基于中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析的血清替代物濃度優(yōu)化

陳小東, 蔡海波, 譚文松

(華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200237 )

基于中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析的血清替代物濃度優(yōu)化

陳小東, 蔡海波, 譚文松

(華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200237 )

細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞(Cytokine-induced killer cells，CIK cells)是一類廣泛應(yīng)用的腫瘤過(guò)繼免疫療法的效應(yīng)細(xì)胞，其體外擴(kuò)增過(guò)程中常需要使用無(wú)血清培養(yǎng)基。今以胰島素、亞麻酸、膽固醇和乙醇胺4種可替代血清促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)增的組份為研究對(duì)象，采用中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析相結(jié)合的方法，考察上述組分的濃度以及相互作用對(duì)單個(gè)核細(xì)胞擴(kuò)增的影響，得到了可支持單個(gè)核細(xì)胞擴(kuò)增的最優(yōu)濃度，分別為10、5.66、19.86和1.22 mg·L-1。將上述4種組分以優(yōu)化的濃度添加到DMEM/F12和IMDM以1:1體積比混合而成的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，制成無(wú)血清培養(yǎng)基Optimizer。以含10% FBS的RPMI 1640為對(duì)照，采用半量稀釋法培養(yǎng)臍血單個(gè)核細(xì)胞，以培養(yǎng)14天的總細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)、細(xì)胞組成、CD3+CD56+細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)以及對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性為指標(biāo)，評(píng)價(jià)了制成的無(wú)血清培養(yǎng)基Optimizer支持CIK細(xì)胞擴(kuò)增的效果。結(jié)果顯示，采用所制備的無(wú)血清培養(yǎng)基Optimizer，總細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)為56.54±18.87，明顯高于SFM1的5.14±1.03(p<0.05)和SFM2的3.59±0.56(p<0.05)，與含10%FBS的RPMI 1640的35.24±20.92(p>0.05)接近；CD3+細(xì)胞為97.98%±1.41%，與含10% FBS的RPM I1640的94.34%±1.29%相當(dāng)(p>0.05)；盡管CD3+CD56+細(xì)胞比例18.17%±7.38%低于含10% FBS的RPMI 1640中的數(shù)值25.49%±3.35%(p<0.05)，但兩種培養(yǎng)基的CD3+CD56+細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)分別為440.86±222.89和429.27±249.16，沒(méi)有顯著性差異(p>0.05)；當(dāng)效靶分別為9:1時(shí)分別采用兩種培養(yǎng)基擴(kuò)增的細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性均能達(dá)到50%以上。該研究結(jié)果為用于CIK細(xì)胞體外擴(kuò)增的無(wú)血清培養(yǎng)基的開發(fā)提供了依據(jù)。

細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞；無(wú)血清培養(yǎng)基；血清替代物；響應(yīng)面分析

1 前 言

細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(Cytokine-induced killer cells，CIK cells)為主體的腫瘤過(guò)繼免疫治療已逐漸成為腫瘤生物治療中最活躍的應(yīng)用與研究領(lǐng)域之一。CIK細(xì)胞在臨床上的應(yīng)用是直接以細(xì)胞為治療手段，輸注給病人，其在劑量上有一定的要求。其中的CD3+CD56+細(xì)胞是CIK細(xì)胞的主要效應(yīng)細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞的殺傷過(guò)程中起主要作用[1,2]。CIK細(xì)胞培養(yǎng)的起始細(xì)胞通常來(lái)自腫瘤患者的血液?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞，然而血液?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞中的CD3+CD56+細(xì)胞的含量很低[3,4]，達(dá)不到臨床治療要求。因此，需要對(duì)單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)擴(kuò)增，以獲得足夠數(shù)量的CIK細(xì)胞。在CIK細(xì)胞擴(kuò)增過(guò)程中，以臨床標(biāo)準(zhǔn)而言，不允許是異源血清，必須采用無(wú)血清培養(yǎng)才更符合臨床及安全的要求。近些年來(lái)，無(wú)血清培養(yǎng)基開發(fā)應(yīng)用領(lǐng)域飛速發(fā)展，無(wú)血清培養(yǎng)基因其化學(xué)組成的成分明確、批次差異小、外源感染風(fēng)險(xiǎn)低、易于統(tǒng)一規(guī)?；苽浜凸芾淼葍?yōu)越性能已成為生物制藥以及細(xì)胞治療領(lǐng)域的最佳選擇。然而目前臨床通常采用的無(wú)血清培養(yǎng)基大多是進(jìn)口的商業(yè)培養(yǎng)基，客戶以及科研工作者對(duì)其中成分及濃度可能一無(wú)所知，因此無(wú)法通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)基里的組分種類及其濃度對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增的過(guò)程進(jìn)行控制，這樣往往使得擴(kuò)增效果不可控、細(xì)胞質(zhì)量不能保證。因此，自主開發(fā)一種成分明確的無(wú)血清培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)CIK細(xì)胞就顯得非常必要。

