鲇精子超微結(jié)構(gòu)及pH、溫度對其精子活力的影響

喬志剛,劉淑琰,沈方方

(河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453007)

鲇精子超微結(jié)構(gòu)及pH、溫度對其精子活力的影響

喬志剛,劉淑琰,沈方方

(河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453007)

為了解鲇Silurus asotus精子的結(jié)構(gòu)特征,應(yīng)用掃描電鏡和透射電鏡技術(shù),對體質(zhì)量為320～550 g的鲇成熟精子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察。結(jié)果表明:鲇精子由頭和尾兩部分組成,無明顯頸部;精子頭部近球形,直徑為1.85～2.51μm,頭部無頂體,頭部內(nèi)有高度密集的細(xì)胞核染色質(zhì),頭部后方凹陷形成植入窩,植入窩內(nèi)有近端中心粒和遠(yuǎn)端中心粒,細(xì)胞核后方與質(zhì)膜的間隙較大(稱袖套),其內(nèi)富含細(xì)胞質(zhì)、線粒體和囊泡等細(xì)胞器;尾部細(xì)長,無主段和尾段之分,長為44.3～50.7μm,橫切面呈圓形,直徑為0.269～0.308μm,透過橫斷面可見,鲇精子尾部由軸絲和附屬纖維構(gòu)成,外有一層質(zhì)膜包裹,軸絲與遠(yuǎn)端中心粒形成“9+2”微管結(jié)構(gòu)。研究表明,精子活力的適宜pH為7.0～8.5,適宜溫度為25～29℃,當(dāng)pH為8.0、溫度為28℃時,精子活力最強(qiáng)。

鲇;精子;超微結(jié)構(gòu);精子活力

鲇Silurus asotus隸屬于鲇形目Siluriformes、鲇科Siluridae、鲇屬Silurus,是中國重要的土著經(jīng)濟(jì)魚類之一,廣泛分布于珠江、長江、黃河、黑龍江等水系[1]。隨著中國水產(chǎn)養(yǎng)殖結(jié)構(gòu)的調(diào)整,鲇在池塘及其他水域中的養(yǎng)殖不斷增多,人們對鲇的關(guān)注力也不斷增強(qiáng),相關(guān)研究涉及鲇的繁殖生物學(xué)、生理生態(tài)和人工增養(yǎng)殖技術(shù)等多項(xiàng)內(nèi)容[1-2]。

對動物精子超微結(jié)構(gòu)的研究,便于人們深入認(rèn)識精子的結(jié)構(gòu)特征及精子結(jié)構(gòu)在受精過程中變化的生理意義。中國學(xué)者曾對鲇形目魚類革胡子鯰Clarias lareza[3]、南方大口鲇Silurus meridionalisChen[4]等魚類精子的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行過相關(guān)研究,但有關(guān)鲇成熟精子超微結(jié)構(gòu)及其活力的研究尚未見報(bào)道。本研究中以鲇成熟精子為對象,應(yīng)用掃描電鏡和透射電鏡技術(shù),對鲇成熟精子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察,同時,對不同pH和溫度下的鲇精子活力進(jìn)行了研究,旨在了解鲇精子的結(jié)構(gòu)特征,并為鲇受精生物學(xué)和鲇苗種人工繁育的規(guī)?；e累基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)魚由河南省黃河鲇良種繁育基地提供。選擇體長為31.2～37.5 cm、體質(zhì)量為320～550 g的健康、成熟雄性鲇10尾用于試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 精子的采集 采用絨毛促性腺激素(HCG)與促黃體素釋放激素類似物(LRH-A)的混合溶液,對成熟鲇雄魚進(jìn)行人工催產(chǎn),催產(chǎn)劑量為每千克體質(zhì)量的雄性鲇親魚注射HCG 500IU+ LRH-A 5μg,胸腔注射。將注射后的鲇親魚放入水深為50～80 cm、進(jìn)排水方便、面積為2～4 m2的水池中等待成熟。

