免疫化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫吸附法測定25羥維生素D在常見甲狀腺相關(guān)疾病診斷中的應(yīng)用價值

張晶晶，湯俊明，吳黎明，黃 鶯，馮斯依，陳 翔

·臨床經(jīng)驗·

免疫化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫吸附法測定25羥維生素D在常見甲狀腺相關(guān)疾病診斷中的應(yīng)用價值

張晶晶1，湯俊明1，吳黎明1，黃 鶯1，馮斯依1，陳 翔2

目的 采用免疫化學(xué)發(fā)光法(CLIA)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測25羥維生素D[25(OH)D3]在常見甲狀腺相關(guān)疾病患者外周血中的表達水平，并對兩種檢測方法的結(jié)果進行比較。方法 應(yīng)用CLIA及ELISA法同時測定97例健康人群(NC組)、57例Graves病(GD組)、69例橋本甲狀腺炎(HT組)及73例亞急性甲狀腺炎(SAT組)患者血清中的25(OH)D3水平，同時檢測四組人群中的血鈣、血磷水平及甲狀腺功能相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果 CLIA法及ELISA法檢測結(jié)果均顯示，四組甲狀腺相關(guān)疾病患者血清間25(OH)D3水平差異存在統(tǒng)計學(xué)意義，兩兩組間比較示NC組血清中25(OH)D3的水平最高(63.46±17.28 ELISA法及57.28±16.36 CLIA法,P<0.05)，GD組大于HT、SAT組(47.26±13.63 ELISA法及46.86±11.64 CLIA法,P<0.05)。ELISA法檢測的25(OH)D3值高于CLIA法，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。GD及HT組中，25(OH)D3與血清游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)及游離甲狀腺素(FT4)存在正相關(guān)性與促甲狀腺激素(TSH)及抗甲狀腺過氧化物酶體(TPOAb)存在負性相關(guān)，而NC組及SAT組中25(OH)D3與甲狀腺功能指標(biāo)間不相關(guān)。結(jié)論 與健康人群相比，甲狀腺相關(guān)疾病各組患者血清中25(OH)D3水平明顯降低，CLIA法及ELISA法檢測25(OH)D3結(jié)果相關(guān)系數(shù)高，均適用于臨床檢測外中血中25(OH)D3。

酶聯(lián)免疫吸附法；免疫化學(xué)發(fā)光法；25羥維生素D；甲狀腺相關(guān)疾病

維生素D是一種脂溶性維生素，在肝臟25羥化酶的作用下轉(zhuǎn)化為25羥維生素D[25(OH)D3]，再經(jīng)腎臟中P450氧化酶的催化轉(zhuǎn)化為有生物活性的1,25-二羥基維生素D[1,25-(OH)2D]。25(OH)D3為維生素D的主要運輸形式，在血液中濃度高，穩(wěn)定性好，半衰期長，故血清25(OH)D3濃度是評價維生素D含量的最為有效的指標(biāo)[1]。維生素D在調(diào)節(jié)鈣磷平衡及骨代謝平衡中的作用已為人們熟知，近期的研究發(fā)現(xiàn)在一些自身免疫性疾病患者中維生素D缺乏的發(fā)生率明顯增加，包括多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、1型糖尿病[2]及甲狀腺相關(guān)疾病[3-4]。本研究擬采用免疫化學(xué)發(fā)光法(CLIA)及酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測三種常見的甲狀腺疾病Graves病(GD)、橋本甲狀腺炎(HT)及亞急性甲狀腺炎(SAT)患者外周血中25(OH)D3水平，分析其與血鈣、血磷、甲狀腺功能、甲狀腺自身抗體等指標(biāo)間的相關(guān)性，并對兩種檢測方法的結(jié)果進行對比。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2013年12月-2015年10月在我院內(nèi)分泌科就診的患者199例，其中GD組57例，男21例，女36例，年齡(32.29±12.63)歲；HT組69例，男27例，女42例，年齡(35.62±14.36)歲；SAT組73例，男26例，女47例，年齡(31.63±14.21)歲。健康對照組(NC組)97例，男34例，女63例，年齡(33.56±8.63)歲。NC組為本院體檢中心體檢者，符合身體健康標(biāo)準(zhǔn)，甲狀腺功能及B超檢查均正常。詢問病史排除惡性腫瘤，及自身免疫性疾病包括：

