板藍根抗病毒活性成分生物合成的研究進展＊

肖 瑩，馬瑞芳，陳軍峰，楊穎博，張 磊，陳萬生＊＊

（1. 第二軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院藥學部 上海 200003；2. 第二軍醫(yī)大學藥學院 上海 200433；3. 上海中醫(yī)藥大學中藥研究所 上海 201203）

板藍根抗病毒活性成分生物合成的研究進展＊

肖 瑩1，馬瑞芳1，陳軍峰1，楊穎博3，張 磊2＊＊，陳萬生1＊＊

（1. 第二軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院藥學部 上海 200003；2. 第二軍醫(yī)大學藥學院 上海 200433；3. 上海中醫(yī)藥大學中藥研究所 上海 201203）

板藍根為十字花科（Cruciferae）植物菘藍Isatis indigotica Fort.的干燥根，是清熱解毒類的代表性中藥。以落葉松脂素為代表的木脂素類成分是板藍根發(fā)揮抗病毒活性的重要物質基礎。本文綜述板藍根木脂素類成分生源途徑解析、關鍵調控基因篩選和次生代謝工程調控方面的研究進展，為全面認識板藍根抗病毒活性成分生物合成、提升板藍根藥材品質及促進板藍根藥用資源的可持續(xù)利用等奠定基礎。

板藍根 菘藍 抗病毒 木脂素 生物合成

板藍根（Isatidis Radix）為十字花科（Cruciferae）菘藍屬（Isatis）植物菘藍Isatis indigotica Fort.的干燥根，始載于《神農本草經》，稱為“藍”，被列為上品，性寒、味苦，具有清熱解毒、涼血利咽等功效，主治溫疫時毒、發(fā)熱咽痛、溫毒發(fā)斑、痄腮、爛喉丹痧、大頭瘟疫、丹毒、癰腫[1]。目前，其主要制劑有板藍根沖劑、板藍根注射液、板藍根膠囊、板藍根含片等，臨床用于流行性感冒、流行性乙型腦炎、急慢性肝炎、流行性腮腺炎、帶狀皰疹等。眾所周知，在2003年抗擊非典型性肺炎SARS和2008年與甲型H1N1流感病毒的斗爭中，板藍根被廣泛應用[2-4]。在當下全球流感肆虐之時，板藍根的相關研究倍受關注。

李彬對板藍根化學成分進行了系統(tǒng)研究，采用雞胚法篩選發(fā)現(xiàn)木脂素類化合物落葉松脂素（圖1A）和落葉松脂素苷（圖1B）具有顯著的抗病毒活性[5]。鐘南山教授課題組研究發(fā)現(xiàn)落葉松脂素苷可以抑制流感病毒誘導的炎癥反應[6]，其衍生物Clemastanin B [7S,8R,8'R-(-)-lariciresinol-4,4'-bis-O-β-D-glucopyranoside]（圖1C）具有抗甲型和乙型流感病毒的活性[7]。這些結果有力詮釋了以落葉松脂素為代表的木脂素類成分具有確切的抗病毒活性。

然而，對阜陽、亳州、赤峰、泰興、上海等12個地區(qū)的板藍根含量測定結果顯示，落葉松脂素及落葉松脂素苷的含量分別僅為47.14 μg·g-1和84.67 μg·g-1[5]。因此，闡明板藍根基源植物菘藍中木脂素類次生代謝產物的生源途徑，探明其代謝調控機制，通過生物技術提高抗病毒活性成分的含量，是解決日益增長的藥源需求和有限植物資源間的矛盾的可行途徑，也是保障針對此類植物藥源的新藥開發(fā)、臨床應用和質量控制的關鍵。

1 菘藍中抗病毒活性木脂素生源途徑的解析

植物中落葉松脂素的生物合成途徑已經初步探明[8，9]，是經過苯丙氨酸途徑由苯丙氨酸脫氨形成肉桂酸起始，經一系列羥基化、甲基化與還原反應，首先生成木脂素單體松柏醇，然后松柏醇在聚合蛋白酶（DirigentProtein，DIR）和松脂醇還原酶（Pinoresinolreductase，PLR）的催化作用下最終生成落葉松脂素。在某些植物中，落葉松脂素能進一步被松脂醇還原酶催化生成開環(huán)異落葉松脂素，開環(huán)異落葉松脂素在開環(huán)異落葉松脂素脫氫酶（Secoiso lariciresinolDehydrogenase，SIRD）的作用下生成羅漢松樹脂酚，在糖基轉移酶（UDP-sugar-dependent Glycosyltransferase，UGT）的作用下生成開環(huán)異落葉松脂素二葡萄糖苷（圖2）。開環(huán)異落葉松脂素、羅漢松樹脂酚和開環(huán)異落葉松脂素二葡萄糖苷都是具有重要生物活性的木脂素類成分[10]。