在水溫為22～26℃條件下,10 h(效應(yīng)時間)后撈取親魚,一人一手用濕毛巾固定親魚頭部,使其腹部向上,另一手準(zhǔn)備用吸管吸取鲇精液;同時,另一人用干毛巾迅速擦干親魚體表的水分,一手穩(wěn)住親魚尾部,輕輕擠壓其腹部,見精液流出時,用吸管迅速吸取。

1.2.2 掃描電鏡標(biāo)本的制備 用吸管吸取適量鲇精液置于1.5 mL離心管中,用等量生理鹽水(0.9％)稀釋,加入2.5％戊二醛固定2～4 h,將固定后的鲇精液滴加在叔丁醇制作的薄膜上,室溫下干燥5 min,用梯度濃度酒精脫水,在電壓為150 V、鍍金膜為3 min條件下,使用日立SU 8010掃描電鏡觀察并拍照。

1.2.3 透射電鏡標(biāo)本的制備 用吸管吸取適量鲇精液置于1.5 mL離心管中,用等量生理鹽水進(jìn)行稀釋,加入2.5％戊二醛固定2～4 h,以0.1 moL磷酸緩沖液(pH 7.4)沖洗3次后,加入1％鋨酸固定2 h,用梯度濃度酒精脫水,用丙酮與純812樹脂(體積比為1∶1)對樣品滲透過夜,再用純812樹脂包埋、徠卡(Leica U7)超薄切片機(jī)切片(60～80 nm),以醋酸鈾和檸檬酸雙染色,室溫下干燥后,在JEM-2100F型透射電鏡下觀察并拍照。

1.2.4 精子活力觀察 精子活力主要從精子快速運(yùn)動時間和存活時間兩方面判定[4-5]。其中,精子的快速運(yùn)動時間是指精子自激活后到90％精子原地顫動的時長;精子的存活時間是指精子自激活后到90％精子停止原地顫動的時長[5]。

用0.1 mol/L的鹽酸溶液或0.1 mol/L氫氧化鈉溶液與純水分別配制pH為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的水溶液,并置于水溫為26℃的水浴鍋中備用;取一載玻片,以針頭挑取少量精液置于載玻片上,與配制好的水溶液等量混勻,在顯微鏡下觀察精子活動狀態(tài),并記錄精子的快速運(yùn)動時間和存活時間。每個pH值溶液狀態(tài)下進(jìn)行5次取樣觀察、記錄,取其平均值。

用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液與純水配制pH為8.0的水溶液,分裝于8支潔凈的試管內(nèi),分別置于溫度為19、22、25、28、31、34、37℃的水浴鍋或恒溫箱中備用;取一載玻片,以針頭挑取少量精液置于載玻片上,并與預(yù)熱好的水溶液等量混勻,在顯微鏡下觀察精子活動狀態(tài),記錄精子的快速運(yùn)動時間和存活時間。每個溫度狀態(tài)下進(jìn)行5次取樣觀察、記錄,取其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 鲇精子結(jié)構(gòu)

2.1.1 掃描電鏡下鲇精子整體結(jié)構(gòu)觀察 掃描電鏡下觀察,鲇精子屬鞭毛型精子,其主要由頭和尾兩部分組成,無明顯的頸部且無頂體。精子全長為45.5～52.2μm;頭部近球形,直徑為1.85～2.51 μm;尾部細(xì)長,為44.3～50.7μm,尾部外無側(cè)鰭(圖1-A)。

2.1.2 透射電鏡下鲇精子頭部結(jié)構(gòu)觀察 透射電鏡下觀察,鲇精子頭部外周有質(zhì)膜包裹,前端不存在頂體或與頂體類似的膜(圖1-B～D)。精子頭部的主要結(jié)構(gòu)是細(xì)胞核,細(xì)胞核染色質(zhì)密集,但存在較小空隙,這些小空隙稱為核空隙,核空隙的位置和形狀不確定(圖1-C、D)。細(xì)胞核前半部分與質(zhì)膜的間隙很小,細(xì)胞質(zhì)含量相對較少,無線粒體和囊泡等細(xì)胞器。頭部后方有一較淺凹陷部分,為植入窩(圖1-B),內(nèi)有中心粒復(fù)合體;中心粒復(fù)合體由近端中心粒和遠(yuǎn)端中心粒(也稱遠(yuǎn)基體)兩部分組成,近端中心粒長軸與遠(yuǎn)端中心粒長軸垂直,即呈“T”型(圖1-C、F)。