為此，本文在前期的研究初步篩選得到的血清替代物中發(fā)現(xiàn)，胰島素、亞麻酸、膽固醇和乙醇胺對(duì)CIK細(xì)胞的體外擴(kuò)增有重要作用，并且存在交互作用，然而其作用濃度并未得到優(yōu)化。優(yōu)化因子濃度的科學(xué)方法有很多，其中的中心組合設(shè)計(jì)(central composite design，CCD)和響應(yīng)面分析(response surface analysis，RSA)廣泛應(yīng)用于因子數(shù)較少且存在交互作用時(shí)的濃度優(yōu)化過(guò)程[5~7]。該方法將因子與目標(biāo)響應(yīng)值之間的復(fù)雜關(guān)系以及因子間的交互作用通過(guò)多元方程的形式擬合出來(lái)，進(jìn)而繪制出更為直觀的曲面圖，將各因子最優(yōu)值的求取轉(zhuǎn)化成數(shù)學(xué)上有邊界條件限制的多元函數(shù)最值的計(jì)算。該方法思路清晰，求解簡(jiǎn)單易行。本文以單個(gè)核細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)為目標(biāo)響應(yīng)值，通過(guò)中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析優(yōu)化上述4種因子的濃度配比，以期獲得可支持CIK細(xì)胞的體外擴(kuò)增血清替代物組合。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 細(xì)胞

本研究所使用的細(xì)胞為由健康婦女新鮮臍帶血分離得到的單個(gè)核細(xì)胞。K562細(xì)胞來(lái)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

2.1.2 培養(yǎng)基

無(wú)血清培養(yǎng)基SFM1，瑞士的Lonza公司；無(wú)血清培養(yǎng)基SFM2、基礎(chǔ)培養(yǎng)基RPMI 1640、DMEM/F12和IMDM，Life Technonogy公司；血清，法國(guó)Biowest公司。

2.1.3 細(xì)胞因子

重組人白細(xì)胞介素2(rIL-2)、重組人 γ 干擾素(IFN-γ)、重組人白細(xì)胞介素1(rIL-1α)，美國(guó)Perotech公司；鼠抗人CD3單克隆抗體(OKT-3)，美國(guó)eBioscience公司；植物血凝素(PHA)，Sigma試劑公司。

2.1.4 試劑

乙醇胺、亞麻酸、膽固醇，Sigma試劑公司；胰島素，合作企業(yè)提供；CCK-8 kit，上海東仁(Dojindo)化學(xué)科技有限公司。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 單個(gè)核細(xì)胞的培養(yǎng)

新鮮臍帶血通過(guò)密度梯度離心(400 g，30 min)分離得到單個(gè)核細(xì)胞。以一定密度接種，并添加1000 U·mL-1的rIFN-γ。接種當(dāng)天以第0天計(jì)，于接種24 h后補(bǔ)加500 U·mL-1的rIL-2、50 ng·mL-1的OKT-3、100 U·mL-1的rIL-1α。37℃，5%CO2培養(yǎng)一定時(shí)間后取樣，臺(tái)盤蘭染色計(jì)取活細(xì)胞密度，并計(jì)算細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)。

2.2.2 細(xì)胞表型分析

采用FITC-CD3、PerCP-CD8和PE-CD56流式抗體(均為美國(guó)BD Bioscience公司)標(biāo)記細(xì)胞[8]。使用FASCCallibur(美國(guó)BD Bioscience公司)進(jìn)行細(xì)胞表型檢測(cè)，使用FlowJo 7.6軟件進(jìn)行細(xì)胞表型分析。

