含pPpa的水通道蛋白AQPZ在無細胞體系中的表達及其水過濾特性

莊冰佳, 于道永, 黃 磊, 徐志南, 蔡 謹

(1. 浙江大學 化學工程與生物工程學院, 浙江 杭州 310027；

2.中國石油大學(華東) 化學工程學院, 山東 青島 266580)

含pPpa的水通道蛋白AQPZ在無細胞體系中的表達及其水過濾特性

莊冰佳1, 于道永2, 黃 磊1, 徐志南1, 蔡 謹1

(1. 浙江大學 化學工程與生物工程學院, 浙江 杭州 310027；

2.中國石油大學(華東) 化學工程學院, 山東 青島 266580)

水通道蛋白Z(AQPZ)具有水選擇專一性強、滲透性高等特點，可廣泛用于制備水回收和脫鹽的生物仿生膜。定點突變詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的酪氨酸-tRNA合成酶(tyrosyl-tRNA synthetase, TyrRS)，使其可催化非天然氨基酸(丙炔氧基-L-苯丙氨酸(p-propargyloxyphenylalanine,pPpa))合成對應氨酰tRNA。將上述轉(zhuǎn)運系統(tǒng)與大腸桿菌無細胞體系結(jié)合，在AQPZ的特定位點引入了pPpa將改性的AQPZ（P-AQPZ）重構到1,2-二油?；字Ｄ憠A(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC)，經(jīng)停留光譜分析，其水滲透因子Pf值為3.42×10-4m·s-1，是AQPZ的2.78倍。用截留反滲透裝置分析發(fā)現(xiàn)P-AQPZ仿生膜的水通量高于AQPZ仿生膜并可保持較高的截鹽率。

非天然氨基酸；水通道蛋白Z；基因編碼；生物仿生膜；無細胞體系

1 前 言

利用基因編碼非天然氨基酸技術[1]已可將90多種非天然氨基酸成功用于編碼蛋白質(zhì)[2]。Schultz[2]發(fā)現(xiàn)古細菌詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的酪氨酸-tRNA合成酶(tyrosyl-tRNA synthetase, TyrRS)與對應的tRNA(MjTyrRS/MjtRNATyr)能夠識別終止密碼子TAG而產(chǎn)生轉(zhuǎn)運酪氨酸的作用。因此如果目的基因中含有TAG密碼子，利用該轉(zhuǎn)運系統(tǒng)就可以避免翻譯終止并在此位點定點插入酪氨酸。進一步研究[3]發(fā)現(xiàn)，突變MjTyrRS/MjtRNATyr可以轉(zhuǎn)運某些非天然氨基酸到目的基因的TAG密碼子上，從而增強蛋白性能，穩(wěn)定蛋白結(jié)構，甚至產(chǎn)生新的功能。

水通道蛋白Z(AQPZ)[4]在水分子進出大腸桿菌細胞膜的過程中起關鍵作用。AQPZ對蛋白酶和汞離子具有抗性，且不易被其他生物大分子抑制[5]，因此在仿生廢水回收以及海水淡化領域具有重要的應用價值[6,7]。傳統(tǒng)生物仿生膜以流動鑲嵌模式將AQPZ嵌入兩親性雙嵌段聚合物或天然磷脂雙分子層中[8]，但這種以疏水作用嵌入的水通道蛋白較易流失，從而影響整個膜的使用性能與壽命。

