接觸性DNA檢驗(yàn)現(xiàn)狀與展望

吳 婷，牛青山，王金換，溫文嬌

（1.湖南警察學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410138；2.中國(guó)刑警學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)110035）

鑒定綜述
R e v i e w

接觸性DNA檢驗(yàn)現(xiàn)狀與展望

吳 婷1，牛青山2，王金換2，溫文嬌2

（1.湖南警察學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410138；2.中國(guó)刑警學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)110035）

隨著犯罪嫌疑人的反偵查意識(shí)及能力加強(qiáng)，接觸性檢材在現(xiàn)場(chǎng)提取檢材中所占的比重越來(lái)越大，現(xiàn)場(chǎng)接觸性DNA在案件偵破中發(fā)揮的作用也日漸明顯。由于人在接觸物體后，會(huì)在物體表面留下相應(yīng)的微量接觸性DNA，對(duì)這類接觸性檢材的檢驗(yàn)分析是目前法醫(yī)物證檢驗(yàn)工作的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。對(duì)接觸性檢材的現(xiàn)場(chǎng)發(fā)現(xiàn)、前期處理及DNA的提取方法、擴(kuò)增方法、電泳以及結(jié)果分析等方面對(duì)其檢驗(yàn)研究進(jìn)展綜述。希望能夠?yàn)閭刹閷?shí)戰(zhàn)工作在接觸類檢材的現(xiàn)場(chǎng)發(fā)現(xiàn)，提取以及成功檢測(cè)分型方面提供方法和思路。展望：首先，關(guān)于接觸性檢材的分類按接觸物體表面質(zhì)地分更為合理，因?yàn)闈撛贒NA轉(zhuǎn)移的發(fā)生，與物體表面質(zhì)地及樣本的濕度密切相關(guān)，而且檢材的表面質(zhì)地很大程度上影響實(shí)驗(yàn)者提取方法的選擇；其次，現(xiàn)勘人員應(yīng)該及時(shí)出現(xiàn)場(chǎng)并且能結(jié)合案情科學(xué)地提取、包裝并運(yùn)送檢材；再次，我們?cè)谔幚斫佑|類檢材必須做到檢驗(yàn)時(shí)突出重點(diǎn)部位、選擇合適的檢驗(yàn)策略與方案；最后，根據(jù)接觸性檢材的檢測(cè)結(jié)果下鑒定意見(jiàn)時(shí)應(yīng)十分謹(jǐn)慎。

法醫(yī)遺傳學(xué)；接觸性DNA；微量物證；DNA提?。籔CR；STR分型

接觸DNA雖然微量但是側(cè)重于DNA的來(lái)源，因此并不等同于微量DNA（trace DNA、LCN或Lt DNA）。Gill等［6］認(rèn)為微量DNA的模板量小于100pg；Caddy等［7］認(rèn)為界定微量DNA模板量的標(biāo)準(zhǔn)為200pg；而Budowle等［8］報(bào)道由于DNA定量方法有差異，LCN分型應(yīng)定義為正常閾值之下的分析結(jié)果；Gill等［9］后來(lái)發(fā)表類似于Budowle的觀點(diǎn)。由于在實(shí)際刑事案件中接觸性DNA的樣本原始情況脆弱且DNA含量很少，對(duì)這類樣本進(jìn)行STR分型時(shí)仍需遵循微量DNA的分析方法。

1　接觸性DNA檢驗(yàn)的研究現(xiàn)狀

1.1接觸性DNA檢材的現(xiàn)場(chǎng)發(fā)現(xiàn)

在案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)，接觸性檢材與常規(guī)生物檢材如血痕、精斑相比，肉眼觀察很難判斷脫落細(xì)胞是否存在及其在載體上的具體部位、數(shù)量的多少。楊電等［10］研究表明用于指紋顯現(xiàn)的茚三酮薰顯技術(shù)可用于指導(dǎo)案件中人體脫落細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)采集。而作為法醫(yī)現(xiàn)勘必備的多普勒光源，蔡能斌等［11］報(bào)道經(jīng)波長(zhǎng)為266 nm的紫外光照射后，會(huì)嚴(yán)重影響指紋脫落細(xì)胞的DNA檢驗(yàn)，但對(duì)血跡、唾液斑、有毛囊的毛發(fā)的DNA檢驗(yàn)影響較小。因此在現(xiàn)場(chǎng)勘查尋找發(fā)現(xiàn)接觸性檢材過(guò)程中應(yīng)慎用紫外激光。張?zhí)煜榈龋?2］報(bào)道了現(xiàn)場(chǎng)生物物證發(fā)現(xiàn)的指導(dǎo)策略，提供了一個(gè)系統(tǒng)的勘查思維。在接觸性DNA中應(yīng)特別小心避免二次接觸的污染和轉(zhuǎn)移。現(xiàn)場(chǎng)發(fā)現(xiàn)接觸性的有效生物物證后，對(duì)其包裝和運(yùn)送同樣會(huì)對(duì)接觸性DNA的檢測(cè)成功率產(chǎn)生巨大影響，因此現(xiàn)勘人員除了做必要防護(hù)措施，如戴口罩帽子手套，還要不輕易觸碰此類檢材，包裝時(shí)更要小心輕柔，必要時(shí)分區(qū)域包裝。