為了闡明菘藍中特有的落葉松脂素生物合成途徑，該途經中一系列催化酶基因被陸續(xù)從菘藍中分離得到，并進行了生物信息學分析和表達特征研究（表1）。需要指出的是，菘藍轉錄組測序的完成極大推動了落葉松脂素生物合成途徑的全面解析。研究人員分別使用Roche 454平臺及IlluminaHiSeq兩種測序技術平臺，對菘藍根、莖、葉和花不同器官進行了轉錄組測序，最終獲得了包含36367條ORF序列的菘藍表達基因數(shù)據(jù)庫。通過轉錄組功能（Gene Ontology，GO）及代謝通路（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析，注釋到落葉松脂素生物合成途徑11個催化步驟的51個編碼基因，生物合成途經中催化酶多以基因家族的形式存在[22]。例如，菘藍中共注釋獲得19個聚合蛋白酶（IiDirs），編碼183至414不等的氨基酸殘基，具有不同的結構特征，在根、莖、葉和花中表達水平各異，且對信號分子茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate，MeJA）具有不同的響應，提示它們在菘藍木脂素生物合成中可能具有不同的作用[23]。同時，通過轉錄因子的注釋，獲得56個轉錄因子家族的906條基因，它們可能是參與菘藍木脂素類成分生物合成的關鍵調控基因，包括41個GRAS[24]、112個AP2/ERF[17]、78個bHLH[25]轉錄因子家族基因等。菘藍中木脂素類成分生物合成途徑催化酶及調控基因的詳盡注釋為進一步研究菘藍抗病毒活性成分的生物合成特征及轉錄調控機制奠定了基礎。

圖1 板藍根抗病毒活性成分化學結構式

研究者以植物激素MeJA誘導的菘藍毛狀根體系為對象，通過整合轉錄組及代謝組解析木脂素類化合物的生物合成特征與轉錄調控過程。分別運用RNA-seq和UPLC-QTOF/MS分析，對MeJA誘導后36 h內的菘藍毛狀根進行轉錄組及代謝組的整合，結果顯示MeJA可以引起菘藍細胞內轉錄及代謝兩個層面的顯著變化，且不同轉錄組和代謝物呈現(xiàn)出多樣性的變化模式。主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）清楚地反映了MeJA誘導后菘藍細胞內轉錄和代謝變化的生理過程，信號響應及相關轉錄調控發(fā)生在誘導的起始階段（0.5-1 h）；隨后代謝途徑上催化酶基因的轉錄水平上調，相應代謝物的合成被激活并一直持續(xù)到整個過程的末期；而轉錄激活對次生代謝產物的影響則需要經過一定的累積，直到整個誘導過程的后期（12-24 h）才顯現(xiàn)出來[14]。以上生理過程的闡明，為進一步篩選出關鍵的變量因子，并利用其對相關生物合成和轉錄調控網絡進行解構提供了支撐。

圖2 落葉松脂素的生物合成途徑

2 菘藍中抗病毒活性木脂素生物合成關鍵調控基因的篩選

隨著對植物次生代謝途徑及相關基因了解的逐漸深入，人們越來越深刻地認識到植物次生代謝途徑及其調控機制的復雜性，如何有效挖掘影響次生代謝產物生物合成的關鍵調控基因，快速獲得激活目標化合物生物合成的靶點，已成為生物合成研究的難點。系統(tǒng)生物學的興起和發(fā)展為解決這一難題打開了嶄新的局面，其基本思路是通過整合基因組、轉錄組、蛋白質組和代謝組的信息構建調控模型，預測并挖掘關鍵的調控靶點，實現(xiàn)遺傳操作的有的放矢、準確可靠[26]。菘藍轉錄組測序及次生代謝組測定的完成[22]為通過該思路快速挖掘菘藍中抗病毒活性木脂素生物合成關鍵調控基因創(chuàng)造了條件。