細(xì)胞核后半部分與質(zhì)膜的間隙較大,呈筒狀,為袖套;袖套中含有豐富的細(xì)胞質(zhì)、線粒體和囊泡等細(xì)胞器。袖套縱切面上可見2～3個線粒體,橫切面上可見4～5個線粒體(圖1-C～E)。線粒體在精子頭部的分布不規(guī)律,切面上呈圓形或橢圓形,由雙層膜構(gòu)成,內(nèi)外膜有間隙,內(nèi)膜向內(nèi)延伸成嵴(圖1-E)。袖套與尾部的軸絲形成的空腔為袖套腔(圖1-B)。

2.1.3 透射電鏡下鲇精子尾部結(jié)構(gòu)觀察 透射電鏡下觀察,精子尾部起源于袖套腔(圖1-B),其橫切面呈圓形(圖1-H),直徑為0.269～0.308 μm。尾部縱切面無主段和尾段之分,其基本結(jié)構(gòu)一致,主要由軸絲、附屬纖維組成(圖1-G、H),其中軸絲與遠(yuǎn)端中心粒形成典型的“9+2”微管結(jié)構(gòu),即微管由2條中央纖維和9組外周纖維組成(圖1-H)。

2.2 鲇精子活力

2.2.1 pH對精子活力的影響 鲇精子在不同pH水體中的快速運(yùn)動時間和存活時間見表1。在水溫為26℃條件下,鲇精子在不同pH水體中的活力不同,即隨著水體pH的逐漸升高,鲇精子的快速運(yùn)動時間和存活時間逐漸延長;當(dāng)水體pH由酸性(pH 6.0)升高至弱堿性時,鲇精子的快速運(yùn)動時間(44.8 s,pH 7.5時)和存活時間(107.4 s, pH 8.0時)達(dá)到最長;當(dāng)水體pH達(dá)到8.5時,鲇精子活力開始下降;當(dāng)水體pH大于9.0時,精子的快速運(yùn)動明顯減弱。

2.2.2 溫度對精子活力的影響 鲇精子在不同水溫下的快速運(yùn)動時間和存活時間見表2。在水體pH為8.0條件下,鲇精子在不同水溫下的活力不同,即隨著水溫的逐漸升高,鲇精子的快速運(yùn)動時間逐漸延長,而精子存活時間則逐漸縮短;當(dāng)水溫升至28℃時,鲇精子的快速運(yùn)動時間達(dá)到最長(42.8 s);當(dāng)水溫升至34℃時,鲇精子的快速運(yùn)動時間下降,精子存活時間迅速縮短;當(dāng)水溫升至37℃時,鲇精子失活。

