系統(tǒng)毒理學
——法醫(yī)毒物學發(fā)展的機遇與挑戰(zhàn)

沈敏，嚴慧，施妍，向平

（司法部司法鑒定科學技術(shù)研究所上海市法醫(yī)學重點實驗室上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務平臺，上海200063）

鑒定綜述
R e v i e w

系統(tǒng)毒理學
——法醫(yī)毒物學發(fā)展的機遇與挑戰(zhàn)

沈敏，嚴慧，施妍，向平

（司法部司法鑒定科學技術(shù)研究所上海市法醫(yī)學重點實驗室上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務平臺，上海200063）

隨著生命科學新理論和新技術(shù)的發(fā)展和滲透，形成了基于基因組學、蛋白組學和代謝組學等組學技術(shù)的系統(tǒng)毒理學，賦予法醫(yī)毒物學新的研究平臺，使之從研究思路、方法和理念發(fā)生了根本性轉(zhuǎn)變。綜述了組學技術(shù)及其在法醫(yī)毒物學領(lǐng)域的研究進展，以及組學技術(shù)發(fā)展和應用亟待突破的方法標準化、組學數(shù)據(jù)庫和多組學信息集成等關(guān)鍵問題，提出法醫(yī)毒物學研究應更加注重人群研究和應用價值。系統(tǒng)毒理學有望在探索毒物代謝酶的基因多態(tài)性與毒物代謝規(guī)律之間的關(guān)系、闡明毒物對機體毒性作用和機制、尋找中毒相關(guān)生物標志物，以及確定毒性劑量閾值等方面取得突破，是法醫(yī)毒物學未來發(fā)展的機遇與挑戰(zhàn)。

法醫(yī)毒物學；系統(tǒng)毒理學；組學；基因組學；蛋白組學；代謝組學

法醫(yī)毒物學是研究毒物的來源、性質(zhì)、體內(nèi)變化、毒性、作用機制及其與生物體、外界環(huán)境之間的相互關(guān)系，并為司法實踐提供科學依據(jù)的一門學科。評價所涉毒物對行為能力的損傷程度或?qū)χ卸?死亡的參與程度，給出科學、合理的結(jié)果解釋是法醫(yī)毒物學研究與實踐的核心問題，而闡明毒物與機體交互作用對毒性作用的影響以及生物標志物研究是學界關(guān)注的重點。隨著生命科學新理論和新技術(shù)的飛速發(fā)展和不斷滲透，“系統(tǒng)毒理學（systems toxicology）”概念和“組學（omics）”技術(shù)應運而生，賦予法醫(yī)毒物學新的研究平臺，使之從研究思路、方法和理念發(fā)生了根本性轉(zhuǎn)變。

1　系統(tǒng)毒理學及其組學技術(shù)

“系統(tǒng)毒理學”由系統(tǒng)生物學的概念和內(nèi)涵演變而來［1］。人類基因組計劃完成后，誕生了在系統(tǒng)水平上研究生命的結(jié)構(gòu)、功能和調(diào)節(jié)網(wǎng)絡的科學——系統(tǒng)生物學，其強調(diào)生命過程應該作為統(tǒng)一整體來研究，而不是各部分的簡單加和。外源性化學物質(zhì)進入機體以后，并非遵循單一機制，而是作用于細胞、組織、器官不同水平的分子網(wǎng)絡體系，毒性則是機體網(wǎng)絡系統(tǒng)對外源性化學物質(zhì)應激源免疫、代償后表現(xiàn)的不良結(jié)局。于此，基于系統(tǒng)生物學整體思路的系統(tǒng)毒理學應運而生。系統(tǒng)毒理學是通過了解機體暴露后在不同劑量、不同時點的基因表達譜、蛋白質(zhì)譜和代謝物譜的改變以及傳統(tǒng)毒理學的研究參數(shù)，借助生物信息學和計算毒理學技術(shù)對其進行整合，從而系統(tǒng)地研究外源性化學物質(zhì)和環(huán)境應激等與機體相互作用的一門學科。

系統(tǒng)毒理學主要包括組學技術(shù)和計算毒理學兩大部分［2-3］。組學一詞源于拉丁文后綴“-ome”，指一個組或群，目前把對細胞內(nèi)RNA、DNA、蛋白質(zhì)、代謝中間產(chǎn)物的整體分析手段稱為組學技術(shù)，主要包括基因組學（genomics）、蛋白質(zhì)組學（proteomics）及代謝組學（metabolomics）等。組學技術(shù)平臺的建立得益于高通量分子生物學技術(shù)、分析化學技術(shù)和生物信息學的發(fā)展。新一代測序技術(shù)、基因表達譜分析、實時定量聚合酶鏈式反應（PCR）技術(shù)促進了基因組學的發(fā)展；蛋白質(zhì)芯片、高通量蛋白分離分析技術(shù)極大地擴展了蛋白組學的內(nèi)涵；新型質(zhì)譜和核磁共振對體內(nèi)代謝變化的精確分析和鑒定，推動了代謝組學的進步；體外高通量實驗，為測定大批量化合物提供可能?；诮M學技術(shù)的系統(tǒng)毒理學的發(fā)展，不僅依賴于高通量測量技術(shù)的進步，更重要的是對海量數(shù)據(jù)的收集、整理，建立量化的數(shù)據(jù)驅(qū)動的模型以便理解細胞內(nèi)不同層次調(diào)控的相互作用，從而抽提出各層次間相互作用的信息，以實現(xiàn)對相關(guān)數(shù)據(jù)的解讀。