1.2接觸性DNA檢材的前期處理及DNA提取

1.2.1剪取法

煙蒂、紙巾、口香糖、甘蔗渣、檳榔渣等這類脫落細(xì)胞相對(duì)量大的載體檢材，可直接剪取適量放入EP管，例如，煙蒂可剪取過(guò)濾嘴的外層紙片大小約為1mm×5mm，口香糖剪取 1/2米粒大?。徊秃蟛磷旒埧杉羧〔潦貌课淮笮〖s5mm×5mm［4］。類似剪取法的還有陳曉暉等［13］報(bào)道的割取法提取一次性牙刷上的脫落細(xì)胞進(jìn)行 STR分型效果良好，放置時(shí)間越長(zhǎng)的牙刷，檢出率越低。

1.2.2擦拭法

第四，1988年推行政治體制改革后，戈?duì)柊蛦谭驅(qū)μK聯(lián)政治形勢(shì)的發(fā)展在相當(dāng)程度上處于失控狀態(tài)，被牽著鼻子走，不得不把主要精力花在處理不斷出現(xiàn)的社會(huì)政治問(wèn)題上。僅1988年一年，就開了八次中央全會(huì)、兩次人民代表大會(huì)、兩次最高蘇維埃會(huì)議。在這樣的情況下，不可能集中精力來(lái)抓經(jīng)濟(jì)和經(jīng)濟(jì)改革問(wèn)題。另外，在批判舊的政治體制時(shí)，又過(guò)多地糾纏歷史舊賬，強(qiáng)調(diào)不留歷史“空白點(diǎn)”，引發(fā)出一場(chǎng)又一場(chǎng)的大爭(zhēng)論，在爭(zhēng)論中又缺乏正確引導(dǎo)，導(dǎo)致對(duì)歷史否定過(guò)頭、人們思想混亂、黨的威信急劇下降，最終蘇共垮臺(tái)，使改革失去了堅(jiān)強(qiáng)的政治領(lǐng)導(dǎo)核心。對(duì)出現(xiàn)的民族問(wèn)題的復(fù)雜性、尖銳性又估計(jì)不足。這些情況，對(duì)蘇聯(lián)解體都起了作用。

飲料瓶口、果核、電話，工具握柄等這類載體檢材，可采用二步擦拭法［14］提取脫落細(xì)胞。Sukanya等［15］報(bào)道采用不同的拭子和濕潤(rùn)劑的組合，從膠帶上脫落細(xì)胞中收集到DNA的量不同。Jennifer等［16］研究了志愿者洗手2小時(shí)后用主手食指在無(wú)菌塑料板上按了指紋，使用尼龍植絨拭子和直接PCR獲得完整的STR DNA圖譜，且尼龍拭子優(yōu)于海綿拭子，海綿優(yōu)于棉簽。

1.2.3吸附法

衣服、褲子，鞋子、帽子、手套等滲透性檢材可采用吸附法提取脫落細(xì)胞。如衣服、褲子類載體，用脫落細(xì)胞提取儀充分在衣領(lǐng)、袖口、腋窩、褲頭、口袋入口等直接接觸人體皮膚處吸取，手套類載體，翻轉(zhuǎn)后吸取內(nèi)面的掌指部位，從脫落細(xì)胞提取儀上取下的三層濾膜分別用三個(gè)EP管處理。Goray等［17］報(bào)道與非滲透性載體相比，皮膚脫落細(xì)胞更容易沉積在滲透性載體上，而且滲透性載體不易發(fā)生二次轉(zhuǎn)移。邵武等［18］研究表明負(fù)壓吸附法，因具有良好的脫落細(xì)胞富集能力從而提高脫落細(xì)胞檢材的檢驗(yàn)成功率。胡偉等［19］報(bào)道當(dāng)載體受潮致人體脫落細(xì)胞浸潤(rùn)載體后，即使是吸塵器法也因無(wú)法吸附足夠的人體脫落細(xì)胞而無(wú)法檢測(cè)成功，而采用改良標(biāo)準(zhǔn)QIAamp DNA Mini Kit法一次性過(guò)柱為反復(fù)多次過(guò)柱，能實(shí)現(xiàn)收集消化液中所有的DNA。

