重鉻酸鉀對泥鰍鰭細(xì)胞系的毒理學(xué)研究

吳 迪,周詩珈,李 霞、2,秦艷杰,白麗雯,王文文

(1.大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗室,遼寧大連116023;2.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗室,遼寧大連116023)

重鉻酸鉀對泥鰍鰭細(xì)胞系的毒理學(xué)研究

吳 迪1,周詩珈1,李 霞1、2,秦艷杰1,白麗雯1,王文文1

(1.大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗室,遼寧大連116023;2.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗室,遼寧大連116023)

為探究重鉻酸鉀的毒性機(jī)制,建立適合監(jiān)測鉻污染的體外檢測系統(tǒng),以體外培養(yǎng)的泥鰍Misgurnus anguillicaudatus鰭細(xì)胞系(DIMF)為試驗材料,研究了重鉻酸鉀的毒性效應(yīng)。結(jié)果表明:通過噻唑藍(lán)(MTT)比色法測定重鉻酸鉀染毒后細(xì)胞的24 h半致死濃度為(25.3±1.2)μmol/L;暴露在濃度為0～30 μmol/L的重鉻酸鉀中,細(xì)胞超氧化物歧化酶(SOD)活性隨著染毒濃度的增加而增大;谷胱甘肽超氧化物酶(GSH-Px)在重鉻酸鉀濃度為0～20μmol/L時活性升高,當(dāng)染毒濃度為30 mol/L時,活力開始下降;谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活性則隨重鉻酸鉀濃度的升高而降低;微核試驗顯示,DIMF微核率隨染毒濃度的增加呈先升高后降低的趨勢,其中最大微核率為0.733％;實(shí)時定量PCR結(jié)果顯示,對照組的金屬硫蛋白(MT)基因表達(dá)量很低,經(jīng)重鉻酸鉀誘導(dǎo)后MT基因表達(dá)量顯著升高(P＜0.01)。研究表明,重鉻酸鉀可對細(xì)胞的酶系統(tǒng)和遺傳物質(zhì)造成一定的損傷。

泥鰍;重鉻酸鉀;細(xì)胞系;酶活力;微核率;金屬硫蛋白

近年來,電鍍、染印等工業(yè)中的鉻污染對水體的嚴(yán)重危害已引起人們的廣泛關(guān)注。鉻的常見形態(tài)是三價鉻(Cr3+)和六價鉻(Cr6+),其中Cr3+是人和動物的必需微量元素,因此,鉻在毒理學(xué)研究中主要是指六價鉻,Cr6+會造成消化道、呼吸道病變,皮膚過敏,惡性腫瘤等[1],故探討鉻對細(xì)胞的毒性效應(yīng)是非常必要的。目前,相關(guān)研究在哺乳動物方面報道較多[2],對水生生物影響的研究主要以魚類為主。

魚類個體具有免疫功能,自身可排毒解毒,會掩蓋有毒物質(zhì)的毒性[3-4],而體外培養(yǎng)的細(xì)胞系均一性好,細(xì)胞可與污染物直接接觸,且反應(yīng)迅速靈敏,試驗結(jié)果便于觀察[5]。當(dāng)前,利用魚類細(xì)胞系研究鉻的毒理作用的報道不多,Tan等[6]比較了6種細(xì)胞系對重鉻酸鉀的敏感性,認(rèn)為鯉Cyprinus carpio上皮瘤細(xì)胞系對鉻最為敏感;Torre等[7]通過實(shí)時定量PCR方法發(fā)現(xiàn),重鉻酸鉀可使光若花鳉Poeciliopsis lucida肝細(xì)胞系PLHC-1中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)量升高,證實(shí)了鉻與魚類ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的相互作用。

