19種擴(kuò)增試劑盒的確證試驗

張慶霞，劉小芳，路志勇，王順霞

（1. 北京市公安司法鑒定中心，北京 100192；2. 北京市昌平區(qū)公安司法鑒定中心，北京 102200）

19種擴(kuò)增試劑盒的確證試驗

張慶霞1，劉小芳2，路志勇1，王順霞1

（1. 北京市公安司法鑒定中心，北京 100192；2. 北京市昌平區(qū)公安司法鑒定中心，北京 102200）

目的測試11種國產(chǎn)試劑盒（包含DNATyperTM15、Goldeneye16A、Goldeneye16BT、Goldeneye16C、Goldeneye20A、Goldeneye BASIC、AGCU17+1、AGCU Expressmarker16、AGCU Expressmarker22、AGCU Expressmarker20、STRtyper-21G）和8種進(jìn)口試劑盒（包含Identifler、ID-Direct、ID-Plus、Sinofler、PowerPlex16、PowerPTheselex16HS、PowerPlex18D、PowerPlex21）的技術(shù)性能指標(biāo)，評估其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用能力，并對各種試劑盒進(jìn)行分析比較。方法制定測試方案，從方法學(xué)、準(zhǔn)確性、均衡性、靈敏度、批次間試劑的穩(wěn)定性、耐受性、適應(yīng)性與一致性、種屬特異性、混合樣本、不同反應(yīng)體系的適應(yīng)性等10個方面進(jìn)行測試。結(jié)果陽性DNA樣本分型正確，內(nèi)標(biāo)和等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物符合要求；等位基因間、同一熒光標(biāo)記基因座間及不同標(biāo)記物間的均衡性較好；試劑盒使用說明書中推薦的最小DNA模板量的陽性DNA樣本均能檢出全部STR基因座分型；不同批次間和反復(fù)凍融后試劑盒測試可以獲得正確分型；對降解檢材和混有抑制劑的樣本等具有一定的耐受性；能對案件中多種檢材進(jìn)行分型且分型結(jié)果一致；各種試劑盒均具有種屬特異性和混合DNA樣本檢測的能力；各種試劑盒在擴(kuò)增體系為25 μL、10 μL時均可以得到完整的DNA分型。結(jié)論所檢測試劑盒在上述性能指標(biāo)等方面已經(jīng)達(dá)到國際同類產(chǎn)品的技術(shù)水平，可用于法庭科學(xué)的實際檢案與建庫。

法醫(yī)物證學(xué)；擴(kuò)增試劑盒；確證試驗；短串聯(lián)重復(fù)序列

本檢測中心受中國安全技術(shù)防范認(rèn)證中心的委托，承擔(dān)法庭科學(xué)產(chǎn)品自愿性認(rèn)證檢測工作。自2009年6月至今共檢測19種擴(kuò)增試劑盒：為了保證這19種試劑盒的檢測質(zhì)量，確保DNA檢測與比對的準(zhǔn)確性，北京市公安局測試組參照國際DNA分析方法科學(xué)工作組制定的確證指南（Revised Validation Guidelines, 2004）[1]，同時依據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《法庭科學(xué)人類熒光標(biāo)記STR復(fù)合擴(kuò)增檢測試劑質(zhì)量基本要求》（GA/T 815-2009），從方法學(xué)、準(zhǔn)確性、峰值均衡性、靈敏度、批次間試劑的穩(wěn)定性測試、耐受性、不同檢材的適應(yīng)性與一致性、種屬特異性、混合樣本[2]、不同反應(yīng)體系的適應(yīng)性等10個方面制定了測試方案?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料及方法