2.2.3 CIK細(xì)胞細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

分別以擴(kuò)增后的總細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞(E)與靶細(xì)胞K562(T)比為3:1、5:1、7:1和9:1考察CIK細(xì)胞的細(xì)胞毒性，采用CCK-8試劑盒檢測(cè)，以以下公式計(jì)算細(xì)胞毒性，即K562死亡率：

2.3 濃度的優(yōu)化

第一次的濃度優(yōu)化以胰島素濃度、乙醇胺濃度、亞麻酸濃度、膽固醇濃度為考察因素，總細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)為指標(biāo)，采用中心組合設(shè)計(jì)，所有因素水平的設(shè)計(jì)為一個(gè)中心點(diǎn)，兩個(gè)考察點(diǎn)(±1)和兩個(gè)極點(diǎn)(± 2)[5]，見表1。第二次的濃度優(yōu)化以亞麻酸濃度、膽固醇濃度為考察因素，總細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)為指標(biāo)，采用中心組合設(shè)計(jì)，所有因素水平的設(shè)計(jì)為一個(gè)中心點(diǎn)，兩個(gè)考察點(diǎn)(±1)和兩個(gè)極點(diǎn)(±1.414)，見表2。

表1 實(shí)驗(yàn)因子水平Table 1 Factors and levels used in the experiment design

表2 中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 CCD results for CIK expansion

2.4 數(shù)據(jù)分析

用Design-Expert8.0.6對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用T-test進(jìn)行分析，以p<0.05作為顯著性的指標(biāo)。

3 結(jié)果與討論

3.1 四種組分濃度的優(yōu)化

查閱相關(guān)文獻(xiàn)粗略估算細(xì)胞培養(yǎng)基中胰島素濃度范圍應(yīng)為5~15 mg·L[7,9~12]，膽固醇為2~6 mg·L-1[7,11]，亞麻酸為0.5~1.5 mg·L[13]，乙醇胺為0.61~1.83 mg·L[14~16]。以此為依據(jù)，進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12和IMDM以1:1體積混合而成，如表1所示。4種組分設(shè)計(jì)出30個(gè)組合，以培養(yǎng)6天的總細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)(y)為目標(biāo)響應(yīng)值，結(jié)果如表2所示。

對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行非線性回歸分析，得到回歸方程：

采用線性數(shù)學(xué)模型模擬各組分濃度對(duì)細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)影響，顯著性分析結(jié)果顯示模型可用(p<0.05)，在所試驗(yàn)的4種組分的濃度范圍內(nèi)，只有組分亞麻酸和膽固醇的濃度對(duì)細(xì)胞擴(kuò)增有顯著性影響(p<0.05)，見表3。根據(jù)表2中的數(shù)據(jù)擬合出各組分濃度和總細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)之間的關(guān)系，見式(1)。結(jié)果顯示，在所測(cè)試的濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)與亞麻酸和膽固醇濃度幾乎成單調(diào)遞增的線性關(guān)系，說(shuō)明最佳的亞麻酸和膽固醇濃度并不在上述設(shè)定濃度范圍內(nèi)。

為此，進(jìn)一步擴(kuò)大組分亞麻酸和膽固醇的試驗(yàn)濃度范圍，在亞麻酸為0.76~9.24 mg·L-1，膽固醇為3.03~36.97 mg·L-1區(qū)間內(nèi)各選取5個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，見表4。

采用中心組合設(shè)計(jì)出13個(gè)組合，以單細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)(7)為目標(biāo)響應(yīng)值，結(jié)果是表5。

選用二次數(shù)學(xué)模型進(jìn)行模擬，結(jié)果如表6所示。顯著性分析結(jié)果顯示模型可用(p< 0.05)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果擬合出各組分濃度和總細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)之間的關(guān)系，見式(2)和圖1。

表3 各因子對(duì)總細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)的影響的顯著性分析Table 3 Significance analysis of the effects of factors on expansion fold of total cells

