靈芝菌-玄七通痹膠囊藥渣雙向發(fā)酵工藝的研究

張慶明，徐云燕，顧寧寧，張興德

·論 著·

靈芝菌-玄七通痹膠囊藥渣雙向發(fā)酵工藝的研究

張慶明1，徐云燕1，顧寧寧2，張興德2

目的 優(yōu)化靈芝菌-玄七通痹膠囊藥渣雙向發(fā)酵工藝，初步探討其主要活性組分的物質(zhì)差異。方法 以多糖、靈芝酸和皂苷作為檢測指標，考察藥渣濃度、固液比、藥渣粒徑等因素對靈芝菌發(fā)酵玄七通痹膠囊藥渣的影響，并利用高效液相色譜(HPLC)技術分析添加藥渣發(fā)酵后主要活性組分的物質(zhì)差異。結果 以多糖為目標產(chǎn)物，最佳的藥渣添加量25%，固液比1∶1.5，藥渣粒徑60目過篩，發(fā)酵時間25 d；以靈芝酸為目標產(chǎn)物，最佳的藥渣添加量40%，固液比1∶1.8，藥渣粒徑60目過篩，發(fā)酵時間30 d。并且添加藥渣發(fā)酵后，在多糖組分和靈芝酸組分中都產(chǎn)生了新的物質(zhì)。結論 本研究不僅將為解決中藥渣直接排向環(huán)境造成的污染等問題提供參考，而且還為實現(xiàn)中藥渣再利用、新藥及功能飼料添加劑的開發(fā)提供依據(jù)。

靈芝菌；玄七通痹膠囊藥渣；雙向發(fā)酵；多糖；靈芝酸

近年來，隨著中醫(yī)藥事業(yè)的快速發(fā)展，藥渣的廢棄量日益增多，已成為中藥生產(chǎn)企業(yè)中最嚴重的污染源之一。藥渣含水量大、營養(yǎng)豐富，目前常用堆放、填埋及焚燒等處理方式，不僅造成了資源的浪費，還對水體和大氣等環(huán)境產(chǎn)生了污染[1]。目前，研究者在藥渣綜合利用方面做了許多研究工作，包括用于培養(yǎng)食用菌、制成花肥及制備絮凝劑等[2-3]，但我國藥渣的種類繁多，性質(zhì)差異巨大，因此仍需開展藥渣新的利用研究。

靈芝菌是我國傳統(tǒng)的藥用真菌，能產(chǎn)生靈芝酸、靈芝多糖等多種活性物質(zhì)[4-5]。根據(jù)雙向發(fā)酵理論，構建靈芝菌和藥渣的發(fā)酵體系，一方面靈芝菌生長過程中產(chǎn)生大量的酶系，對藥渣中的某些組分進行轉(zhuǎn)化形成新的成分，而這些新成分就是新活性化合物篩選的物質(zhì)基礎，另一方面，藥渣中的某些物質(zhì)也會對靈芝菌生長和代謝產(chǎn)生影響，從而形成新的成分或改變各成分的相互比例[6]。因此，利用藥用真菌發(fā)酵藥渣，變廢為寶，為新藥及功能飼料添加劑開發(fā)提供源泉。陳合等[7]利用靈芝菌轉(zhuǎn)化中藥“香菊”的藥渣，進而考察了多糖、靈芝酸和蛋白的變化情況。莊毅等[8]綜述了靈芝菌和黃芪藥渣雙向發(fā)酵菌質(zhì)能顯著提高肉雞、沼蝦等動物的機體免疫力和風味，但目前這方面的研究報道仍然較少，尤其對添加藥渣后主要活性組分變化缺乏細致研究。

玄七通痹膠囊主要有滋補肝腎、活血化瘀等功效，市場銷售量巨大，同時藥渣處理成為了生產(chǎn)企業(yè)亟待解決的棘手問題，目前還未有靈芝菌發(fā)酵玄七通痹膠囊藥渣的報道。本實驗以玄七通痹膠囊藥渣為基質(zhì)，以靈芝菌為出發(fā)菌株，優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件，為后續(xù)生理活性研究和目標產(chǎn)物的分離鑒定打下基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種 靈芝菌(Ganodermalucidum)購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(批號CICC14002)。

1.2 中藥渣 玄七通痹膠囊藥渣由南京中山制藥有限公司提供，濕物料經(jīng)烘干、粉碎、過篩后置于干燥器中備用。本次實驗用藥渣中各主要成分含量如下：蛋白質(zhì)20.2%，粗纖維30.7%，粗多糖2.1%，總皂苷1.7%，靈芝酸含量極低。若無特別說明，藥渣質(zhì)量均以干物料計。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 平板培養(yǎng)基 為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，馬鈴薯浸取液1 L，加入葡萄糖20 g，瓊脂20 g，于121 ℃滅菌30 min。用于靈芝菌的培養(yǎng)。

