孤獨癥的神經(jīng)生物學(xué)研究

仇子龍，李霄

孤獨癥的神經(jīng)生物學(xué)研究

仇子龍，李霄

孤獨癥在1946年由美國醫(yī)生Kanner發(fā)現(xiàn)并命名，其主要在幼兒中出現(xiàn)，臨床癥狀有語言發(fā)育遲緩、社交溝通障礙及重復(fù)刻板行為等。近年來孤獨癥的臨床發(fā)病率日益飆升，引起世界各國的廣泛重視。經(jīng)過醫(yī)生與神經(jīng)科學(xué)家數(shù)十年的臨床與基礎(chǔ)研究，目前認(rèn)為孤獨癥/孤獨癥譜系障礙是一種復(fù)雜的神經(jīng)發(fā)育性疾?。╪eurodevelopmental disorder），主要由遺傳因素導(dǎo)致。本文從遺傳分析，神經(jīng)生物學(xué)研究及動物模型的構(gòu)建角度逐一討論孤獨癥研究的各個方面，并將國內(nèi)近年來對孤獨癥研究在這些方面取得的進(jìn)展逐一介紹，最后對孤獨癥的神經(jīng)生物學(xué)研究進(jìn)行總結(jié)與展望。

1　遺傳分析

孤獨癥最早被發(fā)現(xiàn)時曾經(jīng)被誤認(rèn)為是由父母的不當(dāng)行為導(dǎo)致的疾病，直到發(fā)現(xiàn)孤獨癥的發(fā)病率在雙生子及遺傳關(guān)系密切的人群顯著升高，研究者才認(rèn)識到遺傳因素在孤獨癥的發(fā)病中占有重要地位，對孤獨癥人群的大規(guī)模遺傳分析因此展開。近年來，世界各國都對多個孤獨癥的核心家系及孤獨癥的散發(fā)人群開展了大規(guī)?；蚪M關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study）。但令人困惑的是，這些研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)了眾多基因突變位點與孤獨癥相關(guān)，但是卻沒有某幾種基因占主導(dǎo)地位，表現(xiàn)為許多孤獨癥相關(guān)突變位點僅僅占整體孤獨癥基因突變的極少部分。

這些研究為孤獨癥的神經(jīng)生物學(xué)研究提供了重要線索，首先提示作為一種復(fù)雜精神疾病的孤獨癥，很可能是一種多基因多位點致病的疾病。其次，在遺傳分析中發(fā)現(xiàn)的突變基因呈現(xiàn)出功能上可以細(xì)分的幾大類，例如突觸蛋白編碼基因與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)蛋白編碼基因等，進(jìn)一步提示孤獨癥與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育特別是突觸的正常功能失調(diào)密切相關(guān)。

隨著人類基因組計劃的完成，研究者對人類基因組的變異類型有了嶄新的認(rèn)識。2007年，美國冷泉港實驗室Wigler教授研究組發(fā)現(xiàn)染色體區(qū)段的原發(fā)性拷貝數(shù)變異（de novo copy number variations）與孤獨癥密切相關(guān)，這為孤獨癥遺傳分析提供了新角度。

中國科學(xué)家在孤獨癥遺傳學(xué)研究領(lǐng)域也作出了突出貢獻(xiàn)。北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部張岱教授研究組對中國的孤獨癥遺傳學(xué)分析做了長期系統(tǒng)的工作，2004年報道在中國的孤獨癥患者中語言相關(guān)基因FoxP2與孤獨癥的發(fā)生具有相關(guān)性，該發(fā)現(xiàn)為語言發(fā)育在孤獨癥發(fā)病機理中的研究提供了重要證據(jù)。中南大學(xué)夏昆教授研究組報道了在中國孤獨癥人群中進(jìn)行大規(guī)?；蚪M關(guān)聯(lián)分析的工作，發(fā)現(xiàn)了與孤獨癥密切相關(guān)的染色體新區(qū)段。鑒于孤獨癥與遺傳因素關(guān)系密切，因此針對不同人種的孤獨癥遺傳學(xué)研究非常重要。對歐美高加索人群中報道的孤獨癥遺傳因素是否可以應(yīng)用于東亞人群需要進(jìn)行細(xì)致的研究。