近年來針對含功能膜通道蛋白的仿生膜，研究者開展了一系列工作來增強膜的性能。本文首次從改性水通道蛋白這一角度出發(fā)，擬在AQPZ蛋白中基因編入非天然氨基酸而改變其肽鏈結(jié)構，使其氨基酸殘基中含有炔基，為制備多樣的穩(wěn)定型生物仿生膜提供新的可能。研究通過定點突變來源于詹氏甲烷球菌中的TyrRS，使其可催化非天然氨基酸(丙炔氧基-L-苯丙氨酸 (p-propargyloxyphenylalanine, pPpa))合成對應的氨酰tRNA。繼而，在無細胞表達體系中，將pPpa引入AQPZ，表達形成P-AQPZ。將P-AQPZ和1,2-二油酰基磷脂酰膽堿(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DOPC)組裝成脂蛋白體，利用停留光譜分析其透水功能，測定水通道蛋白的活性。采用靜電吸附法制備水通道蛋白嵌入的生物仿生膜，通過截流反滲透裝置測定仿生膜的分離性能。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 實驗菌株與質(zhì)粒

實驗菌株：大腸桿菌Escherichia coli DH5α，Escherichia coli BL21(DE3)(Novangen,USA)；

質(zhì)粒：pIVEX2.4c、pIVEX2.4c-AqpZ、pETDuet-CK-T7、pUC-MjtRNA；

菌株和質(zhì)粒均為本實驗室保藏。

2.1.2 試劑

DOPC購于Avanti公司；丙炔氧基-L-苯丙氨酸(p-propargyloxyphenylalanine, pPpa)[9]由Amatek Chemical公司合成；限制性內(nèi)切酶、LA Taq DNA 聚合酶和T4 DNA 連接酶均購自Takara。PCR 擴增所用的引物及基因片段由上海生工合成；Western-blot相關試劑購自碧云天生物技術研究所；聚乙烯亞胺和聚苯乙烯磺酸鈉均購自Sigma公司；SM-2生物珠購自Bio-rad公司。

2.2 方法

2.2.1 載體構建

1.TyrRS的突變

以p15a-MjtyrRS為模板，利用RS F2/ RS R4和RS F4/ RS R2兩對引物通過PCR擴增獲得兩個DNA片段，將這兩個DNA片段同源重組得到含三個位點突變(Tyr32Ala/Glu107Pro/Leu162Ala)的氨酰tRNA合成酶質(zhì)粒。以上述突變質(zhì)粒為模板，利用RS F1/ RS R3和RS F3/ RS R1兩對引物，進行第二輪突變獲得包含5個位點(Tyr32Ala/Glu107Pro/Leu162Ala/Phe110Ala/Asp158Ala)突變的TyrRS，突變后的氨酰tRNA合成酶命名為MjpPpaRS，獲得p15a-MjpPpaRS質(zhì)粒。以質(zhì)粒p15a-MjpPpaRS 為模板進行PCR即可得到MjpPpaRS基因，將PCR擴增的MjpPpaRS基因片段用NcoI/BamHI酶切處理連接到pIVEX2.4c上得到重組質(zhì)粒pIVEX2.4c-MjpPpaRS。

2.AQPZ的定點突變

對AQPZ的F10、F13、F17三個位點進行琥珀突變，以pIVEX2.4c-AqpZ為模板，用引物aqpz32-36-F/aqpz32-36-R和aqpz48-F/aqpz48-R進行兩輪全質(zhì)粒PCR后獲得pIVEX2.4c-AqpZ TAG，所用引物見表1。

2.2.2 大腸桿菌S30-MjpPpaRS/MjtRNA和S30-pETDuet-CK-T7抽提物制備

將pUC-MjtRNA與p15a-MjpPpaRS兩種質(zhì)粒導入同一個E. coliBL21(DE3)細胞中用于大腸桿菌無細胞表達體系抽提物的制備。用含有T7 RNA聚合酶(T7)與磷酸丙酮酸激酶(CK)兩個基因的pETDuet-CK-T7質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coliBL21(DE3)細胞，利用其制成大腸桿菌抽提物。大腸桿菌抽提物制備主要參照Kim DM等[10]的方法，將發(fā)酵得到的大腸桿菌菌體進行高壓破碎后離心獲得上清液，上清液于37℃孵育2 h后在超低溫(-80℃)冰箱冷凍儲藏，分批取用。