研究者對MeJA處理前后菘藍轉錄組和代謝組進行檢測，通過“轉錄本-轉錄本”、“代謝物-代謝物”以及“轉錄本-代謝物”之間動態(tài)相關性計算，構建了菘藍木脂素合成途徑的轉錄調控共表達相關性網絡，對木脂素類化合物合成途徑的關鍵調控因子及關鍵途徑基因進行預測。結果顯示，十個轉錄因子IiERF15、IiERF21、IiWRKY59、IibHLH62-2、IibHLH77、IibHLH99、IiMYB18、IiTNY、IiMYB94和IiEBP，兩個途徑基因Ii4CL3和IiDir9為調控菘藍木脂素生物合成的核心調控因子；進一步的研究顯示，抑制表達Ii4CL3顯著降低了菘藍木脂素的含量，而抑制表達Ii4CL1和Ii4CL2對木脂素含量無顯著影響，證明運用該轉錄調控預測模型篩選關鍵調控基因的準確性[14]。

將MeJA處理后不同時間點菘藍毛狀根中木脂素生物合成途徑基因的表達水平和5個木脂素成分的積累水平進行整合分析，構建“基因－化合物”關聯(lián)性網絡，共篩選出27個與菘藍木脂素合成相關的基因，其中7個（IiPAL1、Ii4CL7、IiC3H、IiDIR1、IiDIR5、IiDIR9、IiPLR1）與落葉松脂素合成呈正相關。IiPLR1s系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，抑制表達IiPLR1顯著降低了菘藍毛狀根中落葉松脂素的含量，而抑制表達IiPLR2和IiPLR3對落葉松脂素的含量積累無顯著影響，說明IiPLR1確實是IiPLR家族中唯一對落葉松脂素生物合成具有重要作用的成員，證明了該“基因－化合物”關聯(lián)性分析結果的準確性[21]。

運用典型相關分析預測112個菘藍AP2/ERF轉錄因子對木脂素類成分生物合成的影響，篩選出Ii007、Ii049、Ii050和Ii080為關鍵轉錄調控因子[17]。

通過共表達分析預測78個菘藍bHLH轉錄因子與木脂素途徑基因表達的相互關系，發(fā)現(xiàn)IibHLH20、IibHLH24、IibHLH25、IibHLH60、IibHLH93和IibHLH95與木脂素合成途徑基因存在共表達關系，提示它們可能參與菘藍木脂素的生物合成[25]。

3 菘藍中抗病毒活性木脂素的代謝調控

菘藍中抗病毒活性木脂素生物合成關鍵調控基因的篩選為通過植物次生代謝工程激活合成途徑，提高活性木脂素的含量提供了條件。

過量表達IiPLR1顯著提高了菘藍毛狀根中落葉松脂素的含量，與野生型對照（56.0 μg·g-1dw）相比，轉基因株系ovx-2和ovx-8將落葉松脂素的含量分別提高到353.9 μg·g-1和310.4 μg·g-1，是野生型的約6.3倍和5.5倍，且具有與野生型相當?shù)纳锪縖21]；過量表達IiC3H將菘藍毛狀根中落葉松脂素的含量提高了4.45倍[17]。以上研究為以菘藍毛狀根為生物反應器大規(guī)模生產活性木脂素提供了可行策略，也為通過代謝工程獲得木脂素高積累的優(yōu)質板藍根品系提供了高效的調控靶點。

4 總結與展望

現(xiàn)代分子生物學的發(fā)展，尤其是轉錄組學、代謝組學、生物信息學等多學科的交叉與融合大大推進了人們對板藍根木脂素類成分生物合成的認識。目前，板藍根木脂素成分生物合成途徑的基本框架及相關酶的研究已經取得了一定的進展。但植物次生代謝是一個受多因素調節(jié)、非常復雜的動態(tài)變化過程[27]，距離全面解析板藍根木脂素成分生物合成途徑、闡明代謝調控機制尚有很多問題懸而未決。例如，板藍根木脂素成分次生代謝受到哪些信號傳導網絡所調控？哪些轉錄因子介導其中？如何發(fā)揮作用？生物合成路徑的時空定位如何？哪些因素影響其合成、運輸及釋放？板藍根木脂素成分與初生代謝及其他次生代謝產物如何相互溝通聯(lián)系“crosstalk”構建代謝調控網絡等。