1.3.2 種子培養(yǎng)基 葡萄糖30 g，酵母膏10 g，玉米粉10 g，KH2PO41.5 g，MgSO41 g，蒸餾水1 L，pH 6.5左右，于121 ℃滅菌30 min，用于靈芝菌種子液的制備。

1.3.3 基礎固體培養(yǎng)基 以藥渣和麩皮為培養(yǎng)基質(zhì)，添加一定量的水分，用于考察不同培養(yǎng)基組成對靈芝菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化藥渣的影響。

1.4 儀器 恒溫培養(yǎng)箱(PYX-DHS, 中國上海市躍進醫(yī)療器械一廠)，紫外分光光度計(UV-2101C，美國UNICO)，高速離心機(CR21G，日本HITACHI)，壓力蒸汽滅菌鍋(HVE-50，日本HIRAYAMA)，高效液相色譜(UltiMate 3000，美國DIONEX)。

1.5 培養(yǎng)方法

1.5.1 靈芝菌的培養(yǎng) 將靈芝菌種接入平板培養(yǎng)基中，于28 ℃下恒溫培養(yǎng)5 d。進而將靈芝菌接入裝有100 mL種子液培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶，置于恒溫空氣浴振蕩器中，在180 rpm、28 ℃條件下培養(yǎng)3 d。

1.5.2 靈芝菌固態(tài)發(fā)酵玄七通痹膠囊藥渣 將靈芝菌種子液接種至玄七通痹膠囊藥渣基礎固體培養(yǎng)基中，接種量10 mL/100 g固體培養(yǎng)基，初始藥渣濃度10%、藥渣粒徑40目、固液比1∶2、培養(yǎng)溫度28 ℃、培養(yǎng)時間30 d。

1.5.3 影響固態(tài)發(fā)酵的單因子實驗 分別考察藥渣添加量、固液比、藥渣粒徑、培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)時間等因素對中藥渣固態(tài)發(fā)酵的影響，以發(fā)酵產(chǎn)物中多糖、靈芝酸及皂苷的含量變化作為評價指標。

1.6 分析方法

1.6.1 多糖含量的測定 藥渣發(fā)酵菌質(zhì)低溫烘干，粉碎。稱取粉末10 g，加水200 mL，于95 ℃，回流提取1.5 h，過濾后加水100 mL，再次提取1.5 h。合并濾液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮一定體積后，加入乙醇至乙醇終濃度達到85%，靜置過夜，離心。沉淀加水復溶，利用苯酚-硫酸法[9-10]測定多糖含量。

1.6.2 靈芝酸含量的測定 取烘干粉碎后的藥渣發(fā)酵菌質(zhì)10 g，加入100 mL的95%乙醇，75 ℃回流提取1.5 h，重復一次，過濾，合并上清液，旋轉(zhuǎn)蒸干。用100 mL氯仿溶解，60 mL飽和碳酸氫鈉2次萃取，合并上層液。用鹽酸調(diào)pH至2～3，用50 mL氯仿分兩次萃取，合并氯仿層，蒸干后用甲醇復溶。利用草醛冰醋酸-高氯酸顯色法測定靈芝酸的含量。

1.6.3 總皂苷含量的測定 取烘干粉碎后的藥渣發(fā)酵菌質(zhì)10 g，加水100 mL，于95 ℃回流提取1.5 h，重復一次，合并提取液，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，加入水飽和正丁醇萃取3次，合并正丁醇層，加濃度1%NaOH水溶液萃取2次，棄去水層，加正丁醇飽和的水萃取2次，合并正丁醇層，蒸干，殘渣加甲醇溶解后，利用高氯酸-香草醛法檢測總皂苷含量。

1.6.4 多糖組成的分析 取干燥的多糖樣品，加入2 mol/L的H2SO4溶液，100 ℃水解8 h，取出冷卻后加入碳酸鋇中和，3000 rpm離心去除沉淀，上清液樣品經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，利用高效液相色譜(HPLC)分析單糖組分。色譜柱為Shodex SP0810，示差檢測，柱溫60 ℃。