1.1 主要儀器及試劑

9700型PCR熱循環(huán)儀（美國AB公司）；3500XL測序儀（美國AB公司）；7500定量儀（美國AB公司）；19種試劑盒，具體為：公安部物證鑒定中心的DNATyperTM15，北京基點認(rèn)知技術(shù)有限 公 司 的Goldeneye16A、Goldeneye16BT、Goldeneye16C、Goldeneye20A、Goldeneye BASIC，中德美 聯(lián)AGCU17+1、AGCU Expressmarker16、AGCU Expressmarker22、AGCU Expressmarker20，寧波海爾施基因科技STRtyper-21G，美國AB公司的Identifler、ID-Direct、ID-Plus、Sinofler，Promega公司的 PowerPlex16、PowerPlex16HS、PowerPlex18D、PowerPlex21；Qiagen試劑盒；Chelex-100。

1.2 檢測項目與樣本

1.2.1 陽性DNA對照樣本的制備

9947A（10 ng/μ L，Promega，美國）和9948（10 ng/μL，Promega，美國）；陽性DNA對照樣本的定量及制備：用AB 7500進(jìn)行定量檢測，使9947A終濃度分別為1.0，0.5，0.25，0.125，0.0625 ng/μ L，分別編號為A1～A5；9948終濃度為1.0 ng/μ L，編號為A6。

1.2.2 準(zhǔn)確性檢測

取陽性DNA對照樣本A1和A6分別用各種試劑盒進(jìn)行檢驗并重復(fù)1次，判斷分型結(jié)果與說明書上的描述是否一致。

1.2.3 峰值均衡性檢測

分析陽性DNA對照樣本的檢測結(jié)果，等位基因間的峰值均衡性是否大于70 %，同一熒光標(biāo)記基因座間的均衡性是否大于50 %，不同標(biāo)記物間的均衡性是否大于30 %。

1.2.4 靈敏度檢測

取A1～A5樣品各1 μL，分別用各種試劑盒對樣品DNA進(jìn)行檢驗并重復(fù)試驗1次。

1.2.5 批次間試劑的穩(wěn)定性檢測

從各種試劑盒（均在保質(zhì)期內(nèi)）中分別抽取不同批次（標(biāo)注不同生產(chǎn)日期和不同批次）的試劑盒進(jìn)行測試；將各試劑盒中的試劑進(jìn)行反復(fù)凍融1～10次后進(jìn)行檢驗，并重復(fù)1次。

1.2.6 制備、檢測混合樣品

將濃度為1.0 ng/μ L的陽性DNA對照樣本9947A和 9948按 19∶1、18∶2、16∶4、12∶8、10∶10、8∶12、4∶16、2∶18、1∶19的比例進(jìn)行混合，依次編為B1～B9號，4 ℃放置備用。

1.2.7 種屬特異性檢測

豬、牛、馬、狗、雞、鴨、羊、鼠、兔、貓、魚及大腸桿菌的DNA樣品均稀釋為1.0 ng/μ L，分別編號為C1～C12，4 ℃放置備用。

1.2.8 不同檢材適應(yīng)性及一致性

取已知分型的血斑、精斑、唾液斑、脫落細(xì)胞、肌肉組織、帶毛囊的毛發(fā)、軟骨、牙齒各兩份，分別編為D1～D16，分別用《法庭科學(xué)DNA實驗室檢驗規(guī)范》（GA/T 383-2014）中Chelex-100法和磁珠法提取DNA，用AB 7500定量至1.0 ng/μL，4 ℃放置備用。取其中血斑、精斑、唾液斑、肌肉組織和軟骨DNA，分別由不同檢測人員，在不同擴(kuò)增儀和測序儀上進(jìn)行擴(kuò)增和電泳，分析結(jié)果的一致性。

1.2.9 耐受性檢測

降解樣本制備：取1.2.1中濃度為1.0 ng/μ L的9947A 17 μ L與1 μ L Alu I DNA內(nèi)切酶、3 μ L酶切緩沖液、2 μL BSA混合，37 ℃水浴放置60 min，再加1 μL HaeⅢ DNA內(nèi)切酶，兩種酶切緩沖劑各2 μL混合，37 ℃水浴放置60 min[2]。用Qiagen試劑盒純化，濃縮至2 μ L，編號為E1。

