ELL基因在前列腺癌組織中的表達(dá)及其意義

劉凌琪 吳天鵬 錢輝軍 楊嗣星 艾軍魁 王洲

·臨床研究·

ELL基因在前列腺癌組織中的表達(dá)及其意義

劉凌琪 吳天鵬 錢輝軍 楊嗣星 艾軍魁 王洲

目的分析ELL基因在人類前列腺癌組織中的表達(dá)情況，探討其在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。方法收集45例前列腺癌組織、15例良性前列腺增生組織和15例正常前列腺組織，提取總RNA，應(yīng)用qRT-PCR檢測ELL mRNA的表達(dá)情況，分析其與前列腺癌分級的關(guān)系。結(jié)果前列腺癌組織中ELL mRNA的表達(dá)量明顯低于良性前列腺增生組織和正常前列腺組織(P<0.05)，而良性前列腺增生組織與正常前列腺組織間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著前列腺癌Gleason評分的升高，ELL mRNA的表達(dá)呈下降趨勢(P<0.05)。結(jié)論ELL基因在前列腺癌組織中呈低表達(dá)，其表達(dá)與前列腺癌的分級密切相關(guān)，提示其可能在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

ELL基因； 前列腺癌； qRT-PCR

前列腺癌是老年男性常見的惡性腫瘤。在美國男性中，前列腺癌是最常見的惡性腫瘤，也是引起腫瘤相關(guān)死亡的第二位最常見原因[1]。隨著我國人口老年化，前列腺癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢。目前，對前列腺癌的治療策略包括根治性前列腺切除術(shù)、冷凍手術(shù)、體外放射治療、近距離放射治療、化學(xué)治療和激素治療等[2-3]，盡管大多數(shù)治療效果顯著，但對激素非依賴性前列腺癌的治療仍是難點(diǎn)。

人類ELL(eleven-nineteen lysine-rich leukemia)基因最早定位于染色體19p13.1。在多種白血病中,ELL基因常常與定位于染色體11q23 上的混合系白血病基因(mixed lineage leukemia，MLL)發(fā)生染色體易位[4]。研究發(fā)現(xiàn)，ELL基因在調(diào)節(jié)動物發(fā)育和腫瘤生成中具有重要作用[5]。但是，對于ELL基因在前列腺癌中的表達(dá)情況，以及其與前列腺癌惡性程度的關(guān)系等國內(nèi)外尚無相關(guān)報(bào)道。為了更好了解ELL基因在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，我們采用qRT-PCR分析ELL基因在前列腺癌組織、良性前列腺增生組織及正常前列腺組織中的表達(dá)情況，以探討其與前列腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

對象與方法

一、一般資料

2010年7月至2014年3月于我院泌尿外科收集前列腺癌組織45例，良性前列腺增生組織15例，全膀胱切除術(shù)中的正常前列腺組織15例，以良性前列腺增生組織和正常前列腺組織作為對照。所有標(biāo)本在術(shù)中取得后置入準(zhǔn)備好的液氮中速凍10 min，然后于-70 ℃冰箱保存。所有標(biāo)本均得到病理學(xué)證實(shí)。前列腺癌患者的中位年齡為68歲。Gleason評分：<7分20例；=7分18例；>7分7例。

二、試劑與儀器

RNA提取使用RNeasy Mini Kit試劑盒，購自Qiagen公司。反轉(zhuǎn)錄生成cDNA模板使用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit試劑盒，購自Applied Biosystems公司。利用Omiga 2.0軟件設(shè)計(jì)特異性ELL和18S引物，PCR反應(yīng)全部引物由北京奧科公司合成。Real-time PCR使用SYBR Green PCR Master Mix Kit試劑盒，購自Invitrogen公司。PCR儀器為Applied Biosystems 公司的ABI Step-One Plus thermocycler。

三、方法

前列腺癌組織、良性前列腺增生組織和正常前列腺組織(各100 mg)分別按照RNeasy Mini Kit試劑盒說明書的操作步驟提取總RNA。使用分光光度計(jì)檢測RNA濃度；應(yīng)用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit試劑盒，按照說明書操作進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，生成cDNA模板；以基因的cDNA序列為模板利用Omiga 2.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物；應(yīng)用SYBR Green PCR Master Mix Kit試劑盒，按照說明書操作，在ABI Step-One Plus thermocycler上進(jìn)行反應(yīng)；使用R=2[Cp sample-Cp control]的公式，以18S為內(nèi)參照，對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為無菌去離子H2O 3.2 μl，10×RT Buffer 2.0 μl，25×dNTP Mix(各2.5 mmol/L) 0.8 μl，10×RT Random Primers 2.0 μl，Reverse Transcriptase 1.0 μl，RNase Inhibitor 1.0 μl，RNA 10.0 μl(含5 μg RNA)。反應(yīng)條件為25 ℃ 10 min，37 ℃ 120 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 保存。qRT-PCR引物:ELL引物為5′-ACTGCATCCAGCAGTATGTCTCCA-3′和5′-TCCGAAACTGAACCTTCTTGCCCA-3′;18S引物為5′-CATTCGTATTGCGCCGCT-3′和5′-CGACGGTATCTGATCGTC-3′。qRT-PCR反應(yīng)體系為無菌去離子H2O 5.6 μl，2×PCR mix 10.0 μl，cDNA 2.0 μl，Primers(10μmol/L) 2.0 μl，Rox 0.4 μl。反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min，94 ℃ 30 min，50 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s,進(jìn)入第2步，重復(fù)32個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