表1 甲狀腺相關(guān)疾病組與健康對照組甲狀腺指標(biāo)及25(OH)D3水平比較

指標(biāo)Graves病組(n=57)橋本氏甲狀腺炎組(n=69)亞急性甲狀腺炎組(n=73)健康對照組(n=97)血鈣(mmol/L)2．34±0．322．38±0．292．30±0．262．36±0．24血磷(mmol/L)1．16±0．291．16±0．211．13±0．231．18±0．26FT3(pmpl/L)24．26±8．32?4．21±0．87△10．06±3．84?△▲4．73±0．63FT4(pmpl/L)68．36±14．08?8．57±3．21?△32．64±11．08?△▲16．24±6．21TSH(mIU)0．01±0．12?54．264．2．31?△0．02±0．14?▲1．26±0．32TPOAb(IU/ml)90．87±19．26?1263．57±682．31?△9．82±3．68△▲7．30±3．1625(OH)D3(nmol/L)ELISA法47．26±13．63?36．23±18．26?△40．26±17．21?△63．46±17．28CLIA法46．86±11．64?31．63±17．52?△38．27±17．79?△57．28±16．36注：與健康對照組相比，?P<0．05；與Graves病組相比，△P<0．05；與橋本氏甲狀腺炎組相比，▲P<0．05

系統(tǒng)性紅斑狼瘡、重癥肌無力、風(fēng)濕類疾病等。GD診斷標(biāo)準(zhǔn)：①有甲狀腺毒癥所致的高代謝癥狀和體征；②血清游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)高于正常值，促甲狀腺激素(TSH)低于正常值；③甲狀腺彌漫性腫大(觸診及甲狀腺B超)；④攝碘率升高。HT診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]：①HT典型臨床表現(xiàn)；②甲狀腺觸診可見彌漫性對稱性腫大；③抗甲狀腺過氧化物酶體(TPOAb)顯著增高，促甲狀腺抗體受體(TRAb)陰性。SAT診斷標(biāo)準(zhǔn)：①全身急性炎癥癥狀；②甲狀腺觸診腫大，觸痛明顯；B超可見低片狀回聲；③實驗室檢查血沉加快，甲狀腺功能異常。所有患者均為我院內(nèi)分泌科初診，未經(jīng)治療的患者。GD、HT、SAT、 NC組間年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 檢測方法 所有研究對象均禁食8～10 h后空腹靜息狀態(tài)下采集肘靜脈血3～5 mL數(shù)管，3000 r/min離心10 min分離血清用以相應(yīng)檢測。TSH、FT3、FT4、TPOAb的測定采用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(羅氏Cobas 8000)。全自動生化儀(Olympus 2700)測定血鈣、血磷。25(OH)D3分別采用CLIA法(西門子，ADVIA Centaur)及ELISA法測定(廣州菲康生物技術(shù)有限公司，PC-002)。

2 結(jié) 果

2.1 甲狀腺相關(guān)疾病組與健康對照組甲狀腺指標(biāo)及25(OH)D3水平比較 方差分析結(jié)果顯示，四組間TSH差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，兩兩比較顯示HT組TSH水平高于其余三組(P<0.05)，GD、SAT組明顯低于NC組(P<0.05)。GD組FT3含量顯著高于其余三組(P<0.05)，SAT組FT3水平高于NC、HT組，而HT及NC組FT3水平無統(tǒng)計學(xué)差異。FT4水平在GD、SAT、NC、HT組中依次降低且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。HT組中TPOAb含量最高，GD組次之，NC組最低，其差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。ELISA法檢測四組25(OH)D3水平均高于CLIA法，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；方差分析結(jié)果顯示，四組間25(OH)D3差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，兩兩組間t檢驗分析結(jié)果顯示，NC組中25(OH)D3的值高于GD、HT、SAT組(P<0.05)，GD組高于HT、SAT組(P<0.05)， HT組低于SAT組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 CLIA法及ELISA法檢測25(OH)D3的水平與甲狀腺激素水平的相關(guān)性分析 CLIA法及ELISA法所測25(OH)D3相關(guān)性良好(r=0.83,P<0.05)。經(jīng)Pearson相關(guān)分析顯示NC組25(OH)D3與各項研究指標(biāo)均無相關(guān)性。GD組、HT組25(OH)D3與FT3、FT4呈正相關(guān)，與TSH、TPOAb負性相關(guān)。SAT組中25(OH)D3各項指標(biāo)間無相關(guān)性。兩種檢測方法相關(guān)性分析結(jié)果一致。見表2。