泥鰍Misgurnus anguillicaudatus是中國重要的淡水養(yǎng)殖魚類[8],本試驗中以二倍體泥鰍鰭細(xì)胞系為試驗材料,研究了重鉻酸鉀對細(xì)胞的毒理效應(yīng),旨在探究Cr6+的毒性機(jī)理,建立適合監(jiān)測其污染情況的細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用二倍體泥鰍鰭細(xì)胞系(DIMF)為大連海洋大學(xué)細(xì)胞工程實(shí)驗室于2012年建立。細(xì)胞系所用培養(yǎng)基均為含20％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液,并于25℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。

試驗用培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶均由Hyclone公司生產(chǎn);重鉻酸鉀、噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、磷酸緩沖液(PBS)等均購自上海生工生物工程有限公司;酶學(xué)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;實(shí)時定量所用試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 染毒處理試驗中重鉻酸鉀濃度分別設(shè)置為取生長良好的60～80代DIMF,以1×105cells/mL密度接種于96孔板或25 mL培養(yǎng)瓶中,接種量分別為0.2、5.0 mL,24 h后,棄去原培養(yǎng)基,加入等體積不同濃度的重鉻酸鉀,每個濃度重復(fù)3次,置于25℃CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.2 MTT比色法測定細(xì)胞存活率 在96孔板的染毒細(xì)胞中,加入40μL的5 mg/mL MTT孵育4 h,棄去原培養(yǎng)基,用PBS緩沖液快速清洗兩次,加入150μL DMSO震蕩10 min,用酶標(biāo)儀在570 nm處測定吸光值。其中,設(shè)陽性對照組的重鉻酸鉀濃度為0,空白對照組中只加等體積培養(yǎng)基不加細(xì)胞。

1.2.3 酶活力檢測 取0、10、20、30、40μmol/L染毒濃度組細(xì)胞,按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書測定細(xì)胞的總蛋白質(zhì)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的酶活力。

1.2.4 微核率的測定與計算 收集0、10、20、30、40、50μmol/L染毒濃度組細(xì)胞,滴片、推片、自然晾干后,用甲醇固定10 min,姬姆薩染色5 min,然后用蒸餾水沖洗,空氣干燥,中性樹膠封片,最后用油鏡觀察并統(tǒng)計。微核率計算公式為

微核率=有微核的細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100％。

1.2.5 實(shí)時定量PCR測定金屬硫蛋白(MT)基因表達(dá)量 引物設(shè)計以泥鰍Actinβ基因為內(nèi)參,參照李彩娟等[9]的方法設(shè)計引物如下:

收集細(xì)胞,按TRIzol方法提取細(xì)胞總RNA,檢驗RNA完整性、濃度和純度,并調(diào)整RNA濃度為500 ng/μL。按照全式金試劑盒說明書,反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一條鏈,以反轉(zhuǎn)錄出來的cDNA為標(biāo)準(zhǔn)品,10倍梯度稀釋為模板,設(shè)置5個濃度,按照全式金技術(shù)有限公司說明書,制作內(nèi)參基因Actinβ和目的基因MT的標(biāo)準(zhǔn)曲線,并以稀釋10倍的模板進(jìn)行Real-time PCR。不加cDNA模板,以ddH2O補(bǔ)足的體系為陰性對照。其反應(yīng)體系(共20μL)為:1μL Templat,0.4μL Forward Primer, 0.4μL Reverse Primer,10μL 2×TransScript?Top Green qPCR SuperMix,0.4μL Passive Reference Dye(50×),7.8μL ddH2O。反應(yīng)條件為:94℃下預(yù)變性30 s;94℃下變性5 s,60℃下退火30 s,共進(jìn)行40個循環(huán)。用2-ΔΔCT方法計算目的基因的表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示。試驗數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析,顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞的存活率

泥鰍鰭細(xì)胞系經(jīng)重鉻酸鉀處理后,其存活率變化如圖1所示。從圖1可見:DIMF的存活率隨重鉻酸鉀濃度的增加而逐漸降低,二者存在著明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系;存活率與濃度的自然對數(shù)關(guān)系方程為y=-45.64 lnx+202.94(R2=0.991),根據(jù)方程可求出細(xì)胞的半致死濃度為(25.3±1.2)μmol/L;當(dāng)重鉻酸鉀濃度為90μmol/L時,細(xì)胞全部死亡。