ABI 7500熒光定量PCR儀檢測結(jié)果由ABI 7500 Prism software 系統(tǒng)進(jìn)行分析后導(dǎo)入SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，組間進(jìn)行方差分析，方差分析后的兩兩比較采用Post-hoc方法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、ELL基因在前列腺癌組織、良性前列腺增生組織和正常前列腺組織中的表達(dá)

qRT-PCR檢測45例前列腺癌組織、15例正常前列腺組織和15例良性前列腺增生組織中ELL mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示前列腺癌組織中ELL的相對表達(dá)量為0.74±0.11，正常前列腺組織為1.51±0.28，良性前列腺增生組織為1.41±0.34。One-way方差分析結(jié)果為F=104.74(P<0.05)，提示3組間ELL mRNA的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Post-hoc比較顯示前列腺癌組織與正常前列腺組織間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明與正常前列腺組織相比，ELL基因在前列腺癌中呈低表達(dá);前列腺癌組織與良性前列腺增生組織間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明與良性病變相比，ELL基因在腫瘤性病變中呈低表達(dá)；與正常前列腺組織相比，良性前列腺增生組織中ELL基因的表達(dá)并無顯著性變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明良性病變不影響ELL基因的表達(dá)。

二、前列腺癌組織中ELL基因表達(dá)與Gleason評分的關(guān)系

根據(jù)Gleason評分不同，將前列腺癌標(biāo)本分為3組，其中<7分的20例，ELL的相對表達(dá)量為0.85±0.04；=7分的18例，ELL的相對表達(dá)量為0.69±0.04；>7分的7例，ELL的相對表達(dá)量為0.58±0.02(表1)。One-way方差分析結(jié)果為F=140.92(P<0.05)，提示三者之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著Gleason評分的增加，ELL基因的表達(dá)呈下降趨勢，提示ELL基因的表達(dá)與前列腺癌組織的分化程度相關(guān)。

三、前列腺癌組織中ELL基因表達(dá)與PSA的關(guān)系

根據(jù)PSA水平不同，將前列腺癌標(biāo)本分為3組，其中<10 μg/L的23例，ELL的相對表達(dá)量為0.84±0.04；10～20 μg/L的14例，ELL的相對表達(dá)量為0.68±0.02；>20 μg/L的8例，ELL的相對表達(dá)量為0.59±0.02(表1)。三者之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=175.49，P<0.05)。隨著PSA水平的增高，ELL基因的表達(dá)呈下降趨勢，說明ELL基因表達(dá)與PSA水平呈負(fù)相關(guān)。

四、前列腺癌組織中ELL基因表達(dá)與前列腺癌危險(xiǎn)因素的關(guān)系

根據(jù)我國前列腺癌診療指南，將前列腺癌危險(xiǎn)因素等級分為低危、中危、高位。其中低危的18例，ELL的相對表達(dá)量為0.84±0.04；中危的18例，ELL的相對表達(dá)量為0.68±0.02；高危的9例，ELL的相對表達(dá)量為0.59±0.03(表1)。三者之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=125.18，P<0.05)。隨著腫瘤危險(xiǎn)性的增加，ELL基因表達(dá)下降，表明ELL基因的表達(dá)與前列腺癌的危險(xiǎn)性呈負(fù)相關(guān)。

表1 前列腺癌組織中ELL mRNA相對表達(dá)量與Gleason評分、PSA和前列腺癌危險(xiǎn)因素的關(guān)系

討 論

ELL基因的組織表達(dá)譜相當(dāng)廣泛，其在骨骼肌、胎盤、睪丸和外周血白細(xì)胞中有較高表達(dá)。在造血細(xì)胞中，T細(xì)胞、B細(xì)胞和骨髓細(xì)胞系都存在ELL基因表達(dá)。ELL基因家族有3個(gè)成員，分別是ELL、ELL2、ELL3，均為真核生物RNA Pol Ⅱ轉(zhuǎn)錄延伸因子，功能研究發(fā)現(xiàn)通過抑制DNA啟動子依賴和非依賴模板上多位點(diǎn)的短暫中止，ELL能增強(qiáng)Pol Ⅱ轉(zhuǎn)錄延伸的催化率[6]。同時(shí)，在轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物形成期間，ELL基因通過直接與多聚酶結(jié)合從而打斷該酶與TBP和TFIIB在啟動子區(qū)的固有結(jié)合，發(fā)揮抑制轉(zhuǎn)錄起始的作用[6]。ELL基因是胚胎發(fā)育過程中至關(guān)重要的延伸因子，因?yàn)镋LL基因敲除的小鼠都發(fā)生了胚胎性死亡[7]。ELL基因能抑制細(xì)胞生長和誘導(dǎo)凋亡[5]。ELL基因可以作為協(xié)同調(diào)節(jié)者選擇性調(diào)節(jié)甾體激素受體的功能。ELL基因能顯著抑制人類鹽皮質(zhì)激素受體和糖皮質(zhì)激素受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性，對雄激素受體和孕酮受體卻沒有影響[8]。