目前，關鍵酶基因的高效表達成功提高了菘藍木脂素含量，已經取得了令人興奮的研究進展。然而，相對而言，轉錄因子可以調控能被它所識別的一系列生物合成關鍵基因的表達，高效激活生物合成途徑[28]，目前已經篩選獲得的多個轉錄因子將成為更具優(yōu)勢的提高活性木脂素含量的遺傳操作靶點。隨著對板藍根木脂素成分生物合成途徑及相關基因了解的深入，更多的新技術手段和研究工具，如蛋白質工程[29]、合成生物學[30]等，將更加全面深入的整合，大幅提升板藍根抗病毒活性成分的產率，以及利用細胞工廠生產活性木脂素，使之能保障板藍根品質并實現(xiàn)品質提升將逐步實現(xiàn)。

1 國家藥典委員會編. 中華人民共和國藥典(2015版）. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社, 2015：205.

2 Lin C W, Tsai F J, Tsai C H, et al. Anti-SARS coronavirus 3C-like protease effects of Isatis indigotica root and plant-derived phenolic compounds. Antivir Res, 2005, 68(1)：36-42.

3 孫惠惠. H1N1小鼠模型的建立及板藍根顆粒對H1N1模型小鼠的作用的研究. 北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學碩士學位論文,2010.

4 Wang Y T, Yang Z F, Zhan H S, et al. Screening of anti-H1N1 active constituents from Radix Isatidis. Int J Mol SCI, 2011,4：419-422.

5 李彬. 板藍根活性成分及品質評價. 上海：第二軍醫(yī)大學博士學位論文, 2003.

6 Li J, Zhou B, Li C, et al. Lariciresinol-4-O-β-D-glucopyranoside from the root of Isatis indigotica Influenza A virus-induced pro-Inflammatory response. J Ethnopharmacol, 2015, 174：379-386.

7 Yang Z, Wang Y, Zheng Z, et al. Antiviral activity of Isatis indigotica root-derived clemastanin B against human and avian influenza A and B viruses in vitro. Int J Mol Med, 2013, 31(4)：867-73.

8 Humphreys J M, Chapple C. Rewriting the lignin roadmap. Curr Opin Plant Biol, 2002, 5(3)：224-9.

9 Nakatsubo T, Mizutani M, Suzuki S, et al. Characterization of Arabidopsis thaliana pinoresinol reductase, a new type of enzyme involved in lignan biosynthesis. J Biol Chem. 2008, 283(23)：15550–15557.

10 Satake H, Ono E, Murata J. Recent advances in the metabolic engineering of lignan biosynthesis pathways for the production of transgenic plant-based foods and supplements. J Agric Food Chem, 2013, 61(48)：11721-11729.

11 Lu B B, Du Z, Ding R X, et al. Cloning and characterization of a differentially expressed phenylalanine ammonialyase gene (IiPAL) after genome duplication from tetraploid Isatis indigotica Fort.. J Intiegr Plant Biol, 2006, 48 (12)：1439-1449.

12 胡永勝,張磊,陳萬生.菘藍中肉桂酸-4-羥基化酶基因克隆與表達分析.中草藥, 2015, 46(1)：101-106.

13 Di P, Hu Y S, Xuan H J, et al. Characterization and the expression profile of 4-coumarate： CoA ligase (Ii4CL) from hairy roots of Isatis indigotica. Afr J Pharm Pharnac, 2012, 6(28)：2166-2175.

14 Zhang L, Chen J F, Zhou X, et al. Dynamic metabolic and transcriptomic profiling of methyl jasmonate-treated hairy roots reveals synthetic characters and regulators of lignan biosynthesis in Isatis indigotica Fort.. Plant Biotechnol J, 2016, 14(12)：2217-2227.

15 周洵. 菘藍中4-香豆酰輔酶A連接酶家族的功能研究. 上海：第二軍醫(yī)大學碩士學位論文, 2013.

16 宣洪嬌. 菘藍木脂素生源合成途徑五個關鍵酶基因的功能研究.佳木斯：佳木斯大學碩士學位論文, 2012.

17 Chen R B, Li Q, Tan H X, et al. Gene-to-metabolite network for biosynthesis of lignans in MeJA-elicited Isatis indigotica hairy root cultures. Front Plant Sci, 2015,6：952.

18 陸倍倍. 四倍體菘藍中優(yōu)良品質相關基因的克隆及研究. 上海：第二軍醫(yī)大學碩士學位論文, 2006.