由于組學技術(shù)可從基因型到表現(xiàn)型不同層次揭示外源性化學物質(zhì)與機體相互作用的機制和規(guī)律，故有望成為解決生命科學相關(guān)領(lǐng)域科學問題的有效工具。

1.1基因組學

基因組學包括以全基因組測序為目標的結(jié)構(gòu)基因組學（structural genomics）和以基因功能鑒定為目標的功能基因組學（functional genomics）。毒物基因組學（toxicogenomics）來源于毒理學與基因組學的交叉與整合，是將基因組學的理論與技術(shù)應用于毒理學的一門新興學科。毒物基因組學的研究目標是闡明外來毒性物質(zhì)對基因活性和基因產(chǎn)物的影響及相互作用。毒物基因組學的基本方法是通過觀察生物在接觸毒物后基因表達譜的變化，篩選毒性相關(guān)基因、揭示毒作用的基因表達譜、快速篩選毒物、篩選和檢測基因多態(tài)性、檢測基因突變、進行安全性評價等，從而解決化學物質(zhì)的聯(lián)合作用、高通量篩選對人體有毒性作用或者潛在毒性作用的化學物質(zhì)、研究毒作用機制等毒理學研究的關(guān)鍵問題。近十幾年來，已出版了多本毒物基因組學專著，如Toxicogenomics（Inoue，2002）、Handbook of Toxicogenomics:StrategiesandApplications（Borlak，2005）、Toxicogenomics and Proteomics（Valdes，2004）等，表明毒物基因組學發(fā)展迅速，受到人們的普遍關(guān)注［4］。

毒物基因組學可應用于［5-6］：（1）毒性預測及毒作用機制。傳統(tǒng)毒理學的動物實驗所獲反映毒性終點的各種表型改變、形態(tài)學指標等通常較為復雜、間接，而基因組學提供了更加靈敏、全面的機制研究方法。利用基因組學技術(shù)進行基因表達譜的分析，可以有效監(jiān)測接觸有害物質(zhì)后基因水平的改變，可通過化學結(jié)構(gòu)的相似性和基因表達模式的匹配性來確定未知毒物的作用機制。轉(zhuǎn)錄譜技術(shù)實現(xiàn)了生物樣本中基因轉(zhuǎn)錄活性的定量測量，推進了毒物毒性機制的研究，并有利于新的或者未知化合物的毒性預測。（2）劑量-反應關(guān)系評價。傳統(tǒng)毒理學方法在對某些劑量-反應關(guān)系曲線的解釋上存在欠缺，尤其是確定低劑量水平下化學物質(zhì)的毒性作用，而基因組學技術(shù)為評價包括非線性模式在內(nèi)的多種量效關(guān)系模式提供了更為有效、準確、快捷的方法。（3）毒性作用種屬間的外推。傳統(tǒng)的毒理學實驗模式所給予的毒物劑量遠遠大于人的真實暴露水平，且所用動物模型的種屬差異，其結(jié)果并不適宜外推至人。應用基因組學技術(shù)可以很大程度地改善實驗結(jié)果由動物外推至人時所產(chǎn)生的誤差，更真實地反映暴露水平下人體對外源性化學物質(zhì)的反應；可通過比較不同物種間的基因表達譜尋找與人類最接近的實驗動物，使毒理學研究更接近人類實際情況。（4）生物標志物、基因多態(tài)性與易感性。生物標志物包括接觸生物標志物、效應生物標志物及易感性生物標志物，可闡明毒物接觸與人體損害之間的關(guān)系，是毒理學的研究重點。利用基因組學技術(shù)探測基因突變位點及對基因多態(tài)性進行分類，對于確定易感人群，進行毒物毒性作用的個體評價具有重要價值。（5）毒物的聯(lián)合毒性效應。人類經(jīng)常同時接觸多種毒性物質(zhì)，不同毒物之間可能產(chǎn)生協(xié)同、相加或拮抗等交互作用。傳統(tǒng)毒理學通常都是對單個毒物的毒性作用進行研究，簡單地將一系列單一物質(zhì)的實驗結(jié)果用于解釋混合物的作用效應是不合理的?；蚪M學技術(shù)通過將混合物作用下基因表達的改變與單一化學物作用下基因表達的改變作比較，可明確交互作用的類型和規(guī)律。