含抑制因素的樣品：0.1 %靛藍(lán)1 μ L與1.2.1中濃度為1.0 ng/μ L的9947A樣品10 μ L混合，編號為E2；在1.0 ng/μ L的9947A中，分別加入血紅素，使其終濃度分別為5、10、20、40 μ mol/L，編號為E3-1、E3-2、E3-3、E3-4。

1.2.10 不同反應(yīng)體系的適應(yīng)性檢測

將各試劑盒中反應(yīng)混合液的各組分按照比例縮小，使擴(kuò)增體系分別為25、10、5 μL體系進(jìn)行擴(kuò)增，分析是否可以得到完整的DNA分型。

備注：除ID-Direct、PowerPlex18D兩個直擴(kuò)試劑盒外，其他試劑盒均檢測上述每個項目；IDDirect、PowerPlex18D主要檢測的項目包括對血液樣本的直接擴(kuò)增，種屬特異性、分型準(zhǔn)確性、靈敏度、一致性、峰值均衡性、穩(wěn)定性、批次差等8個方面。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)驗證及分型準(zhǔn)確性

陽性對照樣本9947A和9948進(jìn)行擴(kuò)增得到與這19種試劑盒提供的基因分型一致的結(jié)果，未出現(xiàn)等位基因丟失的情況，峰值在800～5000相對熒光單位（RFU）之間。

所檢測的各種試劑盒的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物的各等位基因分型與其描述的完全一致，每個等位基因分型的峰高大于200 RFU。經(jīng)軟件分析，等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物和陽性DNA對照樣本產(chǎn)生的誤差均在0.5個堿基的容差區(qū)間內(nèi)波動，表明所檢測的試劑盒均能夠準(zhǔn)確判定基因分型[3]。

2.2 峰值均衡性檢測

對陽性DNA對照樣本進(jìn)行檢測，當(dāng)模板量為試劑推薦的最佳用量時，根據(jù)DNA檢測分型的峰高，所檢測的各種試劑盒雜合等位基因間的均衡性均不小于72.62 %，同一熒光標(biāo)記基因座間的均衡性均不小于50.65 %，不同標(biāo)記物間的均衡性均不小于45.46 %。峰值均衡，表明19種試劑盒能夠檢測出樣品的所有等位基因。

2.3 靈敏度測試

根據(jù)試劑盒使用說明書中均推薦的DNA模板量范圍，對19種試劑盒進(jìn)行靈敏度測試。在加入陽性DNA對照樣本量低至試劑盒推薦的最小DNA模板量時，所檢測的19種試劑盒均能檢出全部STR基因座分型，能夠解決法醫(yī)實踐中微量檢材的DNA檢驗。其中試劑盒Identifler、ID-Plus在陽性DNA對照樣本量低至0.0625 ng/μ L時，均能檢出全部STR基因座分型，且靈敏度較高。

2.4 批次間試劑的穩(wěn)定性測試

不同批次的19種試劑盒的重復(fù)檢驗中，結(jié)果穩(wěn)定，無明顯差異。19種試劑盒經(jīng)過10次反復(fù)凍融后，檢驗結(jié)果無明顯變化，說明該試劑盒可以長期保存，檢測結(jié)果穩(wěn)定。

2.5 耐受性檢測

除ID-Direct、PowerPlex18D直擴(kuò)試劑盒未進(jìn)行該項目的檢測外，其他所檢測的17種試劑盒對內(nèi)切酶處理的降解樣本有一定的檢測能力，對現(xiàn)場檢材常見影響PCR的抑制劑如靛藍(lán)和血紅素等[2]采用該17種試劑盒進(jìn)行檢測，靛藍(lán)＜240 mmol/L、血紅素＜20 μmol/L均得到清晰的分型結(jié)果。說明該17種試劑盒對不同條件下的檢材具有一定的耐受性。

2.6 不同檢材適應(yīng)性及一致性檢測

采用Chelex-100、磁珠法等方法提取各類案件常見檢材D1～D16，用所檢測試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，得到完整的分型結(jié)果，未檢見等位基因丟失現(xiàn)象。

