對順鉑耐藥的骨肉瘤細(xì)胞干細(xì)胞特性變化及其與Notch信號通路的關(guān)系

李提，方碩，余鈴，楊儉，郭衛(wèi)春

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢430060)

·論著·

對順鉑耐藥的骨肉瘤細(xì)胞干細(xì)胞特性變化及其與Notch信號通路的關(guān)系

李提，方碩，余鈴，楊儉，郭衛(wèi)春

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢430060)

目的 探討對順鉑耐藥的骨肉瘤細(xì)胞干細(xì)胞特性變化及其與Notch信號通路的關(guān)系。方法取對數(shù)生長期的對順鉑耐藥的人骨肉瘤143B-TK細(xì)胞作為觀察組，以未經(jīng)順鉑作用的人骨肉瘤143B-TK細(xì)胞作為對照組。采用實(shí)時熒光定量PCR法檢測兩組干細(xì)胞相關(guān)基因(TERT、Sox2、Oct4、NANOG)、Notch信號通路相關(guān)基因(HeyL、Hey2、Hey1、Hes5、Hes1)mRNA相對表達(dá)量；兩組加入或不加入Notch信號通路特異性抑制劑DAPT，采用懸浮克隆球試驗檢測成球能力(以懸浮克隆球數(shù)量表示)。結(jié)果兩組NANOG、Hey2 mRNA相對表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。觀察組TERT、 Sox2、Oct4、HeyL、Hey1、Hes5、Hes1 mRNA相對表達(dá)量均高于對照組(P<0.05或<0.01)。不加入DAPT的觀察組懸浮克隆球數(shù)量明顯多于加入DAPT的觀察組和不加入DAPT的對照組(P均<0.01)。結(jié)論對順鉑耐藥的骨肉瘤細(xì)胞干細(xì)胞特性增強(qiáng)；Notch信號通路激活可能是導(dǎo)致其干細(xì)胞特性增強(qiáng)和細(xì)胞耐藥的主要原因。

骨肉瘤；順鉑耐藥；腫瘤干細(xì)胞；Notch信號通路

順鉑是骨肉瘤患者的常用化療藥物，具有廣譜的抗腫瘤活性，能夠在DNA鏈內(nèi)交聯(lián)相鄰嘌呤，抑制轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[1，2]。大多數(shù)骨肉瘤患者在順鉑化療初期效果較好，但部分患者最終因獲得性耐藥導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，而順鉑耐藥的潛在機(jī)制目前仍不清楚。Notch信號通路是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖、分化和凋亡的保守信號系統(tǒng)，包括4個受體(Notch 1～4)和五個結(jié)構(gòu)相似的配體(jagged 1、jagged 2、delta-like 1和 delta-like 1、3 或4)[3]。當(dāng)Notch受體與配體結(jié)合，γ-分泌酶復(fù)合物將切割Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NICD)，調(diào)節(jié)下游靶基因如Hes1、Hes5、HeyL、Hey1和Hey2的表達(dá)。Notch信號通路失調(diào)可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化[4，5]。但其在骨肉瘤惡性發(fā)展和順鉑耐藥中的作用尚不明確。2015年6月～2016年4月，本研究觀察了對順鉑耐藥的骨肉瘤細(xì)胞干細(xì)胞特性變化，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其與Notch信號通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：人骨肉瘤143B-TK細(xì)胞購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。試劑及儀器：cell counting kit-8 (CCK-8)購于中國生化試劑有限公司，細(xì)胞計數(shù)試劑盒購于武漢谷歌生物技術(shù)有限公司，實(shí)時熒光定量PCR試劑盒購于美國Thermo公司，表皮細(xì)胞生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子購于美國Prospec公司，Notch信號通路特異性抑制劑DAPT購于美國Abcam公司。

1.2 對順鉑耐藥的骨肉瘤細(xì)胞篩選及鑒定

1.2.1 細(xì)胞篩選 取對數(shù)生長期骨肉瘤細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，取2×105個細(xì)胞接種于12孔板，共接種30孔。普通培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，加入亞致死劑量為4 μmol/L的順鉑，24 h后PBS沖洗，采用普通培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。每24 h取3孔進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，連續(xù)計數(shù)10天。繪制細(xì)胞生長曲線，結(jié)果顯示，骨肉瘤細(xì)胞經(jīng)4 μmol/L順鉑處理后，細(xì)胞數(shù)量先增加后降低，于處理后第6天開始恢復(fù)生長(此時作為生長拐點(diǎn))。見圖1。