1.2蛋白組學

蛋白質(zhì)組是指由基因組表達產(chǎn)生的所有相應的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學多應用大規(guī)模蛋白質(zhì)分離和識別技術(shù)研究蛋白質(zhì)組。蛋白質(zhì)組學的研究策略有兩種：一種是完全蛋白組學，目的是檢測一種細胞類型或一種組織內(nèi)基因組所表達的全部蛋白質(zhì)；另一種是差異蛋白質(zhì)組學，主要是篩選和鑒定不同種類或狀態(tài)下各樣本之間蛋白質(zhì)組的區(qū)別與變化。毒物蛋白質(zhì)組學整合了經(jīng)典毒理學、病理學和蛋白質(zhì)差異表達分析技術(shù)，通過比較特定細胞、組織或器官在毒物作用前后的蛋白質(zhì)表達譜的變化，篩選出毒物相關(guān)的特征性表達蛋白，再通過抗體分析技術(shù)可發(fā)現(xiàn)新的毒性蛋白標志物，利用這些標志物能夠?qū)崿F(xiàn)在安全劑量下進行人體作用機制的研究。

毒物蛋白組學研究的核心技術(shù)為蛋白質(zhì)組分分離技術(shù)、蛋白質(zhì)組分的鑒定技術(shù)以及利用蛋白質(zhì)信息學進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能分析及預測。主要研究手段是采用高通量的分析方法，如二維凝膠電泳/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（2DE-MS）、液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LCMS）以及蛋白芯片技術(shù)（protein chips）等。定量蛋白質(zhì)組學可以檢測機體或組織在正常狀態(tài)與外界刺激（疾病或中毒等）狀態(tài)下所表達的蛋白質(zhì)在量上的差別，是蛋白質(zhì)組學研究的熱點［7］?；诙喾N高效富集技術(shù)（磁性微球和免疫親和）和質(zhì)譜技術(shù)的定量蛋白質(zhì)組學研究方法擁有高通量和高靈敏度的特點，可以準確檢測在復雜體系中的低豐度蛋白質(zhì)。

由于蛋白質(zhì)是生命體功能的執(zhí)行者和體現(xiàn)者，故蛋白質(zhì)組研究可以很好地彌補基因組研究中基因表達時空差異的缺陷，直接指向影響表型的蛋白質(zhì)。蛋白組學技術(shù)的建立和應用，為生物標志物的探尋提供了有效的工具。蛋白質(zhì)組研究所獲信息具有動態(tài)性、時間性、空間性和特異性，更能在細胞和生命的整體水平上闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)和活動規(guī)律。

1.3代謝組學

代謝組學的研究對象是生命活動鏈條下游的代謝物的集合。代謝組可以認為是一個細胞、組織、器官或者一個生物體在某一特定狀態(tài)下的所有內(nèi)源性小分子代謝產(chǎn)物的集合。代謝物包括分子大小、結(jié)構(gòu)、極性和功能都各不相同的多種小分子化合物，如氨基酸、糖、有機酸、脂肪酸、核苷、核苷酸等，是細胞內(nèi)各種生物學途徑和代謝過程的終產(chǎn)物，直接反映了生命活動的整體狀態(tài)和功能，以及其動態(tài)變化過程。代謝組學通過系統(tǒng)研究代謝組的組成和變化規(guī)律，從而揭示機體新陳代謝活動本質(zhì)的學科［8］。

代謝組學研究是利用各種高通量分析化學方法對生物體液、細胞或組織進行系統(tǒng)分析，對其中的內(nèi)源性小分子代謝產(chǎn)物的組成、含量及其隨時間的變化進行定性和定量分析，并利用模式識別方法對這種變化進行分類和預測，進而對機體的整體的生物學狀況和功能做出評價。由于代謝組所包含的分子種類及其濃度范圍的復雜性，任何單一的技術(shù)手段都不足以對一個特定對象進行全面的研究，只有通過組合不同的分析技術(shù)，才能夠比較全面地了解一個特定的代謝組所包含的內(nèi)容。目前代謝組學研究常用核磁共振（NMR）和質(zhì)譜技術(shù)，其中質(zhì)譜技術(shù)主要包括電子轟擊質(zhì)譜（EI/MS）、電噴霧電離質(zhì)譜（ESI/MS）、串聯(lián)質(zhì)譜（tandem MS）、飛行時間質(zhì)譜（TOF/ MS）、傅里葉變換質(zhì)譜（FTMS）等。

代謝組學研究同樣需借助于信息學平臺，將多維、分散的數(shù)據(jù)進行總結(jié)、分類及判別分析，發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)間的定性、定量關(guān)系，解讀數(shù)據(jù)中蘊藏的生物學意義。主成分分析法（principal components analysis，PCA）是最常用的分析方法。其他的模式識別技術(shù)，如族類分析（hierarchical clusteranalysis，HCA）、簇類獨立軟模式法（soft independent modeling of class analogy，SIMCA）、偏最小二乘法－判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）、非線性映射分析（nonlinear mapping，NLM）及人工神經(jīng)元網(wǎng)絡（artificial neuronal network，ANN）等在代謝組學研究中亦能發(fā)揮其重要作用。