1.6.5 靈芝酸組分的分析 靈芝酸組分進行HPLC分析[10]，流動相：甲醇/水(0.05%冰乙酸)，流速：0.8 mL/min，以20%甲醇沖洗柱體10 min，進而將梯度洗脫，甲醇濃度自20%提高至100%，時間40 min。而后維持甲醇濃度100%，沖洗柱體5 min后，在5 min內(nèi)將甲醇濃度由100%梯度降至20%，維持5 min。20%甲醇10 min，20%-100%甲醇40 min，100%甲醇5 min，100%-20%甲醇5 min，20%甲醇5 min。色譜柱：Discovery HS C18柱。

2 結 果

2.1 藥渣添加量對靈芝菌發(fā)酵的影響 玄七通痹膠囊藥渣成分復雜，必定會對靈芝菌生長代謝產(chǎn)生影響，因此本研究首先考察藥渣濃度對發(fā)酵的影響，結果見圖1A。當藥渣濃度達到考察上限55%時，靈芝菌仍能較好地生長。但在藥渣濃度為25%時，發(fā)酵后多糖含量最高，達到了16.3 mg/g菌質(zhì)。對靈芝酸而言最佳的藥渣添加濃度是40%，靈芝酸含量達到了1.2 mg/g菌質(zhì)(圖1B)。而添加不同濃度的藥渣發(fā)酵后，總皂苷濃度均較低，僅為0.1～0.3 mg/g之間(數(shù)據(jù)未列出)，遠低于初始藥渣中的總皂苷濃度。

2.2 藥渣粒徑對靈芝菌藥渣發(fā)酵的影響 固態(tài)發(fā)酵過程中顆粒的大小會直接影響單位體積反應表面積，也會影響顆粒間菌體的生長、氧供給率、散熱率及二氧化碳的移出率，因此分別在最佳的藥渣濃度情況下，考察了藥渣粒徑對靈芝菌發(fā)酵的影響，結果見圖2。從結果可知，原料粒徑為40目、60目和80目時發(fā)酵效果較好，其中60目時多糖及靈芝酸含量最高，分別達到了20.2 mg/g菌質(zhì)和1.7 mg/g菌質(zhì)。當利用100目粒徑的藥渣發(fā)酵時，兩種物質(zhì)的含量顯著降低。此外研究發(fā)現(xiàn)，總皂苷的濃度在100目最高，達到11.2 mg/g菌質(zhì)，60目時僅為0.12 mg/g菌質(zhì)。

2.3 固液比對靈芝菌發(fā)酵藥渣的影響 固態(tài)發(fā)酵過程中，靈芝菌是在無游離水的基質(zhì)上進行生長代謝，含水量過多或過少都會對靈芝菌的生長代謝造成不利影響，固液比對玄七通痹膠囊渣固態(tài)發(fā)酵的影響見圖3。研究結果表明，加水量對靈芝菌藥渣發(fā)酵產(chǎn)生了較大的影響，當固液比為1∶1.5時，發(fā)酵產(chǎn)物中多糖含量最高，達到了35.2 mg/g菌質(zhì)(圖3A)，而固液比為1∶1.8時，發(fā)酵產(chǎn)物中靈芝酸的含量最高，達到了2.6 mg/g菌質(zhì)(圖3B)。

2.4 發(fā)酵溫度對靈芝菌藥渣發(fā)酵的影響 靈芝菌的生長和代謝均需要一定的溫度，溫度過高、過低都會影響菌株的生長及產(chǎn)酶。由于大多數(shù)研究報道中，靈芝菌在28 ℃左右生長旺盛，因此選擇25～35 ℃作為發(fā)酵溫度，考察溫度對靈芝菌藥渣發(fā)酵的影響(圖4)。結果表明，在發(fā)酵溫度28 ℃時，多糖和靈芝酸含量均達到最高，分別為35.7 mg/g菌質(zhì)和2.7 mg/g菌質(zhì)，因此選擇28 ℃作為靈芝菌-玄七通痹膠囊藥渣的發(fā)酵溫度。

2.5 靈芝菌-藥渣的發(fā)酵進程曲線 適當?shù)乜刂瓢l(fā)酵時間，不僅可以獲得最高的活性物質(zhì)產(chǎn)量，還可以避免染菌及降低生產(chǎn)成本。在最佳發(fā)酵條件下，靈芝菌-玄七通痹膠囊藥渣雙向發(fā)酵過程中活性物質(zhì)的變化情況見圖5。多糖組分隨著發(fā)酵的進行，先減少后增加，在15 d最低，而后隨著時間延長，多糖含量逐漸增加。該結果表明，靈芝菌生長過程中先消耗了藥渣基質(zhì)中的多糖組分用于菌體生長，而后菌株生長代謝產(chǎn)生的多糖逐漸增加。在25 d達到最高后，進而減少。靈芝酸含量隨著發(fā)酵的進行逐漸增加，在30 d達到最大。而總皂苷含量隨著時間的進行逐漸減少，說明菌體對皂苷類物質(zhì)進行了轉(zhuǎn)化。