注:A為掃描電鏡下精子整體結(jié)構(gòu);B為透射電鏡下精子整體縱切;C為透射電鏡下精子頭部縱切;D為透射電鏡下精子頭部縱切;E為透射電鏡下精子尾部橫切;F為透射電鏡下精子頭部縱切;G為透射電鏡下精子尾部的遠(yuǎn)核端縱切;H為透射電鏡下精子尾部的近核端橫切,軸絲“9+2”結(jié)構(gòu)。HE示頭部;FL示尾部;IF示植入窩;S示袖套腔;N示細(xì)胞核;NG示核空隙;PC示近端中心粒;DC示遠(yuǎn)端中心粒;M示線粒體;V示囊泡;AX示軸絲;CF示中央纖維;PF示外周纖維Note:A,scanning electron microscopy of sperm;B,longitudinal section of sperm in transmission electron microscopy(TEM);C,longitudinal section of sperm head in TEM,showing structure of the head;D,longitudinal section of sperm head in TEM;E,cross section of sperm flagellum in TEM;F,longitudinal section of sperm head in TEM,showing the connection between the proximal centriolesand the distal centrioles;G,longitudinal section of sperm flagellum in TEM;H,cross section of sperm flagellum in TEM,showing the“9+2”model.HE,head;FL,flagellum;IF, implantation fossa;S,central space in the sleeve;N,nucleus;NG,gap within nucleus;PC,proximal centriole;DC,distal centriole;M,mitochondrion;V,vesicle;AX,axoneme;CF,central fibril;PF,peripheral fibril圖1 鲇精子超微結(jié)構(gòu)Fig.1 Ultrastructure of spermatozoon in oriental sheatfishSilurus asotus

表1 不同pH條件下鲇精子活力狀況Tab.1 Sperm motility of oriental sheatfishSilurus asotusin different pH values

表2 不同溫度條件下鲇精子活力狀況Tab.2 Sperm motility of oriental sheatfishSilurus asotusin different temperature

3 討論

3.1 鲇精子結(jié)構(gòu)劃分

硬骨魚精子大部分由頭部、頸部和尾部3部分組成[6],頭部主要結(jié)構(gòu)是細(xì)胞核,尾部主要結(jié)構(gòu)是軸絲和附屬纖維,頸部是連接頭部和尾部的部分,包括線粒體、中心粒復(fù)合體、囊泡等細(xì)胞器。而蝦虎魚類[7]、草魚Ctenopharyngodon idellus[3]、革胡子鯰Clarias lareza[3]等一些硬骨魚類精子的頸部不明顯,中心粒復(fù)合體、線粒體等細(xì)胞器出現(xiàn)在細(xì)胞核后端凹陷形成的植入窩中,觀察發(fā)現(xiàn),鲇精子屬鞭毛型精子,精子由頭部和尾部組成,無頸部。頭部近球形,尾部細(xì)長呈圓柱形。精子全長為45.5～52.2μm,其中頭長為1.85～2.51μm,尾長為44.3～50.7μm,尾長是頭長的18～27倍;尾部橫切面直徑為0.269～0.308μm,頭部直徑為尾部橫切面直徑的148～194倍。

3.2 精子頂體與卵膜結(jié)構(gòu)

頂體是動物精子頭部頂端由高爾基體發(fā)育而來的特化小泡,實(shí)質(zhì)是一種溶酶體。劉筠等[6]認(rèn)為,硬骨魚類的精子分為頂體型精子和無頂體型精子。本研究中觀察發(fā)現(xiàn),鲇精子頭部前端只有一層質(zhì)膜,未見頂體和類似頂體的結(jié)構(gòu),可認(rèn)為鲇精子無頂體存在。

Poirier等[8]和丁淑荃等[9]認(rèn)為,某些硬骨魚類的精子不具備頂體,可能是其成熟卵子的質(zhì)膜外存在一個或多個卵膜孔所致;周海燕等[10]和Shahin[11]認(rèn)為,一些魚類頂體的缺乏,應(yīng)該是一種物種適應(yīng)性退化。本研究中觀察發(fā)現(xiàn),鲇精子頭部前端只有一層質(zhì)膜,未見頂體和類似頂體的結(jié)構(gòu)。牛景彥[12]前期研究發(fā)現(xiàn),鲇成熟卵子上具有卵膜孔存在。魏剛等[13]研究發(fā)現(xiàn),鲇精子在受精過程中其頭部可以直接通過卵膜孔進(jìn)入卵子?？梢?鲇精子頭部不具備頂體結(jié)構(gòu)是與鲇成熟卵子特定質(zhì)膜結(jié)構(gòu)相適應(yīng)的一種表現(xiàn)。