2　神經(jīng)生物學(xué)研究

孤獨癥的遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了大量在孤獨癥人群中發(fā)生突變的基因，這些基因突變究竟是否與孤獨癥相關(guān)？在用遺傳學(xué)方法很難確認(rèn)孤獨癥的發(fā)病基因時，就需要利用神經(jīng)生物學(xué)的方法來研究這些基因突變是否會對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及功能造成影響而導(dǎo)致孤獨癥。

在對孤獨癥的遺傳分析中發(fā)現(xiàn)許多突觸蛋白的編碼基因發(fā)生突變，如shank3，neuroligins，neurexins 及cntnap 等。因此孤獨癥的神經(jīng)生物學(xué)研究工作需要解決兩大問題：在孤獨癥中發(fā)生的基因突變是否影響其編碼蛋白的正常功能及神經(jīng)突觸傳導(dǎo)？在含有同樣基因突變的動物模型中，是否有可能再現(xiàn)類似孤獨癥的癥狀？在過去的10年中對這兩大問題進(jìn)行了深入的研究。

對在孤獨癥病人中發(fā)生突變的一系列基因的功能進(jìn)行了系統(tǒng)地研究，其中功能研究相對深入的是neuroligins與neurexins家族蛋白。neuroligins與neurexins家族蛋白在20世紀(jì)90年代被發(fā)現(xiàn)是與突觸形成與功能有關(guān)的重要黏連蛋白。美國斯坦福大學(xué)Sudhof教授研究組發(fā)現(xiàn)，在孤獨癥中發(fā)生突變的neuroligin3 （R451C）蛋白影響了小鼠大腦中的抑制性突觸傳導(dǎo)，并且攜neuroligin3 （R451C）突變的小鼠發(fā)生了類似人類孤獨癥的癥狀，包括減少小鼠之間的社會交往行為等。另外一個重要的家族蛋白neuroligin4編碼基因缺失小鼠也表現(xiàn)出類似孤獨癥的表型。

東南大學(xué)謝維與韓俊海教授研究組在利用果蠅（Drosophila melanogaster）為模式生物研究neuroliginneurexin功能方面有重要進(jìn)展，他們發(fā)現(xiàn)果蠅中neuroligin家族蛋白也對突觸的功能非常重要，neuroligin4基因編碼蛋白對睡眠有重要調(diào)控作用以及neurexin蛋白作為分子伴侶的新功能。這些工作為深入了解neuroligin-neurexin家族蛋白的功能作出了重要貢獻(xiàn)。

近年來的重要進(jìn)展還包括對shank3基因在孤獨癥中的研究。shank3基因是最早幾個在孤獨癥中發(fā)現(xiàn)的突變基因之一，而且編碼重要的突觸后細(xì)胞骨架蛋白，因此shank3基因的突變是否是導(dǎo)致孤獨癥的原因便成為研究熱點。2011年，美國馮國平與姜永輝教授研究組同時報道在shank3基因突變小鼠中發(fā)現(xiàn)了類孤獨癥的表型及一系列突觸的發(fā)育及功能異常。這些工作進(jìn)一步確認(rèn)突觸蛋白的功能異?？蓪?dǎo)致一系列類孤獨癥及精神疾病的癥狀。

與孤獨癥密切相關(guān)的突觸黏連蛋白還有cntnap（contactin-associated protein）家族，其中cntnap2，4基因的突變在孤獨癥及其他精神疾病的病患中都被發(fā)現(xiàn)。加州大學(xué)洛杉磯分校 Geschwind 教授研究組發(fā)現(xiàn)，cntnap2基因缺失小鼠具有一系列類孤獨癥表型及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常，建立起cntnap家族蛋白與孤獨癥及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育疾病的聯(lián)系。紐約大學(xué)Fishell教授研究組發(fā)現(xiàn)，cntnap4蛋白特異性地在抑制性中間神經(jīng)元及多巴胺神經(jīng)元中表達(dá)，而且缺失cntnap4基因的小鼠也表現(xiàn)出一系列的突觸傳導(dǎo)異常及類精神疾病表型。