圖1 骨肉瘤細(xì)胞經(jīng)4 μmol/L順鉑處理后的生長曲線

1.2.2 細(xì)胞鑒定 采用CCK-8法。收集1.2.1中生長拐點(diǎn)處的骨肉瘤細(xì)胞(觀察組)和未經(jīng)順鉑處理過的人骨肉瘤143B-TK細(xì)胞(對照組)，制成細(xì)胞懸液，用PBS調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個/mL。將兩組細(xì)胞接種于96孔板中，每孔200 μL，培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后分別加入終濃度為0、2、4、6、8、10、12、14、16 μmol/L的順鉑，均設(shè)置3個復(fù)孔。普通培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，每孔加入90 μL普通培養(yǎng)基及10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h。采用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的光密度值(OD值)，計算細(xì)胞增殖抑制率，同時計算兩組順鉑的半數(shù)抑制濃度(IC50)。結(jié)果顯示，隨著加入順鉑濃度的升高，兩組細(xì)胞增殖抑制率均呈升高趨勢；與加入相同濃度順鉑作用后的對照組比較，觀察組細(xì)胞增殖抑制率均降低(P均<0.01)；見表1。觀察組對順鉑的IC50為14.85 μmol/L，明顯高于對照組的8.10 μmol/L(P<0.05)。見圖2。證實(shí)觀察組為順鉑耐藥細(xì)胞。

表1 兩組經(jīng)不同濃度順鉑作用后的細(xì)胞增殖抑制率比較

注：與對照組同濃度比較，*P<0.01。

1.3 對順鉑耐藥的骨肉瘤細(xì)胞干細(xì)胞特性及Notch信號通路觀察

1.3.1 懸浮克隆球形成能力 采用懸浮克隆球試驗。取對數(shù)生長期的兩組細(xì)胞，按照1 000個/孔接種于6孔板中。兩組分別加入或不加入終濃度為20 μmol/L的DAPT，采用含20 μg/L表皮生長因子、20 μg/L成纖維生長因子的RPMI 1640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，每隔3天均添加10 μg/L重組表皮生長因子和10 μg/L重組成纖維生長因子。培養(yǎng)2周后，在100倍倒置顯微鏡下對懸浮克隆球數(shù)目進(jìn)行計數(shù)，以細(xì)胞團(tuán)直徑>50 μm定義為成球。

1.3.2 干細(xì)胞特性及Notch信號通路相關(guān)基因mRNA表達(dá) 采用實(shí)時熒光定量PCR法。收集兩組細(xì)胞，參照試劑盒說明提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。PCR反應(yīng)體系：2×qPCR Mix 12.5 μL，7.5 μmmol/L基因引物2.0 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.5 μL，ddH2O 8.0 μL。干細(xì)胞相關(guān)基因(Oct4、TERT、Sox2、NANOG)、Notch信號通路相關(guān)基因(HeyL、Hey2、Hey1、Hes5、Hes1) 及內(nèi)參基因(β-actin) 引物序列見表2。 PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60 ℃退火60 s，60 ℃延伸5 min，循環(huán)40次。實(shí)驗重復(fù)3次。以2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達(dá)量。

圖2 兩組經(jīng)不同濃度順鉑處理后的細(xì)胞增殖抑制率

表2 骨肉瘤細(xì)胞干細(xì)胞、Notch信號通路相關(guān)基因及內(nèi)參基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 兩組干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)比較 兩組NANOG mRNA相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。觀察組Oct4、TERT、Sox2 mRNA相對表達(dá)量均高于對照組(P<0.05或<0.01)。見表3。

表3 兩組干細(xì)胞相關(guān)基因相對表達(dá)量比較

注：與對照組比較，*P<0.05，#P<0.01。

2.2 兩組懸浮克隆球形成能力比較 觀察組加入或不加入DAPT的懸浮克隆球數(shù)量分別為(84.33±6.11)、(121.67±4.04)個，二者比較P<0.01；對照組加入或不加入DAPT的懸浮克隆球數(shù)量分別為(77.67±5.13)、(78.33±5.51)個，二者比較P>0.05；不加入DAPT的觀察組和對照組懸浮克隆球數(shù)量比較P<0.01。

2.3 兩組Notch信號通路相關(guān)基因表達(dá)比較 兩組Hey2 mRNA相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。觀察組HeyL、Hey1、Hes5、Hes1 mRNA相對表達(dá)量均高于對照組(P<0.05或<0.01)。見表4。

表4 兩組Notch信號通路相關(guān)基因相對表達(dá)量比較

注：與對照組比較，*P<0.05，#P<0.01。

3 討論

目前骨肉瘤的首選治療方案是手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)前、術(shù)后化療，化療能夠殺滅大部分腫瘤細(xì)胞，可降低復(fù)發(fā)率，提高患者的5年生存率。但腫瘤干細(xì)胞可在化療過程中存活，并導(dǎo)致化療耐藥和腫瘤復(fù)發(fā)[6]。目前骨肉瘤患者對順鉑耐藥的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚未完全闡明。本研究將骨肉瘤細(xì)胞短時間暴露于亞致死劑量的順鉑，結(jié)果顯示細(xì)胞數(shù)量先增加，可能與順鉑濃度較低、細(xì)胞凋亡速度較慢有關(guān)；隨后細(xì)胞增殖受到抑制，敏感細(xì)胞大量死亡，耐藥細(xì)胞富集，并于第6天開始恢復(fù)生長。說明細(xì)胞增殖短時間受到抑制，然后在生長中恢復(fù)，并顯示出對順鉑敏感性的降低。本研究觀察組和對照組對順鉑的IC50分別為14.85、8.10 μmol/L，證實(shí)觀察組為順鉑耐藥細(xì)胞。