1.2.4粘取法

粘取法主要指利用膠帶或粘取器粘取的方法，趙春鶴等［20］發(fā)明的粘取器成功收集到粘附在衣服袖口、剪刀柄、水杯、手表，手套、鞋帶、拖鞋等20多份不同載體上的脫落細(xì)胞，并成功檢驗(yàn)分型。Daly等［21］認(rèn)為接觸性DNA用小膠帶粘取的收集檢測(cè)成功率，在木質(zhì)，紡織物，玻璃三種載體依次降低。巴華杰等［22］研究表明對(duì)表面積較大的檢材，分區(qū)檢驗(yàn)尤為重要，而采用先粘取表層，再吸取的方式，可以降低了背景DNA的影響，從而獲得了單一DNA分型結(jié)果。田蕊等［23］研究顯示EZ-Tape分區(qū)粘取法與真空負(fù)壓吸引法相比，更有針對(duì)性，能夠減少混STR峰型出現(xiàn)的幾率。

1.2.5單細(xì)胞顯微捕獲

胡蘭等［24］報(bào)道目前獲取微量甚至單個(gè)細(xì)胞的方法主要有流式細(xì)胞儀分離法、激光捕獲顯微切割分離法、顯微操作儀捕獲法等。顯微捕獲技術(shù)的關(guān)鍵在于鏡下上皮細(xì)胞和皮膚脫落細(xì)胞的準(zhǔn)確區(qū)分。該技術(shù)的基礎(chǔ)在于人體不同部位被覆的上皮細(xì)胞是有區(qū)別的，如口腔、食道和陰道等腔面與皮膚表皮，前三者被覆的是未角化的復(fù)層扁平上皮細(xì)胞，有胞核，且胞質(zhì)內(nèi)含角蛋白少；而后者淺表細(xì)胞為角化的復(fù)層扁平上皮，無(wú)細(xì)胞核，且胞質(zhì)內(nèi)充滿角蛋白［25］。顧麗華等［26］利用激光捕獲顯微切割分離獲得了7～8個(gè)細(xì)胞的成功分型。曾憲海等［27］采用激光顯微切割技術(shù)、PALM系統(tǒng)收集接觸性檢材上的目標(biāo)細(xì)胞。但是此方法操作繁瑣，儀器及技術(shù)要求更高，目前不能普遍應(yīng)用于基層DNA實(shí)驗(yàn)室。

1.2.6DNA的提取

成功檢測(cè)接觸性檢材的關(guān)鍵在于能否收集到盡可能多的脫落細(xì)胞用于DNA的提取。除了在檢驗(yàn)時(shí)要突出重點(diǎn)部位，還要合理評(píng)估并恰當(dāng)選擇微量DNA的提取方法。在國(guó)內(nèi)外，有許多方法被報(bào)道應(yīng)用于接觸性DNA的提取及純化，概括起來(lái)有Chelex法、磁珠法、有機(jī)溶劑法（有機(jī)法）、過(guò)柱法、硅珠法、硅膠膜法等。其中磁珠法還有半定量作用，7μL IQ磁珠約吸附100 ng的DNA。牛青山等［28］應(yīng)用抗-DNA單克隆抗體免疫膠體金技術(shù)從溶液中直接捕獲微量DNA，形成DNA--免疫膠體金復(fù)合物沉淀，直接用于PCR反應(yīng)，極大地提高了微量生物檢材DNA的檢測(cè)成功率。楊電等［29］報(bào)道采用小體積Chelex-100法可對(duì)60%左右的微量口腔脫落細(xì)胞檢材提取DNA并進(jìn)行STR分型。而姚建等［30］采取增加取材量和在1.5mL離心管中大體系消化后用硅珠法純化DNA，能顯著提高檢驗(yàn)成功率。