19 Hu Y S, Di P, Chen J F, et al. Isolation and characterization of a gene encoding cinnamoyl-CoA reductase from Isatis indigotica Fort.. Mol Biol Rep, 2011, 38：2075-2083.

20 胡永勝. 菘藍中木脂素生源合成途徑五個重要酶基因的克隆與功能分析.上海：第二軍醫(yī)大學碩士學位論文,2010.

21 Xiao Y, Ji Q, Gao S H, et al. Combined transcriptome and metabolite profiling reveals that IiPLR1 plays an important role in lariciresinol accumulation in Isatis indigotica. J Exp Bot, 2015, 66：6259-6271.

22 Chen J F, Dong X, Li Q, et al. Biosynthesis of the active compounds of Isatis indigotica based on transcriptome sequencing and metabolites proling. BMC Genomics, 2013, 14：857.

23 Li Q, Chen J F, Xiao Y, et al. The dirigent multigene family in Isatis indigotica： gene discovery and differential transcript abundance. BMC Genomics, 2014,15：388-401.

24 Zhang L, Li Q, Chen J F, et al. Computational identification and systematic classification of novel GRAS genes in Isatis indigotica. Chin J Nat Med, 2016, 14(3)：161-176.

25 Zhang L, Chen J F, Li Q, et al. Transcriptome-wide analysis of basic helix-loop-helix transcription factors in Isatis indigotica and their methyl jasmonate responsive expression profiling. Gene, 2015, 576(1)：150-159.

26 Farré G, Twyman R M, Christou P, et al. Knowledge-driven approaches for engineering complex metabolic pathways in plants. Curr Opin Biotech, 2015, 32：54-60.

27 Tatsis E C, O’Connor S E. New developments in engineering plant metabolic pathways. Curr Opin Biotech, 2016, 42：126-132.

28 Zhou M, Memelink J. Jasmonate-responsive transcription factors regulating plant secondary metabolism. Biotechnol Adv, 2016, 34(4)：441-449.

29 Chen Z, Zeng A P. Protein engineering approaches to chemical biotechnology. Curr Opin Biotech, 2016, 42：198-205.

30 Cloney R. Synthetic biology： Automating genetic circuit design. Nat Rev Genet, 2016, 17(6)：314-315.

Advances in Biosynthesis of Antiviral Active Components of Isatidis Radix

Xiao Ying1, Ma Ruifang1, Chen Junfeng1, Yang Yingbo3, Zhang Lei2, Chen Wansheng1
(1.Department of Pharmacy, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China; 2. School of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China; 3. Institute of Chinese Materia Medica, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China)

Isatidis Radix, the root of Isatis indigotica Fort. (Cruciferae), is a representitive herb widely used for clearing away heat-toxin in traditional Chinese medicine (TCM). Lariciresinol is a representitive component of lignans and an important efficacious substance with the antiviral effect. This review elucidated the progress on its biosynthetic pathways, the screening of key regulatory genes and metabolic engineering of lignans components in Isatidis Radix, providing a favorable reference for the full understanding of biosynthesis of antiviral active components, the quality improvement of Isatidis Radix and the sustainable utilization of TCM resources.

Isatidis Radix, Isatis indigotica Fort. (Cruciferae), antiviral activity, lignan, biosynthesis

10.11842/wst.2016.11.012

R931.6

A

（責任編輯：馬雅靜，責任譯審：朱黎婷）

2016-10-27

修回日期：2016-11-14

＊ 國家自然科學基金委國家杰出青年科學基金項目（81325024）：中藥藥效物質，負責人：陳萬生；國家自然科學基金面上項目（31670292）：茉莉酸響應的AP2/ERF轉錄因子對菘藍木脂素生物合成的調控作用及其分子機制研究。負責人：張磊；國家自然科學基金青年基金項目（31100221）：四倍體菘藍聚合蛋白酶與松脂醇還原酶的功能及特征研究，負責人：肖瑩；國家自然科學基金面上項目（81673550）：丹參根系形態(tài)、結構特征與有效成分積累的關聯(lián)性及形成機制研究，負責人：陳軍峰。

＊＊ 通訊作者：陳萬生，本刊編委，教授，博士生導師，主要研究方向：中藥藥效物質和品質調控研究；張磊，副教授，碩士生導師，主要研究方向：中藥天然產物生物合成與代謝調控研究。