圖1 藥渣濃度對靈芝菌發(fā)酵藥渣產(chǎn)多糖及靈芝酸的影響

圖2 藥渣粒徑對靈芝菌藥渣發(fā)酵產(chǎn)多糖及靈芝酸的影響

2.6 靈芝菌-藥渣發(fā)酵菌質(zhì)的多糖組成變化分析 以未發(fā)酵藥渣、未添加藥渣的靈芝菌固體發(fā)酵菌質(zhì)(基質(zhì)為麩皮)提取的多糖樣品為空白對照。利用濃硫酸水解樣品和對照品，分析多糖的組成變化。圖6A為添加藥渣未發(fā)酵基質(zhì)的多糖水解液單糖組成的HPLC圖，圖6B為未添加藥渣的靈芝菌發(fā)酵多糖水解液單糖組成的HPLC圖，圖6C為添加藥渣后的靈芝發(fā)酵多糖水解液的單糖HPLC圖。從實驗結果對比可知，藥渣經(jīng)靈芝菌發(fā)酵后產(chǎn)生了新的單糖組分，說明雙向發(fā)酵產(chǎn)生了新的多糖組分。

2.7 靈芝菌-藥渣發(fā)酵菌質(zhì)的靈芝酸組分變化分析 以未發(fā)酵藥渣、未添加藥渣的靈芝菌固體發(fā)酵菌質(zhì)(基質(zhì)為麩皮)提取的靈芝酸組分為空白對照。圖7A為未發(fā)酵藥渣的靈芝酸組分HPLC圖譜，圖7B為未添加藥渣的靈芝菌發(fā)酵菌質(zhì)中靈芝酸組分的HPLC圖，圖7C為雙向發(fā)酵菌質(zhì)中靈芝酸組分的HPLC圖。經(jīng)對比分析可知，添加藥渣發(fā)酵后，在靈芝酸三萜組分中也顯著產(chǎn)生了新的物質(zhì)。

圖3 固液比對靈芝菌藥渣發(fā)酵產(chǎn)多糖及靈芝酸的影響

圖4 溫度對靈芝菌藥渣發(fā)酵產(chǎn)多糖及靈芝酸的影響

圖5 靈芝菌發(fā)酵玄七通痹膠囊的時間曲線

A：藥渣單糖組分；B：靈芝菌未添加藥渣發(fā)酵菌質(zhì)的單糖組分；C：靈芝菌-藥渣發(fā)酵菌質(zhì)的單糖組分圖6 靈芝菌-藥渣發(fā)酵菌質(zhì)中單糖組分的變化

A：藥渣靈芝酸組分；B：靈芝菌未添加藥渣發(fā)酵菌質(zhì)的靈芝酸組分；C：靈芝菌-藥渣發(fā)酵菌質(zhì)的靈芝酸組分圖7 靈芝菌-藥渣發(fā)酵菌質(zhì)中靈芝酸組分的變化

3 討 論

在傳統(tǒng)的固體發(fā)酵中，基質(zhì)的作用僅是單向性為真菌提供所需的營養(yǎng)物質(zhì)。近年來，利用藥用真菌發(fā)酵中藥從而產(chǎn)生新的活性物質(zhì)和提高藥效，成為了研究熱點。但目前對中藥渣的生物轉(zhuǎn)化研究相對較少，而且基本集中在利用藥渣生產(chǎn)蛋白飼料等方面，而以藥用真菌發(fā)酵中藥渣進行新藥及功能性飼料添加劑的開發(fā)具有極大的潛力。王建芳等[11]發(fā)現(xiàn)，利用香菇發(fā)酵鼻淵舒系列產(chǎn)品的藥渣，最終的發(fā)酵菌質(zhì)能顯著促進小鼠的生長和免疫器官發(fā)育。

本研究以多糖和靈芝酸為主要的檢測指標，優(yōu)化了靈芝菌-玄七通痹膠囊雙向發(fā)酵體系。進而發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后生產(chǎn)的多糖[12]及靈芝酸組分均與未添加藥渣的發(fā)酵產(chǎn)物有所差異。在今后的研究中，將探討這兩種組分的藥理學活性。本研究不僅將為解決中藥渣直接排向環(huán)境造成的污染等問題提供參考，而且還為實現(xiàn)中藥渣再利用、新藥及功能飼料添加劑的開發(fā)提供依據(jù)。

[1] 王 浩，嚴嘉敏，羅 佳. 中藥藥渣深入利用的研究進展[J]. 中藥與臨床，2015，6(3)：62-65.