圖1 重鉻酸鉀對泥鰍鰭細(xì)胞系存活率的影響Fig.1 Effect of potassium dichromate on cell viability in loach fin cell line(DIMF)

2.2 細(xì)胞酶活力的變化

DIMF暴露于重鉻酸鉀24 h后,其酶活性變化如表1所示。從表1可見:當(dāng)重鉻酸鉀濃度為0～30μmol/L時,細(xì)胞系的SOD活性隨重金屬濃度的逐漸升高不斷升高,當(dāng)重鉻酸鉀濃度為30μmol/L時,SOD的活性達(dá)到最大值,為47.10 U/mg,且與對照組存在極顯著性差異(P＜0.01),當(dāng)重鉻酸鉀濃度為40μmol/L時,SOD活性顯著下降(P＜0.01);GSH-Px活性隨染毒濃度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,當(dāng)重鉻酸鉀濃度為20μmol/L時,GSH-Px活性達(dá)到最大,為60.73 U/mg,且與對照組存在極顯著性差異(P＜0.01);GST活性隨著染毒濃度的增加逐漸降低,當(dāng)重鉻酸鉀濃度為20μmol/L時,GST活性顯著下降(P＜0.01),當(dāng)重鉻酸鉀濃度為40μmol/L時,細(xì)胞系的GST活性最低,為22.5 U/mg。

表1 重鉻酸鉀對泥鰍鰭細(xì)胞系酶活力的影響Tab.1 Effects of potassium dichromate on the activities of enzymes in DIM F U/mg

2.3 微核率的變化

當(dāng)重鉻酸鉀處理24 h后,DIMF出現(xiàn)微核,微核位于細(xì)胞質(zhì)中,呈圓形,顏色與細(xì)胞核相同(圖2)。

注:A為正常細(xì)胞;B為帶有微核的細(xì)胞,箭頭示微核Notes:A,the normal cell;B,cells with micronucleus,arrow showing themicronucleus圖2 泥鰍鰭細(xì)胞系中微核率的變化Fig.2 Change in m icronucleus rate in DIM F

由表2可見,用0～40μmol/L重鉻酸鉀處理細(xì)胞時,微核率隨染毒濃度的升高呈先升高后降低的趨勢,當(dāng)重鉻酸鉀濃度為40μmol/L時,微核率最高,為0.733％。

表2 重鉻酸鉀對泥鰍鰭細(xì)胞系微核率的影響Tab.2 Effects of potassium dichromate on them icronucleus rate in DIMF

2.4 Real-time PCR結(jié)果

MTmRNA相對表達(dá)量的試驗結(jié)果見圖3,研究表明,DIMF對照組的MT基因表達(dá)量較低,經(jīng)重鉻酸鉀刺激后,MT基因表達(dá)量均較對照組有極顯著升高(P＜0.01)。

注:**表示與對照組有極顯著性差異(P＜0.01)Note:**means very significant difference compared with the control(P＜0.01)圖3 不同重鉻酸鉀處理DIMF的MT基因相對表達(dá)量Fig.3 RelativeMTexpression of DIM F by potassium dichromate treatment

3 討論

3.1 鉻對細(xì)胞系存活率的影響

本試驗中,重鉻酸鉀對DIMF的半致死濃度為(25.3±1.2)μmol/L,與譚鳳霞[10]測得的重鉻酸鉀對虹鱒Oncorhynchusmykiss性腺細(xì)胞系(RTG-2)的半致死濃度相近,但明顯低于以活體生物為監(jiān)測指標(biāo)制定的國家漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(GB11607-89)。這表明,本試驗中所用泥鰍鰭細(xì)胞系對重鉻酸鉀反應(yīng)比較敏感,可作為鉻污染監(jiān)測生物,尤其適用于鉻污染的機(jī)理研究。