這些證據(jù)都表明，孤獨癥確實與大腦中突觸傳導(dǎo)的功能異常有關(guān)。除了突觸蛋白編碼基因突變以外，近年來還發(fā)現(xiàn)在孤獨癥病人中甲基化DNA結(jié)合蛋白MeCP2（methyl CpG-binding protein 2）的編碼基因出現(xiàn)拷貝數(shù)的倍增。MeCP2是一個甲基化DNA結(jié)合蛋白，具有抑制基因表達(dá)的重要功能。

美國貝勒醫(yī)學(xué)院的Zoghbi教授研究組發(fā)現(xiàn)一種嚴(yán)重的神經(jīng)發(fā)育性疾病瑞特綜合征（Rett syndrome）與MECP2基因突變密切相關(guān)，95%的瑞特綜合征病人攜帶MECP2基因的缺失功能突變。瑞特綜合征患者因為有部分與孤獨癥患者類似的表型，早期也被歸為孤獨癥譜系障礙的一種（autism spectrum disorders，ASD）。因此，這些證據(jù)表明基因表達(dá)的表觀遺傳學(xué)調(diào)控與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育與功能密切相關(guān)，失調(diào)可能導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育性疾病。美國貝勒醫(yī)學(xué)院Rosenmund教授研究組進(jìn)而發(fā)現(xiàn)，MeCP2蛋白具有雙向調(diào)控突觸傳導(dǎo)的活性，MeCP2蛋白缺失后神經(jīng)元之間的興奮性突觸傳導(dǎo)受損，MeCP2蛋白增多則神經(jīng)元之間的興奮性突觸傳導(dǎo)增強。人們陸續(xù)制作了多種MECP2基因敲除與轉(zhuǎn)基因的小鼠模型，并發(fā)現(xiàn)攜帶人類mecp2基因的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出焦慮水平上升及社會交往行為缺陷等類孤獨癥表型。

2003年，美國哈佛大學(xué)Greenberg教授研究組與加州大學(xué)洛杉磯分校的孫毅教授研究組發(fā)現(xiàn)，MeCP2在神經(jīng)元中可以調(diào)控重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子——腦源性營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophin factor， BDNF）的表達(dá)，進(jìn)而提示MeCP2可以通過調(diào)控基因表達(dá)而影響突觸的發(fā)育及可塑性。本實驗室最近發(fā)現(xiàn)，MeCP2除了調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，還具備抑制核內(nèi)小RNA剪切加工的活性，可調(diào)控眾多的小RNA剪切加工并影響神經(jīng)元的樹突生長及突觸形成。發(fā)現(xiàn)，MeCP2的過多及過少可雙向調(diào)控神經(jīng)元中小RNA的水平進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá)量，此工作為因MeCP2蛋白的劑量不同而導(dǎo)致孤獨癥或瑞特綜合征提供了可能的機理解釋。

對于孤獨癥的神經(jīng)生物學(xué)研究已經(jīng)取得許多進(jìn)展，包括對孤獨癥中發(fā)生突變基因的功能等。這些研究結(jié)果初步提示，是基因突變導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)中突觸發(fā)育異常從而導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育出現(xiàn)紊亂，進(jìn)而很有可能在整體水平表現(xiàn)出復(fù)雜的精神癥狀，包括社交障礙及重復(fù)刻板行為等。但是對于孤獨癥的神經(jīng)生物學(xué)研究最終還必須在整體動物水平進(jìn)行，包括對攜帶基因突變的動物的神經(jīng)發(fā)育情況及行為表型進(jìn)行研究。因此，建立可靠的動物模型對孤獨癥的研究至關(guān)重要。