[2] 劉文偉，劉玉璇，趙 宇，等. 中藥渣綜合利用研究進展[J]. 藥學研究，2013，32(1)：49-50.

[3] 潘文華，鄧喬丹，馮毅翀，等. 中藥渣綜合利用的可行性分析[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2011，22(8)：2026-2027.

[4] Liu L, Kurashiki K, Fukuta A, et al. Quantitative determination of the representative triterpenoids in the extracts ofGanodermalucidumwith different growth stages using high-performance liquid chromatography for evaluation of their 5α-reductase inhibitory properties[J].Food Chem, 2012,133(3):1034-1038.

[5] 丁 妍，周向毅，崔 莉，等. 靈芝多糖對輻射損傷小鼠的防護作用[J]. 醫(yī)學研究生學報，2014, 27(11)：1152-1155.

[6] 莊 毅，潘 揚，謝小梅，等. 藥用真菌“雙向發(fā)酵”的起源、發(fā)展及其優(yōu)勢與潛力[J]. 中國食用菌，2007，26(2)：3-6.

[7] 陳 合，趙 燕，陳 明，等. 利用中藥渣培養(yǎng)靈芝菌及生物活性成分的研究[J]. 食品工業(yè)科技，2006，27(10)：58-63.

[8] 莊 毅，洪 凈. 藥用真菌雙向固體發(fā)酵工程與中成藥藥渣開發(fā)[J]. 中國中藥雜志，2006，31(22)：8191-8192.

[9] 陳玉勝，阮 鳴，張李陽，等. “芝芪菌質(zhì)”發(fā)酵配方的篩選及主要有效成分的含量測定[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，36(4)：1310-1311，1313.

[10]于 淼，原 源. HPLC測定益心酮片中四種黃酮類成分的含量法[J]. 東南國防醫(yī)藥，2015，17(2)：157-159，165.

[11]王建芳，徐 春，徐萌萌，等. 利用香菇發(fā)酵中藥廢渣提高利用價值的研究[J]. 四川大學學報，2007，44(12)：451-454.

[12]鄭浩然，楊海龍. 鐵皮石斛對靈芝多糖深層發(fā)酵的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2016, 44(19)：141-142.

(本文編輯：葉華珍； 英文編輯：王建東)

Study on the bi-directional fermentation process of Ganoderma lucidum and xuanqi Tongbi residue

ZHANG Qing-ming1, XU Yun-yan1, GU Ning-ning2,

ZHANGXing-de2. 1.DepartmentofPreparations,NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand,Nanjing,Jiangsu210002,China; 2.CollegeofPharmacy,NanjingUniversiyofChineseMedicine,Nanjing,Jiangsu210023,China

Objective To optimize bi-directional fermentation process ofGanodermalucidumand xuanqi Tongbi residue and discover new substances from main active components. Methods With the contents of polysaccharide, ganoderic acid and saponin as detection index, the effects of fermentative parameters, such as drug residue concentration, solid-liquid ratio, particle size of residue on the yield of active substrates byGanodermalucidumwere studied. Then the new substances in main active components produced by bi-directional fermentation were analyzed using HPLC methods. Results Taking polysaccharide as the target product, the optimal fermentation condition were as follows: drug residue concentration was 25%, the ratio of solid to liquid was 1∶1.5, the particle size of residue was 60 mesh and the time was 25 d. After fermentation, the new substances both in polysaccharide component and ganoderic acid component were produced. Conclusion This study will not only provide reference for solving the pollution problems caused by the direct discharge of traditional Chinese medicine residues, but also provide the basis for the reuse of traditional Chinese medicine residues and the development of new drugs and functional feed additives.

Ganodermalucidum; xuanqi Tongbi residue; bi-directional fermentation; polysaccharide; ganoderic acid

1. 210002江蘇南京，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院制劑科；2. 210023江蘇南京，南京中醫(yī)藥大學藥學院

張興德，E-mail：Xingde2293@126.com

張慶明，徐云燕，顧寧寧，等.靈芝菌-玄七通痹膠囊藥渣雙向發(fā)酵工藝的研究[J].東南國防醫(yī)藥，2016,18(6):585-590.

Q815

A

10.3969/j.issn.1672-271X.2016.06.008

2016-07-21；

2016-09-07)