代謝組學通過對與毒性作用機制密切相關(guān)的生物體中內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的動態(tài)定性定量分析，可發(fā)現(xiàn)由毒物作用引起的異常代謝變化，獲得毒物毒性效應、作用機制和生物標志物的信息。（1）毒物毒性的評價。通過研究生物體整體代謝變化，篩選出毒物作用后特征性表達的代謝物群，可以準確、快速、敏感反映外源性化合物對生物體的毒性作用，該技術(shù)目前已廣泛應用于新藥的毒性評價。（2）毒物作用靶器官及相應的生物標志物。代謝物組成的變化可以直接反映毒物對機體造成的影響，快速分析多條代謝通路，幫助定位毒物作用靶器官及尋找相應的生物標志物。（3）毒物作用機制的研究。代謝組學可在整體水平上靈敏、全面的檢測機體在毒物作用后各種代謝物的濃度、流量及相互比例的變化，從而協(xié)助對毒物作用機制進行解析。（4）物質(zhì)濫用及成癮研究。物質(zhì)濫用對機體代謝物產(chǎn)生一定具有特異性和可重復性的影響，代謝組學通過分析相關(guān)代謝物的變化，可篩選毒品成癮的特異性生物標志物，評價毒品濫用程度，推斷濫用史或復吸史。

1.4計算毒理學

組學技術(shù)的發(fā)展，不僅依賴于高通量測量技術(shù)的進步，更重要的是對海量數(shù)據(jù)的處理。計算毒理學可為大數(shù)據(jù)的處理和分析提供有效的手段。計算毒理學是一廣義術(shù)語，涵蓋所有與毒理學相關(guān)的計算機輔助信息學、數(shù)據(jù)挖掘及計算模擬技術(shù)等，涉及計算化學、分子生物學、計算生物學（生物信息學）和系統(tǒng)生物學等學科［9-11］。隨著系統(tǒng)毒理學實驗數(shù)據(jù)的增多，計算毒理學已突破傳統(tǒng)的理念和方法體系，故有學者提出計算系統(tǒng)毒理學的概念［2］。其主要研究內(nèi)容包括:（1）通過對化合物暴露高通量實驗數(shù)據(jù)的挖掘，得到化合物影響復雜生命體和環(huán)境的相關(guān)知識庫；（2）通過構(gòu)建毒理組學網(wǎng)絡模型，并用數(shù)學方法表示和模擬中間過程，全面理解外源物致毒的中間機制；（3）發(fā)展具有預測功能的毒理學綜合模型，以期定量全面評估化合物的安全性。計算毒理學構(gòu)建計算模型的基礎(chǔ)是高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，同時也需要其他化學組學相關(guān)數(shù)據(jù)庫如化合物-基因-疾病關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫CTD、毒物-靶標數(shù)據(jù)庫T3DB、化合物-蛋白關(guān)系數(shù)據(jù)庫Chemprot、STITCH、ChEMBL、BindingDB等，及傳統(tǒng)毒理學數(shù)據(jù)庫來豐富信息空間。與國外成果豐碩的研究現(xiàn)狀相比，我國計算毒理學研究尚處于發(fā)展初期，體外高通量篩選數(shù)據(jù)的分析方法、計算預測模型的構(gòu)建方法等都還處于探索階段。

2　組學技術(shù)在法醫(yī)毒物學領(lǐng)域研究進展

評價所涉毒物對中毒或死亡的參與度，給出科學、合理的結(jié)果解釋是法醫(yī)毒物學實踐的核心問題。組學技術(shù)整合了基因組、蛋白質(zhì)組、代謝組等不同水平上的多種信息，有望在探索毒物代謝酶的基因多態(tài)性與毒物代謝規(guī)律之間的關(guān)系、闡明毒物對機體毒性作用和損傷機制、尋找中毒相關(guān)的生物標志物，以及確定毒性劑量閾值、毒性作用在種屬間的外推等方面取得突破。

法醫(yī)毒物學領(lǐng)域已開展組學技術(shù)的探索研究。檢索與法醫(yī)毒物學密切相關(guān)的學術(shù)刊物Forensic Science International、International Journal of Legal Medicine、Journal of Analytical Toxicology、Journal of Forensic Sciences、Journal of Forensic and Legal Medicine、Forensic toxicology等，有關(guān)法醫(yī)毒物組學研究論文近10年發(fā)表37篇，近5年占21篇，雖然不盡全面，但大體反映了在該領(lǐng)域的平穩(wěn)發(fā)展趨勢。最近5年的成果中，涉及基因組學的12篇，蛋白組學的7篇，代謝組學的2篇。國內(nèi)的法醫(yī)毒物學研究在這些組學領(lǐng)域均有涉及，發(fā)表論文不限于上述刊物范圍。目前國內(nèi)期刊僅見關(guān)于代謝組學的綜述報導［12-14］和司法部司法鑒定科學技術(shù)研究所有關(guān)基因組學、蛋白組學、代謝組學的博士論文。