3.3 精子頭部細(xì)胞器的變化

硬骨魚類精子頭部的主要結(jié)構(gòu)是染色質(zhì)高度致密的細(xì)胞核,細(xì)胞核中常見有少量、不均等分布的空隙,稱核空隙。林光華等[3]、魏鋼等[14]認(rèn)為,這種結(jié)構(gòu)是核泡;而尤永隆等[15]認(rèn)為,這些只是染色質(zhì)在高度濃縮下的空隙,并非單層膜組成的核泡。本研究中觀察發(fā)現(xiàn),鲇精子頭部細(xì)胞核中存在形狀不規(guī)則、無膜包裹的空隙結(jié)構(gòu),認(rèn)為該結(jié)構(gòu)應(yīng)該是染色質(zhì)密集中的空隙,并非核泡。另外,鲇精子的核前端與質(zhì)膜的間隙很小,不像斜帶石斑魚Epinephelus coioides[5]精子和金魚Carassius auratus[16]精子的核前端與質(zhì)膜間存在豐富的細(xì)胞質(zhì)、線粒體和囊泡或液泡,而鲇精子的核后端與質(zhì)膜間存在豐富的細(xì)胞質(zhì)、線粒體和囊泡。

鲇精子頭部植入窩的重要結(jié)構(gòu)是中心粒復(fù)合體,由近端中心粒和遠(yuǎn)端中心粒構(gòu)成,大多數(shù)硬骨魚類精子的近端中心粒長軸和遠(yuǎn)端中心粒長軸垂直,即呈“T”形或“L”形。本研究中觀察發(fā)現(xiàn),鲇精子的近端中心粒長軸和遠(yuǎn)端中心粒長軸呈“T”形,與大多數(shù)硬骨魚類精子的這一結(jié)構(gòu)相似。但有研究發(fā)現(xiàn),少數(shù)魚類精子的近端中心粒長軸和遠(yuǎn)端中心粒長軸不垂直,如刀鱭Coilia ectenes[17]精子的近端中心粒長軸和遠(yuǎn)端中心粒長軸呈“一”字形;斜帶石斑魚[5]精子的近、遠(yuǎn)端中心粒長軸約成120°的夾角;長吻鮠Leiocassis longiorstrisGonther[14]精子的近端中心粒與精子縱軸亦不垂直,呈一定角度。由此可見,關(guān)于近端中心粒長軸和遠(yuǎn)端中心粒長軸的位置關(guān)系變化較大,目前其位置變化的生物學(xué)意義不明。

3.4 鲇與其他鲇形目魚類精子超微結(jié)構(gòu)的異同點(diǎn)

綜合諸多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),鲇形目魚類的精子形態(tài)有兩類不同的存在形式:一類是精子明顯分為頭、頸(又稱中段)和尾3部分,如南方大口鲇[4]和索氏六須鯰Silurus soldatovi[18]等;另一類是精子只有頭和尾兩部分,精子頸部不明顯或不存在,其精子的袖套和中心粒復(fù)合體緊靠精子頭部存在,如鲇和革胡子鯰[3]。鲇形目魚類精子的頭部形態(tài)也有兩種類型:一類是頭部呈球形或橢圓形,如鲇、南方大口鲇[4]和革胡子鯰[3]等;另一類是精子頭部呈長錐形,如埃及尼羅鯰Chysichthys auratus[11]。但無論哪種頭部形態(tài),目前未見鲇形目魚類的精子頭部存在頂體結(jié)構(gòu)的報(bào)道。

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),長吻鮠[14]、黃顙魚Pelteobngrus fulvidraco[18]等鲇形目魚類的精子鞭毛外膜向兩側(cè)突出形成鰭狀結(jié)構(gòu),而本研究中觀察未見鲇精子尾部有鰭樣結(jié)構(gòu)存在。同時作者在鲇受精試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),鲇精子無側(cè)鰭依然運(yùn)動迅速。推測鞭毛上的側(cè)鰭結(jié)構(gòu)對提高精子游泳效率的作用不大。作者分析認(rèn)為,線粒體是細(xì)胞代謝的動力中心,精子運(yùn)動的主要動力來源于其線粒體,線粒體的數(shù)目和代謝活動直接影響了精子活力及對成熟卵子的受精能力。