3　孤獨癥動物模型

在過去的數(shù)年中，研究者制作了眾多動物模型用于孤獨癥研究。2007年，美國加州理工學(xué)院的Patterson教授研究組發(fā)現(xiàn)，用給懷孕母鼠注射白介素6（IL6）的方法可以誘導(dǎo)子代小鼠出現(xiàn)明顯的類孤獨癥與精神分裂癥表型，這種方法被稱為母體免疫激活（maternal immune activation，MIA）。接著發(fā)現(xiàn)，在MIA誘導(dǎo)的類孤獨癥小鼠模型中出現(xiàn)了代謝系統(tǒng)紊亂，及利用某些藥物可顯著改善MIA小鼠模型的孤獨癥表型。這些結(jié)果令人振奮，但同時必須認(rèn)識到，孤獨癥的起因多種多樣，用MIA的方法誘導(dǎo)模型是否能夠完全模擬人類的孤獨癥表型還需深入研究。例如，將MIA模型與其他的遺傳基因突變小鼠進(jìn)行仔細(xì)比較，研究在MIA 模型中出現(xiàn)的代謝異常是否也會在其他孤獨癥小鼠模型中出現(xiàn)等。

近年來，研究者還利用基因工程的方法將人類孤獨癥中突變基因的小鼠同源基因進(jìn)行敲除與突變而得到了許多基因突變小鼠。對這些基因突變小鼠開展了上文提到的多方面的神經(jīng)生物學(xué)研究，包括神經(jīng)發(fā)育、突觸形成與傳導(dǎo)，以及行為學(xué)上的分析等。但是對于怎樣用嚙齒類來模擬人類的復(fù)雜精神疾病癥狀始終是研究者反復(fù)探討的課題。是否可以用更接近人類的非人靈長類來制作孤獨癥模型便成為了孤獨癥研究領(lǐng)域的挑戰(zhàn)。近年來，新型快速基因編輯方法的出現(xiàn)為在非人靈長類中操控基因提供了可能。

2014年上半年，中國科學(xué)家陸續(xù)報道了利用非人靈長類制作疾病動物模型的工作。中國科學(xué)院昆明動物研究所季維智、同濟(jì)大學(xué)孫毅教授的團(tuán)隊及本實驗室與中國科學(xué)院上海神經(jīng)科學(xué)研究所孫強研究員的團(tuán)隊都報道了利用TALEN打靶的方法得到了與瑞特綜合征及孤獨癥譜系障礙關(guān)系密切的mecp2基因突變食蟹猴。其中，本實驗室與孫強研究員的工作發(fā)現(xiàn)，攜帶mecp2基因突變的雄性食蟹猴出生后死亡，大腦組織中檢測到顯著的MeCP2蛋白缺失，這些樣品為進(jìn)一步研究MeCP2在靈長類大腦發(fā)育中的作用提供了寶貴的材料。

4　孤獨癥研究的現(xiàn)狀與未來

孤獨癥是一種異常復(fù)雜的神經(jīng)發(fā)育性疾病，其病因呈現(xiàn)出遺傳上的異質(zhì)性，對神經(jīng)科學(xué)的研究提出了巨大挑戰(zhàn)。同時讓我們認(rèn)識到，人類的復(fù)雜社交行為有可能是通過復(fù)雜的神經(jīng)環(huán)路來調(diào)控的，并且為深入認(rèn)識人類社交行為的神經(jīng)環(huán)路基礎(chǔ)提供了重要的線索。接下來，還需要在分子細(xì)胞、神經(jīng)環(huán)路及整體動物水平上深入探討孤獨癥相關(guān)基因突變究竟怎樣影響哺乳類大腦的功能性聯(lián)接與功能。還需要在多種動物水平構(gòu)建更合適的動物模型用于基礎(chǔ)研究。只有對孤獨癥的神經(jīng)基礎(chǔ)有了進(jìn)一步認(rèn)識，有效的藥物及物理干預(yù)方法才有可能出現(xiàn)，這期待多學(xué)科的交叉合作，共同完成這一神經(jīng)科學(xué)與醫(yī)學(xué)上的重大難題。?

（摘自《中國科學(xué)：生命科學(xué)》2015年第8期）

責(zé)任編輯：吳曉麗

【作者單位：中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院神經(jīng)科學(xué)研究所】