)量體積，備用。

表1 因素水平表

2.4 含量測(cè)定

2.4.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取黃芩苷對(duì)照品11.92mg，加甲醇定容至50mL，制成每1mL含238.2μg的對(duì)照品溶液。取綠原酸對(duì)照品10.54mg，精密稱(chēng)定，加甲醇定容至50mL，制成每1mL含210.8μg的對(duì)照品溶液。

2.4.2 供試品溶液的制備 量取正交試驗(yàn)的樣品10.0mL甲醇稀釋至50mL，搖勻靜置，取上清液即得。

2.4.3 陰性對(duì)照溶液的制備 缺黃芩樣品溶液：稱(chēng)取本處方中的藥材（按處方比例不含黃芩），按正交5號(hào)的條件制備缺黃芩樣品，然后按供試品溶液制備方法制備，得缺黃芩陰性對(duì)照溶液。

缺金銀花樣品溶液：稱(chēng)取本處方中的藥材（按處方比例不含金銀花），按正交5號(hào)的條件制備缺金銀花樣品，然后按供試品溶液制備方法制備，得缺金銀花陰性對(duì)照溶液。

2.4.4 色譜條件色譜柱 Agilent XDB-C18柱（4.6mm×150mm，5μm）；流動(dòng)相甲醇-0.4%磷酸梯度洗脫：0～25，甲醇25～47，25～35，甲醇47～47，35～36甲醇47～25，36～40甲醇25～25；檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm（黃芩苷）和327nm（綠原酸）[8-9]，流速：1.0mL/min，柱溫25℃。

2.4.5 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取以上各種樣品溶液（對(duì)照品、供試品、陰性溶液）各5μL，依法測(cè)定，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。結(jié)果供試品溶液色譜圖中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，有相同的色譜峰，而陰性溶液在待測(cè)組分處無(wú)干擾。

圖1 HPLC圖

2.4.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 取黃芩苷對(duì)照品溶液（每 1mL含 238.2μg）2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL，分別置10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，配制成5種不同濃度的黃芩苷對(duì)照品溶液，取綠原酸對(duì)照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL，分別置10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，配制成5種不同濃度的綠原酸對(duì)照品溶液，取上不同濃度的黃芩苷和綠原酸對(duì)照品溶液，分別依法測(cè)定其峰面積。以對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，得黃芩苷回歸方程為：Y=3.10E+06X-1.56E+05（R=0.9999）；綠原酸回歸方程為：Y=1.28E+06X-5.67E+04（R=0.9999），結(jié)果表明黃芩苷進(jìn)樣量在0.4764～2.382 μg，綠原酸在0.4216～2.108μg成線(xiàn)性關(guān)系。

表2 正交試驗(yàn)表及結(jié)果

表3 方差分析表

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn) 重復(fù)性試驗(yàn) 取黃芩苷和綠原酸對(duì)照品等體積混合溶液，連續(xù)測(cè)定6次，每次進(jìn)樣5μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算得其黃芩苷RSD為0.6%，綠原酸RSD為0.7%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.4.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品依法測(cè)定，于0、2、4、6、8、10、12h各進(jìn)樣1次，測(cè)定黃芩苷、綠原酸峰面積，計(jì)算得黃芩苷RSD為1.2%，綠原酸RSD為1.1%。結(jié)果表明，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 工藝優(yōu)選

工藝優(yōu)選：以黃芩苷和綠原酸的正交實(shí)驗(yàn)提取含量為指標(biāo)，計(jì)算試驗(yàn)結(jié)果（黃芩苷和綠原酸的提取量計(jì)算方法為：提取量=供試品溶液濃度×稀釋倍數(shù)×水煎液體積÷投料藥材重量），結(jié)果見(jiàn)表2～3。

結(jié)果分析：以黃芩苷為考察指標(biāo)，因素A和B有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），C因素有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；以綠原酸為考察指標(biāo)，因素A和B無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），C因素有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；另外，從結(jié)果中可以看出以黃芩苷和綠原酸為考察指標(biāo)結(jié)果基本一致，因此，根據(jù)正交試驗(yàn)直觀分析因素A、因素B和因素C均選擇水平3。最佳提取工藝為A3B3C3。即加12倍量水，煎煮3次，每次2h。綜合生產(chǎn)實(shí)際狀況，C因素2水平和3水平相差不大，可以考慮選擇水平2，即加12倍量水，煎煮2次，每次2h，即正交實(shí)驗(yàn)9的提取方法，該方法屬于正交實(shí)驗(yàn)，可以不用驗(yàn)證。因此可以驗(yàn)證A3B3C3的提取結(jié)果，根據(jù)結(jié)果確定最終提取工藝。

2.6 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

稱(chēng)取3份處方藥材，按照加12倍量水，煎煮2次，每次2h的工藝提取，用上述方法測(cè)定黃芩苷和綠原酸的提取量。結(jié)果，樣品中黃芩苷的提取量分別 為：105.7、103.6、108.0mg/g（RSD=2.08%，n=3），樣品中綠原酸的提取量分別為：80.2、78.6、81.5mg/g（RSD=1.81%，n=3），均高于正交實(shí)驗(yàn)的最高含量，但是與正交9的結(jié)果相差不大，因此最佳工藝定為：加12倍量水，煎煮2次，每次2h，并認(rèn)為該工藝可行。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC同時(shí)檢測(cè)黃芩苷、綠原酸的含量，根據(jù)文獻(xiàn)[9-13]采用甲醇-（0.1%、0.2%、0.4%）磷酸溶液、甲醇-冰醋酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.4%磷酸溶液為流動(dòng)相，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)比，最終流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸梯度洗脫，目標(biāo)峰達(dá)到較好的基線(xiàn)分離，且保留時(shí)間適宜。