不同檢驗人員在不同檢測設(shè)備的條件下，對同一樣本進(jìn)行重復(fù)性檢驗，其分型結(jié)果一致；對已知分型的同一批樣本檢驗時，19種擴(kuò)增試劑盒分型結(jié)果與已知分型無顯著差異。

2.7 種屬特異性測試

C1～C12采用上述19種試劑盒檢測未發(fā)現(xiàn)特異分型，說明所檢測試劑盒能夠用于種屬鑒定，區(qū)分人和非人。

2.8 混合樣本測試

9947A、9948兩者混合比例為19:1、18:2、16:4、12:8、10:10、8:12、4:16、2:18、1:19時， 除ID-Direct、PowerPlex18D等直擴(kuò)試劑盒未進(jìn)行該項目的檢測外，其他所檢測的17種試劑盒均可以準(zhǔn)確判斷兩個DNA樣本每個等位基因的分型。

通過兩個不同樣本不同比例混合檢測，說明該17種試劑盒能夠?qū)旌蠘颖揪哂袡z測能力。

2.9 不同反應(yīng)體系的適應(yīng)性

采用各試劑盒推薦的擴(kuò)增體系進(jìn)行擴(kuò)增，分型結(jié)果均良好，Identifler、ID-Plus兩種試劑盒縮體系至 5μL仍可以得到完整的DNA分型。

3 結(jié)論

3.1 基因座數(shù)量、名稱方面的差異

在本試驗中，采用19種試劑盒共檢測了除性別基因座外的22個STR基因座（D21S11、D8S1179、D7S820、D3S1358、CSF1PO、D16S539、D13S317、 vWA、D18S51、D5S818、FGA、D2S1338、D19S433、TH01、TPOX、PentaE、 D6S1043、PentaD、D12S391、D1S1656、D2S441、D10S1248等）。另外，Goldeneye16BT試劑盒加入了ABO基因分型引物，可對個體進(jìn)行ABO血型的基因分型。各試劑盒包含基因座的情況見表1。

表 1 不同試劑盒基因座統(tǒng)計表Table 1 The STR loci to be tested in the different kits

3.2 可直接擴(kuò)增試劑盒

可用于直接擴(kuò)增DNA樣本的試劑盒包括：AB公司生產(chǎn)的ID-Direct、ID-Plus；Promega公司生產(chǎn)的 PowerPlex 18D、PowerPlex 21；中德美聯(lián)公司生產(chǎn)的AGCU 17+1、AGCU Expressmarker 22；北京基點認(rèn)知技術(shù)有限公司生產(chǎn)的Goldeneye 20A。直擴(kuò)試劑盒可簡化檢驗流程、縮短檢驗時間，尤其在DNA數(shù)據(jù)庫的樣本檢驗中有較好應(yīng)用。

3.3 可快速擴(kuò)增試劑盒

中德美聯(lián)公司生產(chǎn)的AGCU Expressmarker 16、AGCU Expressmarker 22、Promega公司生產(chǎn)的PowerPlex 18直擴(kuò)試劑盒，擴(kuò)增時間短，可80 min完成擴(kuò)增。

3.4 適用于微量檢材、含抑制因素檢材的擴(kuò)增

對降解、含有抑制因素的DNA樣本，所檢測試劑盒均能保持其相應(yīng)的穩(wěn)定性，其中ID-Plus試劑盒對微量或降解檢材的擴(kuò)增效果較佳。

3.5 靈敏度差異

在本次確證試驗中，對該19種試劑盒靈敏度進(jìn)行測試，陽性DNA對照樣本量低至0.125 ng時均能檢出全部STR基因座分型，其中試劑盒Identifler、ID-Plus在樣本量低至0.0625 ng/μ L時，均能檢出全部STR基因座分型，且靈敏度較高，能夠解決法醫(yī)實踐中微量檢材的DNA檢驗。