2.1基因多態(tài)性與毒性效應

毒物的毒性效應存在很大的個體差異，攝取相同劑量的毒物后其體內(nèi)濃度差異與遺傳、生理、病理、環(huán)境有關(guān)，其中個體的遺傳因素關(guān)系最為密切。個體差異的15%～30%是由基因因素決定的，根據(jù)CYP P450酶的基因多態(tài)性可將人群分為四種類型：弱代謝者（poor metabolizer，PM）、中間代謝者（intermediate metabolizer，IM）、強代謝者（extensive metabolizer，EM）和超強代謝者（ultraextensive metabolize，UM）。若CYP基因出現(xiàn)堿基缺失、插入、替換、顛換等類型的突變，會導致所表達的CYP酶降低活性或者喪失活性。

法醫(yī)毒物學工作者認識到個體差異在毒物鑒定結(jié)果解釋中的重要性，已關(guān)注并開展毒物基因組學研究［11］。CYP基因多態(tài)性與毒物效應多樣性之間的關(guān)系研究也成為法醫(yī)毒物學的研究前沿和國際新熱點，在年度國際法醫(yī)毒物學會議上設(shè)專場研討。廣泛存在的基因多態(tài)性可以導致明顯的個體差異，目前已經(jīng)證實CYP1A1，CYP1A2，CYP1B1，CYP2A6，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6，CYP2E1，CYP3A4，CYP3A5等基因存在多態(tài)性［15］。CYP基因的某些突變可影響毒藥物代謝速率，造成用藥的個體差異。Jannetto等［16］和Jin等［17］通過分析羥考酮和芬太尼中毒案件，檢測白人、美國黑人和印第安人的P450酶基因型，顯示CYP2D6可以作為法醫(yī)毒物學鑒定的輔助手段，給出合理的結(jié)果解釋。Zackrisson等［18］通過242例藥物中毒死亡者和正常人的單核苷酸多態(tài)性（SNP）分型檢測，發(fā)現(xiàn)在瑞典人群中，中毒死亡者中CYP2D6 PM發(fā)生頻率（4.7%）反而低于正常人群中PM頻率（8.5%）；中毒死亡者中CYP2D6*4等位基因頻率明顯低（P＜0.005）。Levo等［19］分析芬蘭人中33個曲馬多中毒死亡案例，發(fā)現(xiàn)功能性CYP2D6等位基因數(shù)量與曲馬多及其代謝物O-去甲曲馬多和N-去甲曲馬多的濃度比率有關(guān)聯(lián)性。Koski等［20］分析芬蘭人中202個阿米替林中毒死亡案例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CYP2D6缺陷基因數(shù)量與阿米替林及其羥基代謝物濃度比率存在正相關(guān)性，CYP2C19缺陷基因數(shù)量與阿米替林及其去甲基代謝物濃度比率存在關(guān)聯(lián)性。沈敏等［21］報道中國漢族人群和高加索人群CYP基因座上的SNP位點分布頻率有顯著性差異，并發(fā)現(xiàn)新精神活性物質(zhì)唑吡坦的代謝與CYP3A4、CYP2C19基因座上的2個SNP位點的多態(tài)性相關(guān)。

毒物基因組學的研究特點及趨勢為：（1）毒物代謝相關(guān)基因研究聚焦于CYP2D6。目前國內(nèi)外研究最多的為CYP2D6等位基因突變與藥物代謝的相關(guān)性，其次為CYP2C19，其他包括CYP2C9、CYP3A4、CYP2B6（圖1）。由于種族差異，CYP2D6等位基因分布頻率不同，因而其表達的特定代謝酶活性在不同人群中也不盡相同。表1總結(jié)了目前6個人種的CYP2D6等位基因分布頻率，其中CYP2D6*10在中國漢族人群中發(fā)生頻率較高，若發(fā)生此類突變，則會降低CYP2D6酶的活性，導致弱代謝。（2）新精神活性物質(zhì)成為研究熱點。新精神活性物質(zhì)的出現(xiàn)及濫用趨勢使其成為近年法醫(yī)毒物學的主要研究對象。丹麥學者發(fā)現(xiàn)合成大麻素的代謝與CYP3A4基因多態(tài)性相關(guān)［22］，挪威學者在國際法醫(yī)學雜志中報道了4-甲氧基甲基苯丙胺（PMMA）與CYP2D6基因多態(tài)性相關(guān)［23］。苯丙胺類藥物主要在肝臟內(nèi)通過CYP2D6酶進行代謝，若表達CYP2D6酶的基因發(fā)生突變，則會造成藥物代謝異常［24］。據(jù)報道，2010—2013年挪威因濫用PMMA致死的案件就多達29起，其中大部分都是由于PMMA代謝異常所造成的急性死亡。