2.2.3 大腸桿菌無細胞表達蛋白及其純化

大腸桿菌無細胞表達體系的配置如表2所示。

在224 μL無細胞反應體系[11]中加入終濃度為1.0%的Brij-78用于P-AQPZ可溶性表達。224 μL大腸桿菌無細胞表達體系在37℃恒溫金屬浴中以400 r·min-1振蕩反應4 h后，12000 g離心10 min，分離反應液中的上清液和沉淀。用平衡緩沖液(20 mmol·L-1Tris-HCl，pH 7.8，300 mmol·L-1NaCl，10 mmol·L-1imidazole，0.05% Brij-78)將上述無細胞反應上清蛋白液稀釋5倍(即將800 μL平衡緩沖液與200 μL蛋白液混合)，加入1 mL Ni2+-NTA樹脂，4℃、120 r·min-1震蕩1 h。用5 mL的平衡緩沖液沖洗未與Ni2+-NTA樹脂結(jié)合的可溶性雜蛋白。再用1 mL的洗脫緩沖液(MOPS-KOH、pH 7.5，300 mmol·L-1imidazole，0.05% Brij-78)洗脫得到目標蛋白。

表1 突變所用引物Table 1 Primers designed for mutation

表2 大腸桿菌無細胞表達體系組分表Table 2 Composition ofE. colicell-free system

2.2.4 AQPZ和P-AQPZ脂蛋白體的制備

AQPZ和P-AQPZ蛋白溶液終濃度為100 μg·mL-1，DOPC脂質(zhì)體溶液[8]終濃度為4 mg·mL-1，Triton X-100終濃度為0.25%(m/v)。25℃、120 r·min-1下震蕩30 min后以0.2 g·mL-1加入SM-2生物珠繼續(xù)震蕩2 h。吸取上清液超速離心(300,000 g、15 min、4℃)，沉淀用MOPS-KOH緩沖液(100 mmol·L-1、pH 7.5)洗滌一遍后，再次用MOPS-KOH緩沖液(100 mmol·L-1、pH 7.5)重懸得到AQPZ和P-AQPZ脂蛋白體。

2.2.5 AQPZ和P-AQPZ脂蛋白體的透水功能分析

采用停留光譜[12](SFM-300，BioLogic)測量脂蛋白體的透水功能。將等體積的AQPZ脂蛋白體溶液和高滲溶液(100 mmol·L-1MOPS-KOH、pH 7.5，400 mmol·L-1NaCl)混合，測定條件參數(shù)：Ex = 436 nm，(25.0±0.1)℃。數(shù)據(jù)符合指數(shù)增長方程Y=Ae-kx+y0[13]。

2.2.6 AQPZ和P-AQPZ生物仿生膜的制備和分離性能表征

本文采用靜電吸附的方法[14]制備水通道蛋白嵌入的生物仿生膜。通過截流反滲透裝置測定仿生膜的分離性能。測試有效膜面積為19.56 cm2，測試壓強為4 bar，原料液為 500 ppm NaCl，平行測定三組數(shù)據(jù)后取平均值。水通量計算公式、膜的截留率計算公式參考王欽滬等人[13]的工作。

3 結(jié)果與討論

3.1 水通道蛋白突變位點和非天然氨基酸的選擇

水通道蛋白中插入非天然氨基酸會影響其透水性能及空間結(jié)構，同時非天然氨基酸的插入位點也會影響其與磷脂接觸發(fā)生交聯(lián)反應的效率。因此，氨基酸突變位點選擇的原則為：1、避開其活性中心；2、在水通道蛋白的外側(cè)可與磷脂雙分子層接觸。通過對AQPZ蛋白的結(jié)構分析，F(xiàn)10、F13和F17三個氨基酸不在其活性中心且位于蛋白的外側(cè)，因此選擇在上述三個位點引入非天然氨基酸以改進AQPZ性能。pPpa為疏水性非天然氨基酸，因此替換AQPZ中的F10、F13和F17三個苯丙氨酸對水通道蛋白的空間結(jié)構及功能影響相對較小。而且pPpa殘基中含乙炔基團，可與多種基團形成共價鍵而增強整個生物仿生膜的強度。因此本研究選用pPpa作為插入的目標非天然氨基酸。