3 討 論

維生素D是人體中一種脂溶性維生素，不僅在鈣磷代謝中具有重要作用，在甲狀腺等疾病的發(fā)病過程中也扮演重要角色[6-8]。本研究涉及了三種常見的甲狀腺疾病，包括Graves病、橋本甲狀腺炎和亞急性甲狀腺炎，前兩者為自身免疫性疾病。目前國內(nèi)外的研究已證實，維生素D通過與維生素D受體結(jié)合，調(diào)節(jié)Th1輔助細胞/Th2輔助細胞的平衡，降低B淋巴細胞的活性，從而抑制自身抗體的產(chǎn)生，緩解體液免疫對宿主細胞的攻擊[9]。由此可見，體內(nèi)維生素D的水平與甲狀腺的功能直接相關(guān)相關(guān)，低維生素D水平無法限制B淋巴細胞的活性，從而延緩自身抗體對甲狀腺體的攻擊。因此，在HT及GD組中，血清中25(OH)D3明顯低于對照組，并與甲狀腺功能指標(biāo)FT3、FT4正相關(guān)與TSH、TPOAb負性相關(guān)。SAT為病毒感染后引發(fā)的甲狀腺炎癥，關(guān)于其發(fā)病機制，除病毒感染因素等，也有學(xué)者認為其發(fā)病亦有自身免疫因素參與[10]。由于維生素D參與了機體的體液和細胞免疫，因此SAT患者存在低維生素D血癥的可能性也比健康人更高，我們的結(jié)果也顯示，SAT組血清中的25(OH)D3明顯低于對照組。綜上所述，三種類型的甲狀腺疾病的發(fā)生均與低維生素D血癥相關(guān)，然而低維生素D血癥是甲狀腺相關(guān)疾病的誘因還是結(jié)局目前尚無法定論。

25(OH)D3的檢測方法主要有四種：放射免疫法(RIA)、免疫化學(xué)發(fā)光法(CLIA)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)及高效液相色譜法(HPLC)[11]。HPLC法靈敏度、特異性較高，但存在設(shè)備昂貴，標(biāo)本處理復(fù)雜等缺點無法在臨床開展。同樣，RIA法雖兼具靈敏度、特異性高的優(yōu)勢，也存在有放射性污染等缺點。CLIA法及ELISA法為目前臨床最常用的兩種檢測方法，有文獻比較，ELISA法的敏感性及特異性不如CLIA法。我們的研究結(jié)果顯示：ELISA法的質(zhì)控變異系數(shù)(CV值)高于CLIA法，在健康對照組及三組甲狀腺疾病組中，ELISA法檢測的結(jié)果均高于CLIA法，但兩種方法差異無統(tǒng)計學(xué)意義?？紤]到ELISA法對設(shè)備和操作要求較低，并有無污染的優(yōu)勢，也適用于臨床檢測 25(OH)D3。

血清中25(OH)D3受年齡、性別、季節(jié)、地域環(huán)境、日照時間影響較大。本研究主要檢測了宜興地區(qū)青中年甲狀腺相關(guān)疾病患者群體血清中25(OH)D3中，并通過統(tǒng)計分析血清中25(OH)D3與甲狀腺功能指標(biāo)間的相關(guān)性，并對目前常用的兩種25(OH)D3檢測方法的結(jié)果一致性進行了比較。對于血清中25(OH)D3低于正常的GD、HT及SAT患者，可以嘗試甲狀腺疾病基礎(chǔ)治療的同時，加以補充維生素D以調(diào)節(jié)免疫[12]，為臨床治療擴展提供新的思路。

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(本文編輯：葉華珍)

214200江蘇宜興，江蘇大學(xué)附屬宜興市人民醫(yī)院，1.檢驗科，2.甲狀腺乳腺外科

陳 翔, E-mail:chenxiang_1979@hotmail.com

張晶晶，湯俊明，吳黎明，等.免疫化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫吸附法測定25羥維生素D在常見甲狀腺相關(guān)疾病診斷中的應(yīng)用價值[J].東南國防醫(yī)藥，2016,18(6):647-649.

R581

B

10.3969/j.issn.1672-271X.2016.06.024

2016-04-01；

2016-07-18)