圖1　研究熱點基因分布

表1　不同種族主要的CYP2D6等位基因頻率　（%）

基因多態(tài)性研究與其他組學技術(shù)明顯不同的是相對成熟，國際上已將該成果應用于鑒定實踐，以科學解釋毒物攝入量、毒物代謝、個體遺傳因素與中毒或死亡結(jié)果的關(guān)系。

［案例1］某62歲的男性患者因咳嗽和肺炎住院，服用治療劑量的可待因（25mg/次，每天3次），4天后該患者病情突然惡化，出現(xiàn)意識喪失，昏迷，呼吸抑制，瞳孔散大等癥狀［25］。血液毒藥物定量分析及CYP2D6和CYP3A4基因型分析結(jié)果表明：（1）該患者出現(xiàn)急性中毒反應時，血液中可待因及其代謝物可待因葡萄糖結(jié)合物、嗎啡、3-嗎啡葡萄糖醛酸苷、6-嗎啡葡萄糖醛酸苷的濃度分別為114、361、80、580、136ng/mL（表2），其中嗎啡、3-嗎啡葡萄糖醛酸苷、6-嗎啡葡萄糖醛酸苷的濃度遠高于正常人群。（2）該患者CYP2D6分型結(jié)果為攜帶兩個以上拷貝的功能等位基因（CYP2D6*1/*1xN），為超快代謝類型。可待因經(jīng)P450亞酶3A4作用代謝成去甲可待因，經(jīng)尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶UGT酶（UDP-glucuronosyltransferase，UGT）亞酶2B7作用形成6-可待因葡萄糖結(jié)合物，經(jīng)CYP2D6作用代謝成嗎啡，再進一步與葡萄糖醛酸結(jié)合成6-嗎啡葡萄糖醛酸苷和3-嗎啡葡萄糖醛酸苷。當發(fā)生CYP基因突變（超快代謝類型）而使CYP2D6酶活性增加，促進可待因更快更徹底地轉(zhuǎn)化為嗎啡，而高濃度的嗎啡可引起呼吸困難甚至死亡。

表2　患者與正常人群血液中可待因及其代謝物的濃度比較（ng/mL）

［案例2］某34歲的男性死于家中，經(jīng)調(diào)查排除自殺和謀殺的可能性［26］。其家庭醫(yī)生證明死者有精神病史，長期服用文拉法辛（VEN）治療，2年前因治療需要增至1天2次，150mg/次。尸體解剖無異常。死者血液毒藥物定量分析結(jié)果：血液中文拉法辛及其代謝物O-去甲文拉法辛（ODV）、N-去甲文拉法辛（NDV）的濃度分別為4.5、0.025、0.54mg/kg，其中原體文拉法辛濃度遠高于正常人群。死者CYP2D6和CYP2C19的基因分型結(jié)果為CYP2D6*4/*5（弱代謝類型），CYP2C19*2/*2（弱代謝類型），弱代謝人群服藥后會造成文拉法辛在體內(nèi)蓄積（表3），從而引起中毒死亡。

表3　正常代謝人群和慢代謝人群體內(nèi)文拉法辛及其代謝物濃度的比較

涉毒案件應考慮個體遺傳因素，結(jié)合不同個體的毒物代謝差異與DNA多態(tài)性的關(guān)系，進行結(jié)果解釋，更加科學地判斷毒物劑量對死亡或行為能力的作用程度，為法醫(yī)或法庭提供有效的證據(jù)。

2.2毒物作用機制和生物標志物的探尋

毒物代謝組學通過對各種代謝路徑底物和產(chǎn)物的小分子代謝物進行動態(tài)的定性和定量分析，來揭示代謝組與毒物作用的相互關(guān)系，定位毒物作用的靶器官及選擇相應的生物標志物。法醫(yī)毒物學領(lǐng)域的代謝組學研究報導較為罕見，而與之關(guān)聯(lián)的藥物基因組學受到了國內(nèi)外學者的高度關(guān)注。

（1）毒品濫用成癮判定。毒品濫用對機體代謝物產(chǎn)生一定具有特異性和可重復性的影響，利用代謝組學方法檢測相關(guān)代謝物的變化，可用于篩選毒品成癮的特異性生物標記物，評價毒品濫用程度、推斷濫用種類及推斷復吸史。如Zheng等通過代謝組學研究獲得“海洛因的使用導致了代謝模式的偏差，而海洛因停用后代謝模式恢復到基線，海洛因的重新使用導致代謝模式再次偏離”的結(jié)果；對代謝物進行分析發(fā)現(xiàn)海洛因加速了三羧酸循環(huán)，且游離脂肪酸的代謝可能導致海洛因組大鼠體質(zhì)量減輕［27］。Yang等［28］利用氫質(zhì)子-磁共振波譜（1HMRS）比較14名可卡因長期濫用者和14名健康志愿者體內(nèi)代謝物濃度?？煽ㄒ蜷L期濫用者谷氨酸與總肌酐比值比對照組顯著降低，且降低程度與可卡因使用年限明顯相關(guān)，這可能表明谷氨酸在調(diào)節(jié)可卡因成癮的重要作用，并對可卡因成癮者前扣帶皮層活動減弱進行合理的解釋。通過對初次吸毒人群和吸毒成癮人群代謝組的比較，可為吸毒成癮的界定提供依據(jù)。

