液相色譜-質(zhì)譜法檢驗(yàn)人血漿中的沙丁胺醇

欒玉靜，覃華開(kāi)，王瑞花，董 穎，杜鴻雁

（1.公安部物證鑒定中心，北京 100038；2.柳州市公安局物證鑒定所，廣西 柳州 545001）

液相色譜-質(zhì)譜法檢驗(yàn)人血漿中的沙丁胺醇

欒玉靜1，覃華開(kāi)2，王瑞花1，董 穎1，杜鴻雁1

（1.公安部物證鑒定中心，北京 100038；2.柳州市公安局物證鑒定所，廣西 柳州 545001）

目的建立人血漿中沙丁胺醇的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS/MS）檢驗(yàn)方法。方法采用HSS T3色譜柱（2.1 mm×50 mm, 1.7 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.1 %甲酸水，梯度洗脫，流速為0.6 mL/min，采用UPLCMS/MS方法測(cè)定血漿中沙丁胺醇。結(jié)果人血漿中沙丁胺醇在1～1000 ng/mL范圍內(nèi)與峰面積比呈良好線性關(guān)系，最低檢測(cè)限為0.1 ng/mL，方法回收率大于70 %，日內(nèi)及日間精密度均小于10 %。結(jié)論經(jīng)過(guò)多起案件的驗(yàn)證，所建立的方法簡(jiǎn)便、易于操作，且靈敏度高，能用于血漿中沙丁胺醇的檢驗(yàn)。

液相色譜-質(zhì)譜；人血漿；沙丁胺醇

沙丁胺醇（salbutamol）是一種選擇性β2-腎上腺素能受體興奮劑，對(duì)支氣管平滑肌有特異性的擴(kuò)張作用，臨床上用于治療支氣管哮喘，具有抗炎、抗過(guò)敏及免疫作用。大劑量服用此藥會(huì)產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮，被用作運(yùn)動(dòng)員的刺激劑。因而，國(guó)際奧委會(huì)對(duì)運(yùn)動(dòng)員尿液中的沙丁胺醇檢出量作了規(guī)定。同時(shí)，該藥由于與鹽酸克倫特羅結(jié)構(gòu)相似，且其在體內(nèi)的半衰期較短，毒性作用較弱，因而逐步被用到養(yǎng)殖業(yè)以提高飼料轉(zhuǎn)化率和瘦肉率。雖然很多國(guó)家包括我國(guó)已經(jīng)將沙丁胺醇列為禁用品種，但是仍有很多不法商販在飼料中添加沙丁胺醇。國(guó)內(nèi)外均發(fā)生過(guò)因過(guò)量食用含沙丁胺醇的畜產(chǎn)品而導(dǎo)致的群體性中毒事件。中毒者會(huì)出現(xiàn)震顫、心悸等反應(yīng)，還可能出現(xiàn)肌肉痙攣、過(guò)敏等癥狀，尤其對(duì)心臟和肝腎毒性較大。沙丁胺醇容易蓄積于眼角膜，尿液、血液、肝、腎、肺、肌肉中也容易殘留。

目前，國(guó)內(nèi)常見(jiàn)的檢測(cè)方法包括酶聯(lián)免疫法、熒光光度法[1]、電化學(xué)方法[2]、薄層色譜法、液相色譜法[3-5]和氣相色譜法等。由于沙丁胺醇親水性較強(qiáng)[6]，血漿藥濃度低，因而需要建立靈敏度高的檢測(cè)方法。液相色譜-質(zhì)譜法具有靈敏度高、檢出限低等特點(diǎn)，適用于人血中沙丁胺醇的檢測(cè)。本研究建立了快速沉淀蛋白結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜測(cè)定人血漿中沙丁胺醇的方法，為沙丁胺醇在臨床應(yīng)用以及非法使用中的檢驗(yàn)鑒定提供有效的方法。

1 儀器與試劑

Acquity 超高效液相色譜系統(tǒng)及化學(xué)工作站，Xevo TQ質(zhì)譜檢測(cè)器；沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所）；甲醇、乙腈、甲酸（色譜純，F(xiàn)isher）；去離子水（Millipore）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用ACQUITY UPLC?HSS T3色譜柱（2.1 mm× 50 mm，1.8 μm）（Waters）；流動(dòng)相A：0.1 %甲酸水；流動(dòng)相B：甲醇；流速：0.6 mL/min；梯度洗脫方式見(jiàn)表1所示；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積2 μL。

表1 梯度洗脫條件Table 1 the conditions of gradient elution

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離源（ESI），正離子掃描；離子源溫度150 ℃；毛細(xì)管電壓3.4 kV；霧化氣溫度500 ℃；霧化氣流速1 000 L/h。掃描方式采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式（MRM）進(jìn)行掃描，離子對(duì)為239.99/221.98、239.99/147.99和239.99/165.97。

2.3 溶液的配制

精密稱(chēng)取沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至10 mL，制成濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。溶液保存在4 ℃冰箱中。