腫瘤干細(xì)胞是腫瘤中具有自我更新能力的細(xì)胞亞群，是腫瘤發(fā)展和發(fā)生化療耐藥的主要原因[7～9]。目前證實(shí)骨肉瘤干細(xì)胞的方法包括懸浮球培養(yǎng)法、流式標(biāo)記分選法及胚胎干細(xì)胞相關(guān)基因鑒定[10]。Oct4、TERT、Sox2、NANOG均為干細(xì)胞相關(guān)基因，其中Oct4、Sox2、NANOG與細(xì)胞的分化有關(guān)，TERT與端粒的修復(fù)與延長相關(guān)，Oct4還可用于骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞的篩選。本研究結(jié)果顯示，觀察組TERT、Sox2、Oct4 mRNA相對表達(dá)量均明顯高于對照組，表明順鉑耐藥細(xì)胞的干細(xì)胞特性增加。懸浮球培養(yǎng)法為鑒定干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)之一，本研究觀察組懸浮克隆球數(shù)量明顯多于對照組，表明觀察組干細(xì)胞特性增強(qiáng)。

研究表明，Notch信號通路可能參與順鉑篩選骨肉瘤干細(xì)胞的過程[11]。Notch是一個高度保守的信號通路，參與組織平衡的維護(hù)，能夠調(diào)節(jié)正常干細(xì)胞的自我更新及生存與凋亡。骨肉瘤耐藥細(xì)胞中Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域過度表達(dá)，骨肉瘤的發(fā)展可能與Notch信號通路失調(diào)有關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示，觀察組HeyL、Hey1、Hes5、Hes1 mRNA相對表達(dá)量均高于對照組，表明順鉑耐藥細(xì)胞的Notch信號通路被激活。研究表明，Notch信號通路表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致人類乳腺癌細(xì)胞對阿霉素和多西他賽的敏感性增加[13]，STAT3和Notch通路抑制劑可降低頸部鱗狀細(xì)胞癌對順鉑的耐藥性[14]。DAPT是常用的Notch信號通路特異性抑制劑。本研究結(jié)果顯示，觀察組加入DAPT后懸浮克隆球數(shù)量明顯減少；表明耐藥細(xì)胞的Notch信號通路被DAPT阻斷時，其干細(xì)胞特性降低，間接證實(shí)Notch信號通路參與腫瘤的化療耐藥。與Wang等[15]研究結(jié)論一致。

綜上所述，對順鉑耐藥的骨肉瘤細(xì)胞干細(xì)胞特性增強(qiáng)，Notch信號通路的激活可能是導(dǎo)致其干細(xì)胞特性增強(qiáng)和細(xì)胞耐藥的相關(guān)機(jī)制。阻斷Notch信號通路可以靶向抑制骨肉瘤干細(xì)胞特性，從而降低細(xì)胞耐藥性。

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Changes of stem cell properties in cisplatin-resistant osteosarcoma cells and its relationship with Notch signaling pathway

LITi,FANGShuo,YULing,YANGJian,GUOWeichun

(RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China)

Objective To investigate the characteristics of cisplatin-resistant osteosarcoma stem cells and its relationship with Notch signaling pathway. Methods The cisplatin-resistant human osteosarcoma 143B-TK cells in the logarithmic growth phase (observation group) were selected, and 143B-TK cells without the treatment of cisplatin were taken as the control group. Real-time quantitative PCR was used to detect the expression of the stem cells-related genes (TERT, Sox2, Oct4 and NANOG), and the Notch signaling pathway-related genes (HeyL, Hey2, Hey1, Hes5, and Hes1) in the two groups. Cell forming ability was detected by the formation of sphere number in the two groups with or without adding DAPT. Results No significant difference was found in the relative expression of NANOG and Hey2 between the two groups (allP>0.05). The relative expression of TERT, Sox2, Oct4, HeyL, Hey1, Hes5, and Hes1 in the observation group was higher than that in the control group (P<0.05 orP<0.01). The sphere formation number in the observation group without adding DAPT was more than that in the observation group with adding DAPT and that in the control group without adding DAPT (allP<0.01). Conclusion The stem cell properties of cisplatin-resistant osteosarcoma cells enhance, and the activation of Notch signaling pathway may be main reason for the enhancement of stem cell properties and drug resistance.

osteosarcoma; chemotherapy resistance; cancer stem cells; Notch signaling pathway

國家自然科學(xué)基金資助項目(81341078)。

李提(1987-)，男，碩士在讀，研究方向為骨肉瘤的臨床與基礎(chǔ)。E-mail： liti2010q@sina.com

郭衛(wèi)春(1970-)，男，主任醫(yī)師，研究方向為骨肉瘤的臨床與基礎(chǔ)。E-mail： guoweichun@aliyun.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.48.001

R738.1

A

1002-266X(2016)48-0001-04

2016-05-31)