產(chǎn)木聚糖酶的枯草桿菌篩選及稀土Er3+的誘變

胡建華，楊志杰，潘麗珍，劉娜林，胡 玥，薛利敏

（1.內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010051；

2.內(nèi)蒙古化工職業(yè)學(xué)院 化學(xué)工程系，內(nèi)蒙古呼和浩特 010070）

產(chǎn)木聚糖酶的枯草桿菌篩選及稀土Er3+的誘變

胡建華1，楊志杰2，潘麗珍1，劉娜林1，胡 玥1，薛利敏1

（1.內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010051；

2.內(nèi)蒙古化工職業(yè)學(xué)院 化學(xué)工程系，內(nèi)蒙古呼和浩特 010070）

篩選了新的產(chǎn)木聚糖酶的枯草芽孢桿菌，通過在對(duì)數(shù)期加入稀土Er3+進(jìn)行誘變，發(fā)現(xiàn)稀土對(duì)枯草桿菌的生長(zhǎng)沒有顯著影響，對(duì)酶也沒有直接影響，但是1×10-5mol/L的Er3+可以顯著提高木聚糖酶的酶活，酶活提高達(dá)102.2%，為木聚糖酶的誘變篩選提供新的方法。

木聚糖酶；枯草桿菌；稀土；誘變

木聚糖是植物半纖維素的主要成分，含量?jī)H次于纖維素的可再生多糖資源[1]。木聚糖酶以內(nèi)切方式水解木聚糖中的β-1，4糖苷鍵，這一作用既可降低木聚糖的粘性和抗?fàn)I養(yǎng)性，又可產(chǎn)生具保健和調(diào)節(jié)胃腸功能的低聚木糖，因而有廣泛的應(yīng)用前景。通過篩選新的高產(chǎn)菌株以及通過誘變等方法獲得高酶活菌株，對(duì)于降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率都有重要的意義[2]。稀土具有優(yōu)良的生物學(xué)特性，適宜的稀土可以促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的提高，而高濃度的稀土則有抑制作用[3]。本文篩選新的產(chǎn)木聚糖酶的菌株，通過稀土誘變提高木聚糖酶的酶活，為深入研究稀土促進(jìn)木聚糖酶的機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源

取自呼和浩特郊區(qū)的土壤中。

1.1.2 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基為加入0.5%木聚糖的LB固體培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基為0.5%木聚糖LB液體培養(yǎng)基。

1.1.3 木聚糖的提取

將玉米芯粉碎后用4%NaOH室溫浸泡過夜，抽濾取濾液，用HCl調(diào)至pH為4.5，加等體積乙醇，離心得沉淀，于45℃下烘干備用。

1.1.4 試劑

所用試劑皆為化學(xué)純或生物純。所用稀土ErCl3為自備，將稀土Er2O3與1∶1的鹽酸按摩爾比1∶6混合，攪拌使其溶解，所得溶液在沸水浴上加熱蒸發(fā)至干，置于干燥器中至恒重，即可制備出ErCl3·6H2O稀土氯化物。

1.2 方法

1.2.1 菌種篩選

在含有0.5%木聚糖的LB固體培養(yǎng)基能夠長(zhǎng)出透明圈的菌落即為產(chǎn)木聚糖酶的菌株，經(jīng)劃線分離，挑取單菌落保存鑒定。

1.2.2 菌種培養(yǎng)及稀土誘變

將配好的含0.5%木聚糖的液體LB培養(yǎng)基滅菌后接入產(chǎn)木聚糖酶的菌株，5%的接種量，裝液量為50mL（250mL三角瓶）在36℃、160r/min培養(yǎng)條件下?lián)u床培養(yǎng)。培養(yǎng)8h后加入1×10-3mol/L、1×10-4mol/L、1×10-5mol/L、1×10-6mol/L的稀土ErCl3水溶液時(shí)，以不加稀土的菌液作為對(duì)照組，于36℃、160r/min培養(yǎng)，間隔一定時(shí)間取樣測(cè)OD600，72h后停止培養(yǎng)。將菌液以6 000r/min離心5min，取上清液即為粗酶液，測(cè)定木聚糖酶活性，每組三個(gè)平行樣。

1.2.3 Er3+對(duì)木聚糖酶的直接作用

在對(duì)照組的粗酶液中直接加入相同濃度的ErCl3水溶液，靜置2h，測(cè)定酶活。

1.3 木聚糖酶酶活的測(cè)定

以0.5%的木聚糖為底物溶液（pH為6.0），加入待測(cè)酶液在50℃反應(yīng)30min后，加入DNS試劑沸水浴中保溫顯色5min后，540nm的波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度（OD=）值。酶活定義：1mL粗酶液在pH為6.0、50℃下每分鐘分解木聚糖產(chǎn)生1μg木糖為一個(gè)酶活單位。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)木聚糖酶的枯草桿菌的篩選