2.4 樣品處理方法

取空白人血漿0.5 mL，加入2 mL乙腈，混勻后振蕩10 min，8 000 r/min離心20 min。取上清液過(guò)0.22 μm的濾膜后供LC-MS/MS分析。

2.5 線性關(guān)系考察

精密稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液加入空白人血漿中使待測(cè)樣品濃度分別為1、5、50、100、200、500、1000 ng/mL，分別進(jìn)行測(cè)定。以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，以濃度（x，ng/mL）為橫坐標(biāo)作線性回歸?；貧w方程為：y=312.21x-128.15；r2=0.9991。結(jié)果表明，沙丁胺醇在濃度為1～1000 ng/mL范圍內(nèi)峰面積與濃度呈線性相關(guān)，最低檢測(cè)濃度為0.1 ng/mL。

2.6 回收率和精密度實(shí)驗(yàn)

取空白人血漿0.5 mL，加入一定量的沙丁胺醇，制備成沙丁胺醇濃度為5.0、50.0 、500.0 ng/mL的樣品，利用相同的方法處理后供LC-MS/MS檢驗(yàn)，結(jié)果三種濃度下沙丁胺醇的回收率分別為76.8 %、85.2 %和93.7 %，RSD分別為1.1 %、2.7 %和7.1 %。利用相同的方法進(jìn)行測(cè)定，得到三種濃度的日內(nèi)RSD分別為2.8 %、5.1 %和6.9 %，日間RSD分別為3.6 %、5.8 %和1.2 %。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將上述制備樣品分別于0、1、5、10、24 h進(jìn)行測(cè)定，以沙丁胺醇峰面積進(jìn)行計(jì)算，RSD為0.52 %。結(jié)果表明，樣品在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3 討論

3.1 沉淀劑的選擇

沉淀蛋白是一種快速簡(jiǎn)單且成本較低的前處理方法，可以使用鹽溶液、重金屬、酸試劑及有機(jī)溶劑等作為沉淀劑，但是對(duì)于質(zhì)譜檢驗(yàn)而言，前三種會(huì)引入新的物質(zhì)，影響質(zhì)譜的檢驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)中選擇利用有機(jī)溶劑對(duì)水的親和力來(lái)破壞蛋白質(zhì)外的水鍵，使蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)使產(chǎn)生沉淀，從而達(dá)到凈化生物檢材的目的。本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈和甲醇兩種沉淀劑，結(jié)果表明用乙腈作為沉淀劑的回收率高于甲醇，且甲醇形成沉淀較為松散，為絮狀型，易與上清液混合，從而降低了提取的回收率。乙腈形成的沉淀較為堅(jiān)實(shí)，為塊狀型，附在試管底部。因而本研究選用乙腈作為沉淀劑，可以有效去除雜質(zhì)，使響應(yīng)靈敏，干擾變小。

3.2 色譜柱的選擇

沙丁胺醇是一種極性較強(qiáng)的物質(zhì)，使用反相色譜柱可能會(huì)導(dǎo)致保留較弱。本文考察了BEH C18、HSS T3、Shield RP18以及HILIC等多種色譜柱，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，適用HSS T3柱色譜峰型較好，無(wú)拖尾現(xiàn)象，分離效果好。HSS T3色譜柱特別適用于反相色譜分離中增強(qiáng)對(duì)極性化合物和代謝物的保留。這個(gè)低配體密度C18色譜柱使分析物能更容易進(jìn)入顆粒材料的孔結(jié)構(gòu)中，為極性和疏水性分子提供均衡的保留性能而無(wú)需使用離子對(duì)試劑，適用于實(shí)驗(yàn)中沙丁胺醇的分離檢驗(yàn)。

3.3 流動(dòng)相的選擇

反相作用色譜一般選用的有機(jī)溶劑為乙腈、甲醇和異丙醇，但在實(shí)驗(yàn)具體的操作溫度下，異丙醇的粘度大，會(huì)使柱壓過(guò)高，因此實(shí)驗(yàn)考察了甲醇和乙腈兩種流動(dòng)相。在水相中，緩沖鹽的種類(lèi)、濃度及水相的pH值都會(huì)影響待測(cè)物質(zhì)的離子化效果，影響待測(cè)物質(zhì)的保留時(shí)間和峰型，從而影響待測(cè)物質(zhì)檢測(cè)的靈敏度。

本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈-水/甲醇、乙腈-水/甲酸胺、乙腈-水/甲酸/甲酸胺、甲醇-水/甲酸、甲醇-水/甲酸胺、甲醇-水/甲酸/甲酸胺體系作為流動(dòng)相，緩沖鹽甲酸胺濃度為5 mmoL/L，甲酸的濃度為0.1 %。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙腈的分離度和穩(wěn)定性不如甲醇，甲醇的峰型較好，靈敏度較高，因此選用甲醇作為最終的有機(jī)相。通過(guò)對(duì)比各流動(dòng)相體系的峰型、出峰時(shí)間、分離度及穩(wěn)定性，最終選擇甲醇-水/ 0.1 %甲酸作為流動(dòng)相。