通過對4個公司11種國產(chǎn)試劑盒和2個公司8種進(jìn)口試劑盒的10個方面進(jìn)行測試，峰值均衡，檢驗結(jié)果穩(wěn)定，具有較高的檢測靈敏度，不同批次的試劑盒分型準(zhǔn)確，對不同檢材有很好的適應(yīng)性，對降解、含有抑制因素的DNA樣本具有較強(qiáng)的耐受性，能夠區(qū)分人與非人，并能夠?qū)旌蠘颖綝NA進(jìn)行正確分型，對不同反應(yīng)體系的適應(yīng)性較好。說明該19種試劑盒在上述性能指標(biāo)等方面已經(jīng)達(dá)到了GA/T 815-2009的技術(shù)要求，可用于法庭科學(xué)的檢案與建庫。

［1］ Scientifc Working Group on DNA Analysis Methods (SWGDAM). Revised Validation Guidelines[EB/OL]. (2014-04-21). http://www.fbi.gov/about-us/lab/forensicscience-communications/fsc/july2000/codispre.htm/codis2a.htm.

［2］ 王潔，黃艷梅，張慶霞，等. 國產(chǎn)GoldeneyeTM 20A 試劑盒性能指標(biāo)驗證［J］. 中國法醫(yī)學(xué)雜志，2012，27（1）：12-15.

［3］ 姜成濤，葉健，趙興春，等. DNATyperTM15試劑盒的確證試驗［J］. 中國法醫(yī)學(xué)雜志，2008，23（2）：73-76,81

Validation of 19 Kits for PCR Amplifcation

ZHANG Qingxia, LIU Xiaofang, LU Zhiyong, WANG Shunxia
(1. Judicial Identifcation Center of Beijing Public Security Bureau, Beijing, 100192, China; 2. Forensic Science Service of Changping Branch of Beijing Public Security Bureau, 102200, China)

ObjectiveThe performance of 11 homemade PCR amplification kits (DNATyperTM15, Goldeneye16A, Goldeneye16BT, Goldeneye16C, Goldeneye20A, Goldeneye BASIC, AGCU17+1, AGCU Expressmarker16, AGCU Expressmarker22, AGCU Expressmarker20, STRtyper-21G) was to test and their forensic applicability evaluated together with the 8 foreign counterparts (Identifiler, ID-Direct, ID-Plus, Sinofiler, PowerPlex16, PowerPlex16HS, PowerPlex18D, PowerPlex21) in this paper.MethodsValidation protocols were designed to comply with the guidelines issued by the Scientifc Working Group on DNA AnalysisMethods(SWGDM). The evaluation of the 19 kits for PCR amplifcation was carried out in terms of genotyping method, precision and accuracy, peak height balance, sensitivity, stability, survivability, adaptability and consistency for various samples, species specifcity, mixed samples, and the suitability into different reaction systems.ResultsThe DNA genotyping results from all the 19 kits were accurate with the positive control sample while the requirements were met by their internal standard and ladder. The 19 kits for PCR amplifcation were able to be amplifed successfully and to genotype clearly and efficiently, meanwhile there was no peak height imbalances leveling at high sensitivity obtained. Genotyping results were correct among different batches of the same kits even subjected to repeated freezing/melting. The 19kits were also capable of being used in some degraded and/or inhibitory DNA samples, and well performed with revealing the consistent genotypes for the DNA from various sources. These kits were highly specifc for human DNA and able to genotype for mixed samples. For different amplifying reaction setting-ups, the 19 kits were capable of getting the consistent genotypes.ConclusionAll the 19 kits for PCR amplifcation are suitable for both the routine casework and DNA database construction in forensic practice.

forensic biological evidence; PCR amplifcation kits; validation test; short tandem repeat (STR)

DF795.2

B

1008-3650(2016)06-0507-05

2015-11-30

格式：張慶霞，劉小芳，路志勇，等. 19種擴(kuò)增試劑盒的確證試驗[J]. 刑事技術(shù)，2016,41(6):507-511.

10.16467/j.1008-3650.2016.06.019

張慶霞（1978—），女，河南淮陽人，碩士，副主任法醫(yī)師，研究方向為法醫(yī)遺傳學(xué)。E-mail: qingxiazhang@sina.com