Sewell等［31］報(bào)道在對(duì)紙張接觸性DNA的提取上，DNeasy plant mini kit（QIAGEN）比QIAamp mini kit.更具優(yōu)勢(shì)，某些紙張例如報(bào)紙，雜志，濾紙比普通辦公打印紙檢測(cè)成功率更高。楊電等［32］報(bào)道分別采用 95℃、70℃直接裂解和 TNE、SDS、PK預(yù)消化方式進(jìn)行前處理接觸性檢材，磁珠法提取 DNA，有助于提高檢驗(yàn)成功率。劉海渤等［33］報(bào)道磁珠法和改良磁珠法（MagAttract DNA MiniM48+Carrier RNA（cRNA））均能有效檢測(cè)接觸性檢材脫落細(xì)胞DNA，后者更優(yōu)。其中，劉海渤研究結(jié)果的分型成功的標(biāo)準(zhǔn)是獲得個(gè)體性別基因座和9個(gè)STR基因座的明確基因型。

楊電［34］比較研究了經(jīng)Chelex法、DNA IQ磁珠法、EQ國(guó)產(chǎn)磁珠法、有機(jī)法、Microcon過(guò)柱法等5種DNA提取純化方法處理后，進(jìn)行PCR定量，每種DNA提取純化方法對(duì)接觸性DNA的回收率。楊電等［35］報(bào)道大部分接觸DNA檢材采用DNA IQ磁珠法結(jié)合MaxwellTM16自動(dòng)儀可提取到足以進(jìn)行STR分型的DNA。有報(bào)道國(guó)產(chǎn)磁珠結(jié)合自動(dòng)化工作站批量提取接觸細(xì)胞檢材的成功率較低，故不提倡使用。

1.3接觸性DNA的擴(kuò)增方法

正確的提取方法決定了檢驗(yàn)是否成功，而接觸性DNA微量，應(yīng)該選取適用的擴(kuò)增方法，以達(dá)到最好的檢驗(yàn)結(jié)果。接觸DNA進(jìn)行STR檢驗(yàn)時(shí)，對(duì)PCR條件進(jìn)行改良，通過(guò)增加循環(huán)數(shù)、梯度擴(kuò)增、模板濃縮、優(yōu)化引物、調(diào)整反應(yīng)體系、延長(zhǎng)退火時(shí)間、改良緩沖體系、增加聚合酶量、使用針對(duì)降解DNA和微量DNA設(shè)計(jì)的mini-STR試劑盒等不同的方法來(lái)提高檢驗(yàn)的靈敏度。

一般來(lái)說(shuō)，通過(guò)增加PCR循環(huán)數(shù)，低至100pg的DNA樣本均能獲得STR分型結(jié)果。Sangeeta等［36］報(bào)道接觸DNA樣本中，LCN型（增加額外循環(huán)）和miniSTR聯(lián)用的策略可得到滿意的結(jié)果。Luke等［37］認(rèn)為使用28循環(huán)+純化+多進(jìn)樣的方法能得到相同或更好的數(shù)據(jù)。NFI改良了28次循環(huán)的實(shí)驗(yàn)方案，他們?cè)?8次循環(huán)之后，加入新鮮的DNA聚合酶，繼續(xù)擴(kuò)增6次［38］。這種28+6的方法使我們能檢測(cè)到28次循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物，從而避免34次強(qiáng)化循環(huán)生成的過(guò)量DNA用于檢測(cè)。Seung等［39］報(bào)道低溫退火及延伸的步驟會(huì)降低stutter比例，低溫PCR：Identifiler擴(kuò)增，32循環(huán)，56度退火，56度延伸。

直接擴(kuò)增法在接觸性檢材上的運(yùn)用也有報(bào)道，毛坤云等［40］報(bào)道載體法可提高微量生物檢材中DNA檢出率。商業(yè)化的直擴(kuò)試劑盒具有抗污染能力強(qiáng)，擴(kuò)增時(shí)間短，適應(yīng)檢材廣泛等特點(diǎn)。李長(zhǎng)征等［41］研究表明Identifiler Direct試劑盒直擴(kuò)法用于接觸性DNA成功率明顯高于常規(guī)Chelex提取法。

全基因組擴(kuò)增（whole genome amplificationWGA）技術(shù)。Lasken等［42］報(bào)道對(duì)納克級(jí)別的微量樣本而言，WAG技術(shù)可能在一定程度上能達(dá)到富集樣本的目的，但在皮克級(jí)別，其并非良策。該實(shí)驗(yàn)成本較高，無(wú)法在基層實(shí)驗(yàn)室普及使用。