3.2 M jpPpaRS和MjtRNA的功能驗證

定點突變氨酰tRNA合成酶MjpPpaRS和MjtRNA使其具有編碼pPpa的活性。將pPpa添加到大腸桿菌無細胞表達體系中，考察含琥珀突變AQPZ的表達情況。對比圖2中2、3、4、5泳道可以看出，當體系中不添加pPpa時AQPZ蛋白的可溶部分和不可溶部分均檢測不到蛋白表達，當添加2 μL pPpa時，在不可溶部分可見有AQPZ表達。證明本研究所構建的MjpPpaRS/MjtRNA可以識別終止密碼子，并成功將pPpa編碼入蛋白質(zhì)。為進一步提高目標蛋白的表達量，將pIVEX2.4c-MjpPpaRS質(zhì)粒添加入無細胞表達體系中，提高MjpPpaRS在無細胞表達體系中的含量以提高P-AQPZ的表達量。對比圖2中4、8兩泳道可以看出，在50 μL無細胞體系中加入5 μL pIVEX2.4c-MjpPpaRS質(zhì)粒，P-AQPZ表達量最高，達到48 mg·L-1(Quantity One(Bio-Rad)分析得到)，是不添加pIVEX2.4c-MjpPpaRS質(zhì)粒時的4倍。

圖1 非天然氨基酸結(jié)構示意圖Fig.1 Structure ofp-propargyloxyphenylalanine

3.3 AQPZ和P-AQPZ表達純化及功能檢測

前期工作中發(fā)現(xiàn)在表達體系中添加Brij-78可提高P-AQPZ的可溶性[13]。如圖3所示，當表達體系中不添加Brij-78時，P-AQPZ基本以沉淀形式表達(Control)，而當加入終濃度為1.0% Brij-78后，可溶P-AQPZ蛋白比例為56%，產(chǎn)量達最高值。 用Ni2+-NTA樹脂純化，得到濃度為280 mg·L-1的可溶性P-AQPZ。

圖2 無細胞體系表達P-AQPZFig.2 Expression of P-AQPZ under different conditions Lane 1, markers； Lane 2, Pellet without pPpa； Lane 3, Supernatant without pPpa； Lane 4, Pellet with pPpa； Lane 5, Supernatant with pPpa； Lane 6, Pellet without plasmid addition； Lane 7, Supernatant without plasmid addition； Lane 8, Pellet with pPpa and pIVEX2.4c-MjpPpaRS； Lane 9, Supernatant with pPpa and pIVEX2.4c-MjpPpaRS

圖3 大腸桿菌無細胞體系表達P-AQPZFig.3 Western-blot analysis of P-AQPZ in cell-free system with and without 1.0% Brij-78. S, Supernatant； P, Pellet.

制備AQPZ和P-AQPZ脂質(zhì)體后采用停留光譜測定其透水功能。DOPC脂質(zhì)體、AQPZ和P-AQPZ脂蛋白體的水通透因子Pf值見圖4。P-AQPZ脂蛋白體的Pf值為3.42×10-4m·s-1；AQPZ脂蛋白體的Pf值為1.23×10-4m·s-1；未崁蛋白的脂質(zhì)體的Pf值為5.01×10-5m·s-1。AQPZ和P-AQPZ脂蛋白體的透水速率明顯比未崁入蛋白的脂質(zhì)體大，而且P-AQPZ脂蛋白體比AQPZ脂蛋白體的透水速率更高，Pf值大2.78倍。表明所制備的P-AQPZ具有明顯的濾水活性，且相較于AQPZ活性提高顯著。推測非天然氨基酸的編入可能使水通道蛋白與磷脂的親和性增強，使水通道蛋白在嵌入磷脂雙分子層后更穩(wěn)定存在。