3.2 鉻對細(xì)胞系酶活力的影響

本試驗結(jié)果顯示,泥鰍鰭細(xì)胞中SOD活性變化為先升后降,符合Stebbing[11]的“毒物刺激效應(yīng)”,即低濃度毒物可引起酶活性升高,并與張迎梅等[12]關(guān)于重金屬對泥鰍肝胰臟SOD的影響結(jié)果相似。SOD可以清除體內(nèi)的自由基,是體內(nèi)唯一能將自由基作為反應(yīng)底物的抗氧化酶[13],可靈敏反映出機(jī)體的損傷情況。Cr6+進(jìn)入細(xì)胞后,可還原成低價鉻,但這一過程會產(chǎn)生大量的活性氧(ROS),同時Cr6+還能促進(jìn)細(xì)胞合成新的ROS[14],并對細(xì)胞造成損傷。當(dāng)染毒濃度較低時,可對SOD起到誘發(fā)作用,細(xì)胞中ROS逐漸增多時, SOD活性也相應(yīng)升高,清除ROS,保護(hù)細(xì)胞免受損傷。當(dāng)重鉻酸鉀濃度較高時,細(xì)胞中ROS過多,抗氧化酶系統(tǒng)不能及時清除氧自由基,從而導(dǎo)致細(xì)胞各種代謝系統(tǒng)遭到破壞,SOD活性相應(yīng)降低。高濃度的Cr6+產(chǎn)生的ROS已造成了抗氧化酶的大量消耗,過量的ROS超出了其防御水平,加重了對細(xì)胞的毒害。此外,Cr6+還能導(dǎo)致SOD的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變,破壞其原有的反應(yīng)機(jī)制,降低其活性。

谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)可清除自由基參與解毒,特異性地催化還原型谷胱甘肽(GSH)與H2O2的還原反應(yīng),可起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用[15]。當(dāng)重鉻酸鉀濃度較低時,泥鰍鰭細(xì)胞系中的GSH-Px活性顯著升高,而在高濃度鉻脅迫下,其活性均顯著降低。當(dāng)受到鉻脅迫時,SOD歧化O-2·并產(chǎn)生H2O2,細(xì)胞中的GSHPx迅速作出防御,聯(lián)合CAT清除H2O2,防止氧化脅迫,表現(xiàn)為活力升高,此外,當(dāng)鉻濃度超出其可控范圍,可導(dǎo)致GSH-Px的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變,破壞其原有的反應(yīng)機(jī)制,降低其活性。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)存在于各種組織細(xì)胞中,可消除體內(nèi)自由機(jī),并具有解毒功能[16]。GST能催化GSH與某些親電基團(tuán)結(jié)合,還可清除脂質(zhì)過氧化過程中的產(chǎn)物,達(dá)到解毒的目的。GST的活性可表示機(jī)體的氧化應(yīng)激,反映細(xì)胞對污染物的敏感性,可作為水體污染的生物標(biāo)志物[17],是一類敏感的毒理學(xué)指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示,泥鰍鰭細(xì)胞系中GST活力均隨Cr6+濃度的增加而降低,其原因一方面可能是反應(yīng)底物GSH經(jīng)過GSH-Px催化,與H2O2發(fā)生還原反應(yīng),含量降低,GST無法誘導(dǎo)相關(guān)反應(yīng);另一方面是過量的Cr6+直接破壞了GST的結(jié)構(gòu)和功能。

3.3 鉻對細(xì)胞系微核率的影響

目前,利用泥鰍紅細(xì)胞微核作為環(huán)境中重金屬、農(nóng)藥的生物監(jiān)測指標(biāo)的報道較多[18-20]。微核是細(xì)胞分裂后滯留在細(xì)胞質(zhì)中的染色體片段,與細(xì)胞核相似,但其體積要遠(yuǎn)小于細(xì)胞核。Cr6+在細(xì)胞中被還原成低價鉻,其中Cr5+或Cr4+可與DNA形成復(fù)合物,對遺傳物質(zhì)造成損傷,同時產(chǎn)生大量的ROS,攻擊核酸等大分子物質(zhì),促使細(xì)胞系的微核率升高。本試驗中發(fā)現(xiàn),泥鰍鰭細(xì)胞系微核率出現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢,這與李倩等[20]報道的Cu2+脅迫后泥鰍外周血紅細(xì)胞微核的變化一致,其原因可能是由于Cr6+濃度過高時,抑制細(xì)胞的正常分裂或使細(xì)胞核完全裂解,造成微核率降低。