3.5 環(huán)境因素對精子活力的影響

環(huán)境因素是影響精子活力的重要因素,精子處于適宜環(huán)境條件下被激活,則有利于其活力增強(qiáng)。一般來說,大多數(shù)魚類的精子在中性或弱堿性環(huán)境下活力較強(qiáng),而在酸性環(huán)境下精子活力降低、存活時間縮短。如南方大口鲇精子在pH為8時活力較強(qiáng)[4],斜帶石斑魚精子在pH為8.7時活力較強(qiáng)[5]。本研究中發(fā)現(xiàn),溫度為26℃時,在不同pH的水體中,鲇精子的活力表現(xiàn)不同;當(dāng)水體pH分別為7.5和8.0時,鲇精子的快速運(yùn)動時間和存活時間最長,表明其精子活力最強(qiáng);而當(dāng)pH小于6.5或大于8.5時,鲇精子的快速運(yùn)動時間和存活時間則迅速縮短,其精子活力也明顯減弱。

溫度對魚類精子活力的影響較為復(fù)雜,目前無明確機(jī)制[5],一般認(rèn)為,高溫促進(jìn)精子活力,低溫抑制精子活力。本研究中發(fā)現(xiàn),水體pH為8.0時,隨水溫升高,鲇精子的快速運(yùn)動時間延長,而精子存活時間則縮短;當(dāng)水溫升至28℃時,鲇精子的快速運(yùn)動時間達(dá)到最長(42.8 s);當(dāng)水溫為34℃時,鲇精子的快速運(yùn)動時間下降,精子存活時間迅速縮短;當(dāng)水溫升至37℃時,鲇精子失活。這表明水溫為28℃時,鲇精子活力最強(qiáng),當(dāng)水溫高于34℃時,鲇精子活力明顯減弱。

因此,開展鲇人工種苗繁育時,為提高鲇成熟卵子的受精率,使鲇精子活力達(dá)到最佳,鲇精子稀釋用水最好為中性或弱堿性(pH值為7.0～8.5),受精時的水體溫度應(yīng)控制在25～29℃。

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Ultrastructure of spermatozoon and effects of pH and temperature on spermatozoon motility in oriental sheatfishSilurus asotus

QIAO Zhi-gang,LIU Shu-yan,SHEN Fang-fang
(Fisheries College,Henan Normal University,Xinxiang 453007,China)

The ultrastructure of spermatozoa of oriental sheatfishSilurus asotuswith body weight of320-550 g was observed by means of scanning electron microscopy(SEM)and transmission electron microscopy(TEM)and effects of pH and temperature on spermatozoonmotility in oriental sheatfish.The spermatozoawere shown to be primarily consists of head and flagellum,with no obvious neck.The spermatozoon has a round head with a diameter from 1.85μm to 2.51μm,containing highly condensed chromatin,without acrosome or acrosomal vesicles.There were fossa containing proximal centrioles and distal centrioles in the end of the head.There were rich cytoplasm, mitochondria,and vesica in sleeve distributed between unclei and plasmamembrane.The slender flagella consisting of axoneme and accessory fibers have length of44.3μm to 50.7μm,with a round cross section and a diameter of 0.269μm to 0.308μm.A typical structure of“9+2”modelwas observed in the axoneme and distal centrioles.Itwas found that7.0-8.5 pH was the suitable for spermatozoon,with the maximalmotility at 8.0 pH and that25-29℃was the suitable temperature for spermatozoon,themaximalmotility at28℃.

Silurus asotus;spermatozoon;ultrastructure;spermatozoon motility

Q952.4

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.06.003

2095-1388(2016)06-0602-05

2016-04-04

河南省科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(01046639096)

喬志剛(1965—),男,博士,教授。E-mail:hnsddsyy@126.com