3.4 A QPZ和P-AQPZ仿生膜分離性能

為了進一步地驗證P-AQPZ的透水功能，并探索其在濾水生物仿生膜中的應用，研究制備了嵌入P-AQPZ和AQPZ的磷脂納濾膜，分析并對比其分離性能。根據(jù)文獻[12]報道，本文采用水通道蛋白與磷脂(DOPC)的質(zhì)量比例(PLR)為1/50。水通量是表征膜分離能力的一個重要指標。水通量結(jié)果見圖5，基膜的水通量為20.8 L·(m2·h)-1，未嵌入水通道蛋白時(即圖5中的DOPC柱顯示)水通量為6.3 L·(m2·h)-1，嵌入AQPZ時的水通量為18.7 L·(m2·h)-1，嵌入P-AQPZ時的水通量為19.9 L·(m2·h)-1?？梢姡ǖ赖鞍椎那度胧狗律さ乃匡@著提升，接近于基膜的通量，其中P-AQPZ比AQPZ的通水性能更優(yōu)異。截鹽率是評價膜分離性能的另一個重要指標，加入水通道蛋白后的仿生膜的截鹽率仍能得到保持并有提高(圖5)。仿生膜在水通道蛋白未嵌入時截鹽率為43.8%，當嵌入AQPZ時截鹽率為60.7%，嵌入P-AQPZ時截鹽率為68.3%。這說明水通道蛋白確實對仿生膜水通量的提高有明顯幫助，且非天然氨基酸的引入沒有影響AQPZ的透水功能。

圖4 停留光譜測定AQPZ和P-AQPZ的透水效率Fig.4 Stopped-flow light scattering results of AQPZ and P-AQPZ proteoliposomes

圖5 AQPZ和P-AQPZ仿生膜的水通量和截鹽率Fig.5 Water flux and NaCl rejection of AQPZ and P-AQPZ based biomimetic membranes

4 結(jié) 論

本研究通過突變詹氏甲烷球菌的TyrRS，獲得了可轉(zhuǎn)運非天然氨基酸pPpa的氨酰tRNA合成酶（MjpPpaRS），并成功將其應用于大腸桿菌無細胞體系中表達含非天然氨基酸的P-AQPZ。通過向大腸桿菌無細胞體系添加pIVEX2.4c-MjpPpaRS質(zhì)粒增加了P-AQPZ的表達量。含pPpa的水通道蛋白P-AQPZ最高表達量為48 mg·L-1，純化濃縮后的最高濃度分別達到280 mg·L-1。經(jīng)停留光譜檢測，P-AQPZ的透水能力較AQPZ提高顯著。本工作為制備穩(wěn)定型高性能濾水生物仿生膜提供了新的思路。

[1] Wang L, Brock A, Herberich B,et al.Expanding the genetic code ofEscherichia coli[J]. Science, 2001, 292(5516): 498-500.

[2] Liu C C , Schultz P G. Adding new chemistries to the genetic code [J]. Annual Review of Biochemistry, 2010, 79(1): 413-444.

[3] Deiters A, Schultz P G. In vivo incorporation of an alkyne into proteins inEscherichia coli[J]. Bioorganic and Medi cinal Chemistry Letters, 2005, 15(5): 1521-1524.

[4] Morten ?. Jensen, Ole G. Mouritsen. single-channel water permeabilities ofEscherichia coliaquaporins AqpZ and glpF [J]. Biophysical Journal, 2006, 90(7): 2270-2284.

[5] Borgnia MJ, Kozono D, Calamita G,et al. Functional reconstitution and characterization of AqpZ, theE. coliwater channel protein [J]. Molecular Biology, 1999, 291(5): 1169-1179.

[6] Yuexiao S, Manish K, Erbakan M,et al. Biomimetic membranes:A review [J]. Journal of Membrane Science, 2014, 454: 359-381.