我們前期的研究發(fā)現(xiàn)EAF2/U19能抑制前列腺癌的生長，而U19誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞生長的作用是通過其與ELL結(jié)合的區(qū)域來實(shí)現(xiàn)的[9]。在慢病毒轉(zhuǎn)染穩(wěn)定高表達(dá)ELL的PC-3細(xì)胞系中，ELL基因能抑制細(xì)胞生長，并抑制細(xì)胞的克隆形成，其潛在的機(jī)制可能是通過抑制HIF-1α信號通路，進(jìn)而抑制血管生成[10]。后續(xù)研究又發(fā)現(xiàn)ELL基因可以作為轉(zhuǎn)錄因子直接誘導(dǎo)TSP-1 (thrombospondin-1)基因的轉(zhuǎn)錄，ELL基因能在體內(nèi)調(diào)節(jié)TSP-1 mRNA 表達(dá)，并能抑制血管生成[11]。這些研究表明，ELL-EAF2信號通路與血管生成信號通路之間可能存在交互作用。

目前，對于ELL基因的研究主要集中在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)研究的層面，鑒于我們前期研究發(fā)現(xiàn)ELL基因的體內(nèi)外抑制腫瘤細(xì)胞生長的現(xiàn)象，本研究通過qRT-PCR技術(shù)對前列腺癌臨床標(biāo)本的ELL基因表達(dá)量進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織中ELL mRNA的表達(dá)量顯著低于正常前列腺組織和良性前列腺增生組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而正常前列腺組織和良性前列腺增生組織之間無顯著性差異。這說明前列腺癌可顯著降低ELL基因的表達(dá)，而良性病變并不改變ELL基因的表達(dá)，也可能是因?yàn)镋LL基因表達(dá)降低，從而誘發(fā)了惡性病變。分化程度高的前列腺癌組織中ELL mRNA表達(dá)較高，而分化程度低的前列腺癌組織中ELL mRNA 表達(dá)量較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明ELL基因可能起到促進(jìn)前列腺癌腫瘤細(xì)胞分化成熟的作用。同時(shí)，從本研究可以看出，ELL基因的表達(dá)與患者PSA呈負(fù)相關(guān)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ELL基因表達(dá)與前列腺癌的危險(xiǎn)因素也存在負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明ELL基因的表達(dá)缺失可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動能力增強(qiáng)和失去生長抑制，從而引起前列腺癌的發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移。因此，我們推測ELL基因在前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展過程中可能起到抑制作用。

對于ELL基因的研究，目前處于試驗(yàn)階段，尚無FDA批準(zhǔn)的試劑盒。本研究延續(xù)前期結(jié)果，進(jìn)一步探討ELL基因在前列腺癌標(biāo)本中的表達(dá)情況，證實(shí)了ELL基因在前列腺癌發(fā)生和發(fā)展過程中的負(fù)性調(diào)控作用，可為ELL基因作為前列腺癌臨床分子治療靶點(diǎn)和預(yù)測前列腺癌預(yù)后復(fù)發(fā)等提供堅(jiān)實(shí)的研究基礎(chǔ)。

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(本文編輯：徐漢玲)

Expression of ELL and its significance in prostatic carcinoma

LIULing-qi*,WUTian-peng,QIANHui-jun,YANGSi-xing,AIJun-kui,WANGZhou.

*DepartmentofUrology,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,ChinaCorrespondingauthor：LIULing-qi,E-mail:llqfly@163.com

Objective To investigate the expression of ELL in human prostatic carcinoma. Methods Samples of prostatic carcinoma tissues, samples of BPH tissues and samples of normal prostate tissues were collected. The ELL mRNA level was detected by qRT-PCR. Results The ELL mRNA level in prostatic carcinoma tissues was significantly lower than in BPH tissues and in normal prostate tissues. However, there was no difference between in BPH tissues and in normal prostate tissues. There was a decreasing trend of ELL mRNA level during the increasing Gleason scores in prostatic carcinoma. Conclusions ELL has low expression in prostatic carcinoma tissue, and it was closely related to the grade of prostatic carcinoma, which indicates ELL may play an important role in the development and progression of prostatic carcinoma.

ELL gene； Prostate cancer； qRT-PCR

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目青年項(xiàng)目(81101948)

430060 武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿外科(劉凌琪、吳天鵬、錢輝軍、楊嗣星)；美國匹茲堡大學(xué)泌尿系(艾軍魁、王洲)

劉凌琪,E-mail:llqfly@163.com

10.3870/j.issn.1674-4624.2016.05.009

2016-01-09)