篩選有木聚糖透明圈的菌株經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌，命名為Bacillus subtilis QSH4。枯草桿菌是目前應(yīng)用較多潛力較大的一族革蘭氏陽性細(xì)菌，可以分泌多種有用產(chǎn)物，在工業(yè)上長(zhǎng)期被用于生產(chǎn)蛋白酶及淀粉酶等。

2.2 Er3+對(duì)生長(zhǎng)的影響

加入稀土離子后對(duì)枯草桿菌的生長(zhǎng)曲線見圖1。從圖1可以看出，在對(duì)數(shù)期早期加入不同濃度的稀土Er3+對(duì)生長(zhǎng)僅有微弱促進(jìn)作用。稀土離子對(duì)生物生長(zhǎng)也具有“高抑低促”的現(xiàn)象，但是本實(shí)驗(yàn)中選擇的濃度及稀土種類對(duì)枯草桿菌的生長(zhǎng)基本沒有影響。

圖2 .1 稀土對(duì)枯草桿菌生長(zhǎng)的影響

2.3 Er3+對(duì)木聚糖酶的直接作用

將不同濃度的稀土離子加入到木聚糖酶的溶液中見圖2，1×10-3mol/L的Er3+對(duì)于木聚糖酶有輕微的抑制作用，其余三個(gè)濃度的稀土離子也沒有明顯的促進(jìn)作用。本次所用的稀土離子對(duì)于木聚糖酶作用不明顯。

圖2 Er3+對(duì)木聚糖酶的直接響

2.4 Er3+對(duì)枯草桿菌產(chǎn)酶的影響

加入四個(gè)濃度的Er3+后，對(duì)酶活的影響見圖3。從圖3可以看出，加入1×10-3mol/L的稀土離子后，對(duì)酶活有抑制作用，而1×10-4～1×10-6mol/L濃度的稀土離子對(duì)木聚糖酶活有促進(jìn)作用，相比對(duì)照組酶活4.15U/mL，1×10-5mol/L的促進(jìn)效果最好，酶活達(dá)到8.39U/mL提高達(dá)102.2%。

圖2 .3 Er3+對(duì)枯草桿菌產(chǎn)木聚糖酶的影響

3 結(jié)論

在生長(zhǎng)早期加入1×10-4～1×10-6mol/L的稀土Er3+對(duì)枯草桿菌產(chǎn)木聚糖酶活有促進(jìn)作用，酶活提高達(dá)102.2%。但是稀土離子對(duì)枯草桿菌生長(zhǎng)及木聚糖酶沒有直接的影響，具體機(jī)理需進(jìn)一步研究。

[1] 邱并生.耐堿性木聚糖酶[J].微生物學(xué)通報(bào)，2013，40（5）：904.

[2] 常英，張冬艷，胡建華，等.ErCl3作用下枯草桿菌所產(chǎn)α-淀粉酶的溫度、pH性質(zhì)[J].蘭州理工大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，350（6）：76-78.

[3] 盧慶華，江夢(mèng)宇，高志紅，等.La3+對(duì)青霉菌產(chǎn)漆酶及其酶的影響[J].稀土，2016，37（4）：148-151.

Screening of Bacillus Subtilis Producing Xylanase and mutagenesis of Er3+

Hu Jian-hua，Yang Zhi-jie，Ρan Li-zhen，Liu Na-lin，Hu Yue，Xue Li-min

A new xylanase-producing Bacillus subtilis was screened and mutagenized by addition of Er3+in the log phase.It was found that rare earth did not significantly affect the growth of Bacillus subtilis and the enzyme had no direct influence，/L of Er3+can significantly improve the enzyme activity of xylanase，enzyme activity increased to 102.2%，for the mutagenesis of xylanase screening to provide a new method.

xylanase；bacillus subtilis；rare earth；mutagenesis

TQ925

A

1003–6490（2016）10–0103–02

2016–09–20

內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué)科研基金資助項(xiàng)目（X200707）；內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)計(jì)劃（2015045）；內(nèi)蒙古化工職業(yè)學(xué)院基金資助項(xiàng)目（HYZR1410）。

胡建華（1979—），男，內(nèi)蒙古清水河縣人，講師，主要研究方向?yàn)樯锘ぁ?/p>