[7] YU Zhi-yuan (于致源), DING Wan-de (丁萬德), WANG Zhi-ning (王志寧). Preparation and application of aquaporin containing biomimetic membranes for water treatment and desalination (含Aqp仿生膜在水處理中的應用) [J]. Progress in Chemistry (化學進展), 2015, 27(7): 953-962.

[8] Li X S, Tovres J, Tang S,et al. Preparation of high performance nanofiltration (NF) membranes incorporated with aquaporin Z [J]. Journal of Membrane Science, 2014, 450(2): 181-188.

[9] Liu W S, Brock A, Schultz P G,et al. Genetic incorporation of unnatural amino acidsinto proteins in mammalian cells [J]. Nature methods, 2007(4): 239-244.

[10] Kim T W, Keum J W, Park C G,et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system [J]. Journal of Biotechnology, 2006, 126(4): 554-561.

[11] Kai L, Kaldenhoff R, Lian J,et al. Preparative scale production of functional mouse aquaporin 4 using different cell-free expression modes [J]. PLOS ONE, 2010, 5(9): e12972.

[12] Zhao Y, Vararattanavech A, Tang C Y, et al. Effects of proteoliposome composition and draw solution types on separation performance of aquaporin-based proteoliposomes: implications for seawater desalination using aquaporin-based biomimetic membranes [J]. Environmental Science and Technology, 2013, 47(3): 1496-1503.

[13] WANG Qin-hu (王欽滬), HUANG Lei (黃磊), CAI Jin (蔡謹), et al. The cell free expression and function characterization of AqpZ with his tag (含his標簽水通道蛋白AqpZ的體外表達和功能表征) [J]. Chemical Engineering (化學工程), 2015, 43(12): 58-61.

[14] Wang M Q, Wang X D, Wang Z N, et al. Layer-by-layer assembly of aquaporin Z-incorporated biomimetic membranes for water purification [J]. Environmental Science and Technology, 2015, 49(6): 3761-3768.

Expression of p-Propargyloxyphenylalanine-Containing Aquaporin Z in Cell-Free System and its Application in Water Filtration

ZHUANG Bing-jia1, YU Dao-yong2, HUANG Lei1, XU Zhi-nan1, CAI Jin1
(1. College of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China；
2. College of Chemical Engineering, China University of Petroleum(East China), Qingdao 266580, China)

Aquaporin Z (AQPZ) is a typical orthodox aquaporin with high water permeability and selectivity, and it could be widely used in biomimetic membrane for water recycling and desalination. Site-specific mutagenesis of tyrosyl-tRNAsynthetase (TyrRS) from Methanococcus jannaschii was processed to synthesize corresponding amino acyl tRNA from unnatural amino acids (p-propargyloxyphenylalanine,pPpa). pPpa was then site-specifically incorporated into AQPZ by combining the above transfer system with a Escherichia coli cell-free system, and the modified AQPZ was reconstituted into 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) liposomes and analyzed by stopped-flow spectroscopy. The results show that the osmotic water permeability value (Pf) of the modified AQPZ proteoliposomes is 3.42×10-4m·s-1, which is 2.78 times higher than that of the AQPZ proteoliposomes. The layer-by-layer membrane embedded with the modified AQPZ demonstrates higher water flux than the AQPZ embedded membrane with same high salt rejection rates.

unnatural amino acids； aquaporin Z； genetic incorporation； biomimetic membrane；cell-free system

Q786

A

10.3969/j.issn.1003-9015.2016.00.039

1003-9015(2016)06-1335-06

http://www.cnki.net/kcms/detail/33.1141.TQ.20161220.1103.002.html

2016-04-12；

：2016-05-30。網(wǎng)絡出版時間：2016-12-20 11:03:31

國家自然科學基金資助項目(21276226，21306164)。

莊冰佳(1991-)，女，浙江杭州人，浙江大學碩士生。

：蔡謹，E-mail：caij@zju.edu.cn