（2）毒性作用和生物標志物。代謝物組成的變化是毒物對機體造成的最終影響，能夠反應毒性損傷特征的代謝物變化，可以作為器官特異性的標志物。Feng等［29］利用基于UPLC-MS的代謝組學對長期、低劑量暴露樂果毒性進行評價。血液和尿液中大量代謝物如L-酪氨酸、乙嘧硫磷（DMTP）、二甲基二硫代磷酸酯（DMDTP）、檸檬酸、尿酸和辛二酸的明顯變化表明長期低劑量的樂果暴露會影響脂質(zhì)、葡萄糖、脂肪酸等代謝，并損害肝功能、抗氧化和神經(jīng)系統(tǒng)。在所有生物標記物中，DMTP和DMDTP可被看作早期、靈敏的樂果暴露生物標記物。Hao等［30］應用基于UPLC-MS的代謝組學方法研究乙酰甲胺磷給藥后24周尿液中代謝物的變化，與其他生物標記物相比，尿液中乙嘧硫磷出現(xiàn)時間較早、上升幅度最大，可認為是乙酰甲胺磷早期暴露、敏感的生物標記物。日本大阪法醫(yī)實驗室開展了甲基苯丙胺急性中毒大鼠的尿液和血漿代謝組學研究，認為代謝組學研究不僅可以揭示毒性作用機制，而且無需檢測到藥物就可確定中毒［31］。Shima等［32］采用基于質(zhì)譜的代謝組學技術(shù)研究甲基苯丙胺的急性毒性作用。5-氧脯氨酸、葡萄糖二酸、尿嘧啶、3-羥基丁酸酯、脂肪酸、葡萄糖、6-磷酸葡萄糖、果糖、1，6-二磷酸鹽和三羧酸循環(huán)中間體例如延胡索酸鹽很可能是甲基苯丙胺誘導中毒的生物標記物。減少的三羧酸循環(huán)中間體、3-羥基丁酸酯以及增加的葡萄糖表明高劑量的甲基苯丙胺抑制了經(jīng)三羧酸循環(huán)的糖酵解、氧化磷酸化以及脂肪酸的β-氧化作用。Dudka［33］等利用NMR對389名砷、鎘和鉛職業(yè)暴露的健康熔爐工人血清代謝組學進行研究。代謝輪廓分析表明，這些工人體內(nèi)能量代謝平衡受到干擾，脂蛋白、不飽和脂質(zhì)和氨基酸水平的變化表明脂質(zhì)代謝和氨基酸代謝受到干擾。國內(nèi)受國家自然科學基金資助的溫州醫(yī)科大學Deng［34］研究硫化氫慢性中毒的血清代謝組學，認為代謝組學方法可能為慢性硫化氫中毒提供新的檢測手段；司法部司法鑒定科學技術(shù)研究所嚴慧運用基于GC-MS和LC-MS/MS的血漿代謝組學、多元統(tǒng)計分析闡述了溴鼠靈中毒后的血漿代謝輪廓變化并篩選出與溴鼠靈毒性相關(guān)的血漿生物標志物。構(gòu)建多劑量溴鼠靈中毒模型后發(fā)現(xiàn)溴鼠靈毒性顯示出劑量-依賴效應。溴鼠靈可能是通過干擾氨基酸分解代謝、糖酵解、線粒體氧化代謝、脂肪酸氧化發(fā)揮其毒性作用。

差異蛋白組學是從整體水平研究蛋白質(zhì)組在外界刺激過程中（疾病或中毒等）的變化規(guī)律。通過比較毒藥物刺激后體內(nèi)蛋白的變化，可尋找反映中毒本質(zhì)特征的蛋白標志物即“毒性靶標”，挖掘毒物性質(zhì)、劑量、入體時間等深層信息，詮釋其作用方式和致毒機制。目前蛋白質(zhì)組學研究多見于疾病的預防和治療，法醫(yī)毒物學領(lǐng)域僅見西班牙圣保羅大學藥學院開展了氧化應激相關(guān)蛋白研究，揭示可卡因誘導神經(jīng)毒性和神經(jīng)元退變機制［35］；東京醫(yī)科齒科大學研究了甲基苯丙胺對小鼠心房心肌細胞的自噬-溶酶體和泛素-蛋白酶體體系作用效應［36］；復旦大學法醫(yī)系開展了甲醇中毒后大鼠視網(wǎng)膜的蛋白組分析［37］；司法部司法鑒定科學技術(shù)研究所研究了中華眼鏡蛇毒、五步蛇毒、金環(huán)蛇毒和銀環(huán)蛇毒的蛋白質(zhì)組成特點，觀察了四種蛇毒在生物體內(nèi)引起的血清和組織內(nèi)源蛋白質(zhì)表達差異。在對差異蛋白IPA分析的基礎(chǔ)上獲悉了蛇毒引起的生物學變化，并從中篩出了蛇毒中毒的血清生物標志物和組織生物標志物。