根據(jù)文獻(xiàn)提取工藝采用水煎煮提取，以君藥黃芩和金銀花中黃芩苷、綠原酸的含量為考察指標(biāo)，文獻(xiàn)多采用綜合加權(quán)評(píng)分法[14-15]，但是本實(shí)驗(yàn)兩種成分的結(jié)果相一致，因此對(duì)于正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果不再進(jìn)行綜合評(píng)分法處理，而是采用分別單獨(dú)處理。

[1] 饒小勇，何雙鳳，吳志鵬，等.抗流感口服液的提取工藝優(yōu)選[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（4）：31-34.

[2] 王倩倩，王錦玉，馬振山，等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化解毒通絡(luò)顆粒的提取工藝[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（9）：15-18.

[3] 鄭勇鳳，王佳婧，傅超美，等.黃芩的化學(xué)成分與藥理作用研究進(jìn)展[J].中成藥，2016，38（1）：141-147.

[4] 付國(guó)輝，馬香芹.黃芩的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2015，22（22）：18-20.

[5] 張小娜，童杰，周衍晶，等.忍冬屬藥材藥效成分及藥理作用研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2014，30（8）：1049-1054.

[6] 龐美蓉，劉零怡，高汪磊，等.綠原酸調(diào)節(jié)糖脂代謝的作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].中草藥，2015，46（2）：305-312.

[7] 韓悅.金銀花活性成分的藥理作用及其進(jìn)展[J].科技經(jīng)濟(jì)導(dǎo)刊，2016，01：148-149.

[8] 司席席，孫洪勝.復(fù)方金芩片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國(guó)藥房，2016，27（3）：415-417.

[9] 李輝，謝新民，李騰霞，等.大自然五花飲的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究[J].中國(guó)藥房，2016，27（6）：811-814.

[10] 景霞，徐進(jìn)，孫芳，湛雯.利咽合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國(guó)藥房，2015，26（36）：5141-5143.

[11] 郗洋，張熙潔，劉曉紅.HPLC法同時(shí)測(cè)定連翹敗毒丸中5種成分的含量[J].中國(guó)藥房，2016，27（6）：815-818.

[12] 尹香閣，田效志，熊晶晶，等.清膽和胃丸中芍藥苷和黃芩苷含量測(cè)定的研究[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，29（1）：82-85.

[13] 于紅艷，張賓.HPLC法同時(shí)測(cè)定退黃丸中綠原酸、梔子苷的含量[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，29（8）：1170-1171.

[14] 王雪，焦連慶，于敏，等.多指標(biāo)綜合加權(quán)評(píng)分法優(yōu)選五味子與丹參混合醇提工藝研究[J]. 中草藥，2015，46（7）：998-1001.

[15] 劉敏，楊全偉，劉新國(guó)，等.多指標(biāo)加權(quán)評(píng)分正交試驗(yàn)優(yōu)選消痤散提取工藝[J].中西醫(yī)結(jié)合研究，2015，7（4）：194-197.

Optimization of extraction technology for dureqing granule

SHI Junhan1QIN Huizhen1,2ZHENG Hong1MENG Xiangle1,2
1.First Affiliated Hospital of He'nan University of Traditional Chinese Medicine,He'nan 450000,China; 2.Pharmaceutical College of He'nan University,Kaifeng 475004,China

ObjectiveTo optimize the extraction process of dureqing granule.MethodsBaicalin and chlorogenic acid were used as indexes, HPLC was used to determined content. Agilent ZORBAX XDB-C18colume (4.6mm×150mm,5 μm), Mobile phase methanol -0.4% phosphoric acid gradient elution with flow rate of 1.0 mL/min, UV detection wavelength was 280 nm(baicalin)and 327nm(chlorogenic acid ). Amount of water added, extraction time, and extraction times were selected as the factors. L9（34）orthogonal test was designed to optimize the extraction technology of Dureqing Keli.ResultsOptimal water extraction technology was as follows : adding 12 times amount of water, reflux and extract for 2 h, three times totally.ConclusionThe optimized technology was simple and extract completely, it is applied to industrial manufacture.

Dureqing granule;Bbaicalin;Chlorogenic acid;Orthogonal design;HPLC;Extraction process

R286

B

2095-0616（2016）21-56-04

2016-08-17）

國(guó)家自然科學(xué)基金·河南省人民政府人才培養(yǎng)聯(lián)合基金（ U1304824）；中國(guó)博士后科學(xué)基金特別資助（2015T80772）；中國(guó)博士后科學(xué)基金面上資助（2015M582190）；河南省博士后基金項(xiàng)目（2014-75）；濟(jì)源市科技攻關(guān)項(xiàng)目(15013034) ；河南省科技廳“三區(qū)”人才計(jì)劃（14104259）。

Δ2016級(jí)河南大學(xué)在讀碩士研究生

▲通訊作者