3.4 鉻對細(xì)胞系MT基因表達(dá)量的影響

在水生生物中應(yīng)用實(shí)時定量PCR方法檢測重金屬染毒后金屬硫蛋白基因表達(dá)的變化,目前研究主要集中在個體水平,利用培養(yǎng)細(xì)胞所做的工作不多。譚淑雯[21]研究發(fā)現(xiàn),受鎘脅迫的草魚Ctenopharyngodon idellus腎細(xì)胞系(CIK)中MT基因表達(dá)量會顯著增加,Cheuk等[22]報道,Cr6+可誘導(dǎo)斑馬魚Danio rerio尾鰭細(xì)胞系MT基因表達(dá)量升高。本試驗中,對照組泥鰍鰭細(xì)胞系中MT表達(dá)量很低,與王磊[23]報道的MT基因在正常泥鰍鰭組織中的表達(dá)量相近;而染毒后的細(xì)胞MT表達(dá)量出現(xiàn)先升高后降低的現(xiàn)象,但均極顯著高于對照組(P＜0.01)?？赡苁怯捎贛T在轉(zhuǎn)錄水平上被Cr6+誘導(dǎo)并大量表達(dá),螯合過量的Cr6+,清除自由基,從而達(dá)到解毒的目的,但鉻濃度過高后,細(xì)胞代謝系統(tǒng)受損嚴(yán)重,超出機(jī)體的防御范圍,無法再生成金屬硫蛋白。本研究表明,細(xì)胞系MT的表達(dá)受鉻的影響較為敏感,可作為檢測鉻毒性的重要指標(biāo)。

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Cytotoxicity of potassium dichromate to loach fin cell linesin vitro

WU Di1,ZHOU Shi-jia1,LIXia1,2,QIN Yan-jie1, BAILi-wen1,WANGWen-wen1
(1.Key Laboratory ofMarine Bio-resources Restoration and HabitatReparation in Liaoning Province,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China; 2.Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China’s Sea,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

LoachMisgurnus anguillicaudatusfin cell line(DIMF)was used to assess toxicity of potassium dichromate in vitro to study toxicitymechanism of potassium dichromate and establish suitable for chrome pollution detection system.The results showed that themedian lethal concentration(LC50)was(25.3±1.2)μmol/L in DIMF exposed to potassium dichromate for 24 h measured by thiazole blue(MTT)method.The activities of superoxide dismutase(SOD)in DIMF were increased with the increase in concentration within potassium dichromate concentration of0-30μmol/L and the activities of glutathione peroxidase(GSH-Px)were increased at0-20μmol/L potassium dichromate,and then decreased at concentration of 30μmol/L,with gradual decrease in glutathione S-transferase(GST)activity.Micronucleus test revealed that the rate ofmicronucleuswas increased first and then decreased with the increase in potassium dichromate concentration,with themaximum micronucleus rate of0.733％. Real-time PCR showed thatmetallothionein(MT)gene expression quantity was very low in control group,and increased significantly due to the induction by potassium dichromate(P＜0.01).The findings indicate that potassium bichromate can damage enzyme system and genetic materials in cells.

Misgurnus anguillicaudatus;potassium dichromate;cell line;enzyme activity;micronucleus rate; metallothionein

S917.4

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.06.011

2095-1388(2016)06-0646-05

2016-03-25

國家自然科學(xué)基金資助項目(31272650)

吳迪(1991—),女,碩士研究生。E-mail:15842623565@163.com

李霞(1961—),女,教授。E-mail:lx@dlou.edu.cn