3.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

質(zhì)譜條件是利用儀器的自動(dòng)優(yōu)化程序進(jìn)行參數(shù)的自動(dòng)優(yōu)化，檢測(cè)的離子源選擇電噴霧電離源（ESI），在上述的色譜條件和質(zhì)譜條件下，選擇多反應(yīng)離子檢測(cè)模式（MRM），將標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣分析，優(yōu)化錐孔電壓和碰撞能，選擇三對(duì)信號(hào)強(qiáng)、干擾小的離子對(duì)作為定性離子對(duì)，在其中選擇響應(yīng)較高的作為定量離子對(duì)。

沙丁胺醇100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液在2.2的實(shí)驗(yàn)條件下，采用多反應(yīng)離子檢測(cè)模式進(jìn)樣進(jìn)行分析。分子式為C13H21NO3，分子量為239.31，在樣品進(jìn)入質(zhì)譜后，儀器在給定的參數(shù)下改變碰撞能量，通過(guò)自動(dòng)檢測(cè)程序給出穩(wěn)定的基峰離子m/z239.99，基峰離子作為母離子進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生三個(gè)子離子碎片m/ z221.98、m/z147.99和m/z165.97，選擇其中豐度較高的m/z147.99子離子作為定量離子。

4 結(jié)論

本研究建立了利用乙腈直接提取的方法結(jié)合LC-MS/MS測(cè)定人血漿中沙丁胺醇的方法，該方法回收率高，重現(xiàn)性好，檢測(cè)限低，且操作簡(jiǎn)單快速，適用于臨床和相關(guān)案件中沙丁胺醇的定性定量檢測(cè)。利用該方法實(shí)施了涉及沙丁胺醇非法使用案件中沙丁胺醇的檢驗(yàn)鑒定，結(jié)果從受害者血漿中檢出沙丁胺醇（圖1）。

圖1 血漿中沙丁胺醇的LC-MS/MS色譜圖Fig 1 LC-MS/MS of salbutamol in plasma

［1］秦永平，鄒遠(yuǎn)高，梁茂植，等. 反相高效液相色譜紫外檢測(cè)法測(cè)定血漿中沙丁胺醇濃度［J］. 中國(guó)藥學(xué)雜志，2000，35（7）：45-47.

［2］ Huang J D, Lin Q, Zhang X M, et al. Electrochemical immunosensor based on polyaniline／poly（acrylic acid）and Auhybrid graphene nanocomposite for sensitivity enhanced detection of salbutamol［J］. Food Res Int, 2011, 44(1): 92-97.

［3］ Zhang D J, Teng Y N, Chen K G, et al. Determination of salbutamol in human plasma and urine using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry and its pharmacokinetic study. Biomed Chromatogr, 2012, 26(10):1176-1182.

［4］ Yan H Y, Wang R L, Han Y H, et al. Screening, recognition and quantitation of salbutamol residues in ham sausages by molecularly imprinted solid phase extraction coupled with highperformance liquid chromatography-ultraviolet detection［J］. Journal of Chromatography B, 2012, 900:18-23.

［5］ Li C, Wu Y L, Yang T, et al. Simultaneous determination of clenbuterol, salbutamol and ractopamine in milk by reversedphase liquid chromatography tandem mass spectrometry with isotope dilution［J］. Journal of Chromatography A,2010,1217 (50):7873-7877.

［6］ 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典(二部) ［Z］. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2005: 842-843.

Determination of Salbutamol in Human Plasma by Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

LUAN Yujing1, QIN Huakai2, WANG Ruihua1, DONG Ying1, DU Hongyan1
(1.Institute of Forensic Science, Ministry of Public Security, Beijing, 100038, China 2. Institute of Forensic Science of Liu Zhou Municipal Public Security Bureau, Liuzhou, 545001, China)

ObjectiveTo develop a UPLC-MS/MS method for determining salbutamol in human plasma.MethodsThe separation of salbutamol was performed on a column of HSS T3（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）. The mobile phase consisted of water solution containing 0.1 % formic acid and methanol. The fow rate was 0.6 mL/min with gradient elution. Salbutamol in human plasma was determined by UPLC-MS/MS.ResultsThe standard curve was linear over the range of 1-1000 ng/mL, and the lowest detectable limit was 0.1 ng/mL. The absolute recovery was more than 70 %. Both of the intra- and interday precision was within 10 % at three concentrations.ConclusionThe procedure was fully validated in terms of sensitivity, selectivity, precision and accuracy. The method developed was applied to the determination of salbutamol in human plasma samples collected from salbutamol-poisoning cases.

ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; human plasma; salbutamol

DF795.1

A

1008-3650(2016)06-0467-003

2016-06-30

格式：欒玉靜，覃華開(kāi)，王瑞花，等. 液相色譜-質(zhì)譜法檢驗(yàn)人血漿中的沙丁胺醇[J]. 刑事技術(shù)，2016,41(6): 467-469.

10.16467/j.1008-3650.2016.06.009

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)基金計(jì)劃項(xiàng)目（No:2013JB009）

欒玉靜（1979—），女，山東龍口人，博士，副研究員，研究方向?yàn)槎疚餀z驗(yàn)鑒定。E-mail:18836705@qq.com