1.4接觸性DNA的電泳及結(jié)果分析

在電泳時(shí)，通過(guò)增大注樣電壓和延長(zhǎng)注樣時(shí)間，提高毛細(xì)管電泳的PCR產(chǎn)物進(jìn)樣量，也能提升檢測(cè)靈敏度。另外，還有關(guān)于PCR產(chǎn)物純化的方法，使毛細(xì)管電泳的信號(hào)得以增強(qiáng)。由于通過(guò)電動(dòng)進(jìn)樣，注入毛細(xì)管電泳儀的DNA的量與樣品中的鹽含量成反比，因此PCR產(chǎn)物的純化這一步就是為了降低電泳前樣品中鹽含量。目前，實(shí)驗(yàn)室普遍采用的是低導(dǎo)電性的甲酰胺稀釋樣本。也有專門的試劑盒供選擇，如：MinElute試劑盒（QIAGEN）、Montage試劑盒（Millipore）、Performa DTR凝膠濾柱（Edge BioSystems）。

接觸性材作為低拷貝（LCN）DNA中的一種，檢出結(jié)果可能出現(xiàn)等位基因漏檢、插入、不均衡擴(kuò)增等現(xiàn)象，因此在判斷接觸性檢材STR分型時(shí)必須謹(jǐn)慎，要觀察等位基因的RFU值、信噪比，同時(shí)應(yīng)該設(shè)置陽(yáng)性、陰性對(duì)照來(lái)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠程度。Sangeeta等［43］認(rèn)為重復(fù)分型結(jié)果的比較用可來(lái)識(shí)別偽峰，并提供一個(gè)完善的圖譜，重復(fù)擴(kuò)增確認(rèn)一致性是必需的。在進(jìn)行接觸性檢材DNA結(jié)果報(bào)告時(shí)可以參照J(rèn)ohn［38］的微量DNA樣本分析的注意事項(xiàng)和挑戰(zhàn)。

2　接觸性微量物證DNA檢驗(yàn)存在的不足及展望

國(guó)內(nèi)外對(duì)于接觸性DNA檢驗(yàn)的研究做了大量工作，但是接觸性檢材的檢驗(yàn)成功率仍然不高。首先，對(duì)現(xiàn)場(chǎng)接觸性檢材的發(fā)現(xiàn)不能做到及時(shí)或有效，現(xiàn)勘人員應(yīng)該及時(shí)出現(xiàn)場(chǎng)并且能結(jié)合案情科學(xué)地提取、包裝并運(yùn)送檢材。其次，對(duì)于極微量的接觸性檢材沒(méi)有完全行之有效的提取方法，在處理接觸類檢材必須做到檢驗(yàn)時(shí)突出重點(diǎn)部位、選擇合適的檢驗(yàn)策略與方案。目前，接觸性檢材所含DNA可以用于成功檢測(cè)的量的范圍并無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。最后，對(duì)于接觸性檢材的結(jié)果分析仍然是難點(diǎn)，并且由接觸性檢材DNA模板分析獲得的圖譜，也未必與案件有關(guān)，有可能是案發(fā)前就已遺留，所以根據(jù)接觸性檢材的檢測(cè)結(jié)果下鑒定意見(jiàn)應(yīng)十分謹(jǐn)慎。

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（本文編輯：李成濤）

Advances in Touch DNA Testing

WU Ting1，NIU Qing-shan2，WANG Jin-huan2，WEN Wen-jiao2
（1.Hunan Police Academy，Changsha 410138，China；2.National Police University of China，Shenyang 110035，China.）

With the increasing counter-investigation awareness and capacity of criminals，touch DNA has larger proportion in the samples collected at crime scenes，and is gradually playing a more obvious role in solving cases.People leave trace DNA on the surface when they touch an object.The touch DNA testing is the focus and difficulty of forensic biology research.The authors review the studies of touch DNA in the following aspects:the discovery and dispose of contact samples on the scene，the method for DNA extraction and amplification，electrophoresis，and analysis methods.Moreover，the authors rasies their own opinions:First，it is more reasonable to classify the touch DNA by the surface texture of the objects，not only because the transfer of potential DNA is closely related to the material quality and the humidity of samples，but also because the material quality greatly affects the choice of extraction methods.Secondly，the investigators should arrive at the crime scene in time，and collect，pack and submit the samples scientifically under specific conditions. Thirdly，the analysts must know the key parts in examination，and choose appropriate analyzing methods.Lastly，the conclusions drawn from the testing result of touch DNA should be very cautious.

forensic genetics；touch DNA；trace biological evidence；DNA extraction；PCR；STR genotype

DF795.4

Adoi:10.3969/j.issn.1671-2072.2016.05.011

1671-2072-（2016）05-0066-05

2016-03-21

吳婷（1988—），女，助教，碩士，主要從事法醫(yī)物證學(xué)研究。E-mail:ya.tsing@163.com。