3　展望

基于組學技術(shù)的系統(tǒng)毒理學呈現(xiàn)蓬勃發(fā)展的態(tài)勢，基因組學、蛋白質(zhì)組學和代謝組學在機理闡述方面已經(jīng)顯示出較大的優(yōu)勢，但作為前沿科學技術(shù)，還存在著很多亟待突破的技術(shù)難題［2，35］，主要包括:一是組學技術(shù)尚沒有形成統(tǒng)一標準。實驗室一般根據(jù)自己的特點開發(fā)利用自己感興趣的相關(guān)組群，這些技術(shù)的所有權(quán)限制了實驗室間的交流與合作，也不可避免地造成某些結(jié)果不能被重復，被驗證。同時作為一類新的檢測指標或生物標志物，其敏感性和特異性的判斷尚缺少金標準，因此對實驗結(jié)果的解釋和運用尤應謹慎。二是缺乏組學數(shù)據(jù)庫和有效的分析工具。三是多種組學技術(shù)的聯(lián)用尚未實現(xiàn)?；蚪M學、蛋白質(zhì)組學、代謝組學均屬系統(tǒng)毒理學的重要組成部分，通過現(xiàn)單一組學技術(shù)所獲數(shù)據(jù)和結(jié)果僅能在反映某一層面上的生物信息，而多組學數(shù)據(jù)整合和集成分析才能更全面、系統(tǒng)地了解整個生命活動規(guī)律，才能夠?qū)崿F(xiàn)將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成知識［38］。此外，由于多年來對復雜生物學的有限認識，充分發(fā)揮潛力的組學數(shù)據(jù)集成尚需時間。即便如此，系統(tǒng)毒理學仍然代表了未來的發(fā)展方向。

目前法醫(yī)毒物組學技術(shù)尚處于起步階段，運用組學技術(shù)構(gòu)建法醫(yī)毒物學的研究和鑒定體系尚有距離，應用價值尚為有限。縱觀國內(nèi)外法醫(yī)毒物學領(lǐng)域的研究特點，值得我們關(guān)注和反思。一是國際上更注重應用性研究，如運用毒物基因組學技術(shù)解決基因多態(tài)性與毒性效應多樣性的問題，已在鑒定實踐中發(fā)揮了重要作用，而對于偏重于探索研究的蛋白組學和代謝組學研究較為少見。二是國際上更注重人群研究，如研究對象主要是人群或來源于案件對象的積累，研究結(jié)果具有可應用性和可推廣性，而國內(nèi)大部分研究的實驗對象為動物，由于種屬差異其結(jié)果僅有參考價值或沒有實踐價值。當然，法醫(yī)組學作為前沿研究手段需要發(fā)展的時間和空間，關(guān)聯(lián)、整合代謝組學、基因組學、蛋白質(zhì)組學的信息，給出科學的解釋是法醫(yī)毒物學面臨的機遇與挑戰(zhàn)。不可否認的是，傳統(tǒng)的毒物代謝動力學研究和死后毒物學研究，包括毒物的體內(nèi)過程（吸收、分布、代謝、排泄）、死后變化、死后生成等，在法醫(yī)毒物毒性研究中仍然占有重要的地位。

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（本文編輯：卓先義）

Systems Toxicology-Opportunity and Challenge for Forensic Toxicology

SHEN Min，YAN Hui，SHI Yan，XIANG Ping
（Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine，Shanghai Forensic Service Platform，Institute of Forensic Science，Ministry of Justice，Shanghai 200063，China）

With the development of new technology in life science，based on genomics，proteomics，metabolomics and other techniques，systems toxicology has come into being，providing a new research platform for forensic toxicology and presenting fundamental changes in research idea and approach.This paper mainly reviews applications of omics technology in forensic toxicology，as well as key issues such as method standardization，omics database and integration of multi-omics information. The forensic toxicology studies should pay more attention to population study and application value.Systems toxicology is a promising tool to explore the relationship between gene polymorphisms of metabolic enzyme and poison metabolism，clarify toxic effect and mechanism of toxicants，discover poisoning related biomarkers，and determine dose threshold of poisons.It raises opportunities and challenges for forensic toxicology.

forensic toxicology；systems toxicology；omics；genomics；proteomics；metabolomics

DF795.4

Adoi:10.3969/j.issn.1671-2072.2016.05.010

1671-2072-（2016）05-0057-09

2016-07-15

上海市科技攻關(guān)項目（15DZ1207500）；上海市法醫(yī)學重點實驗室資助項目（14DZ2270800）；上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務平臺資助項目（16DZ2290900）

沈敏（1955—），女，研究員，博士研究生導師，主要從事法醫(yī)毒物鑒定研究和司法鑒定管理工作。

E-mail:shenm@ssfjd.cn。