表4 膽固醇和亞麻酸的濃度水平Table 4 Concentration levels of cholesterol and linolenic acid

表5 膽固醇和亞麻酸對(duì)CIK細(xì)胞擴(kuò)增的影響Table 5 Effects of cholesterol and linolenic acid on CIK cell expansion

表6 膽固醇和亞麻酸對(duì)總細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)的影響的顯著性分析Table 6 Significant analysis of the effects of cholesterol and linolenic acid on expansion fold of total cells

在所測(cè)試的濃度范圍內(nèi)，表6結(jié)果顯示K組分濃度二次方項(xiàng)對(duì)細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)有顯著影響，且式(2)顯示亞麻酸組分濃度的二次項(xiàng)前面的系數(shù)為負(fù)值，即曲面向上凸起，再結(jié)合圖1中的曲面形狀，說(shuō)明其最適合濃度在所設(shè)定的濃度范圍內(nèi)，經(jīng)計(jì)算機(jī)計(jì)算其最適值為5.66。M組分濃度二次方項(xiàng)對(duì)細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)有顯著影響，且公式2顯示膽固醇組分濃度的二次項(xiàng)前面的系數(shù)為負(fù)值，即曲面向上凸起，再結(jié)合圖1中的曲面形狀，說(shuō)明其最適合濃度在所設(shè)定的濃度范圍內(nèi)，經(jīng)計(jì)算機(jī)計(jì)算其最適值為19.86。

胰島素和乙醇胺雖然在上述實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化過(guò)程中并未產(chǎn)生明顯影響，本文并未優(yōu)化它們的濃度。但是

圖1 亞麻酸與膽固醇對(duì)總細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)的響應(yīng)面曲面圖Fig.1 Response surface curve results of the effects of linolenic acid and cholesterol on expansion fold of total cells

它們對(duì)淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖是非常重要的[17]，而本文所培養(yǎng)的CIK細(xì)胞培養(yǎng)到最后有95%以上均為CD3+細(xì)胞，即T淋巴細(xì)胞(見3.2.3節(jié)中表8)，故而它們對(duì)CIK細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖也至關(guān)重要。于是本文仍然采用它們?cè)瓉?lái)的濃度，胰島素10 mg·L-1，乙醇胺1.22 mg·L-1。

至此，本文通過(guò)中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析，得到了4種因子胰島素、亞麻酸、膽固醇、乙醇胺的優(yōu)化后濃度分別為10、5.66、19.86、1.22 mg·L-1。再結(jié)合本文前期的研究工作，本文獲得了一組血清替代物組合的配方，將其命名為OSS。

3.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

將上述獲得的血清替代物組合OSS配制成濃縮液，以1:1000的比例添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中配成新的培養(yǎng)基，將其命名為 Optimizer。所使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基由IMDM與DEME/F12以1:1的體積比混合而成。

以商業(yè)無(wú)血清培養(yǎng)基SFM1、SFM2以及含10%FBS的RPMI 1640為對(duì)照，單個(gè)核細(xì)胞分別以5×105cells·mL-1的密度接種于上述4種培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過(guò)程中定期進(jìn)行半量換液和分孔傳代，共培養(yǎng)14天，以細(xì)胞形態(tài)、總細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)、各類細(xì)胞的比例、對(duì)K562細(xì)胞殺傷活性為指標(biāo)，評(píng)價(jià)Optimizer培養(yǎng)基支持CIK細(xì)胞擴(kuò)增的效果。

3.2.1 細(xì)胞形態(tài)

培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)變化如圖2所示。在第7天Optimizer和含10%FBS的RPMI 1640中細(xì)胞比SFM1和SFM2中略大，且含10% FBS的RPMI 1640中梭形細(xì)胞占據(jù)多數(shù)；第14天Optimizer和含10%FBS的RPMI 1640中的細(xì)胞大小和形態(tài)接近。

圖2 培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)的變化Fig 2 Cell morphology changes during the culture period

3.2.2 總細(xì)胞擴(kuò)增

表7為單個(gè)核細(xì)胞在4種培養(yǎng)基中擴(kuò)增14天后的總細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)。Optimizer的總細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)為56.54±18.87，明顯高于兩種商業(yè)的無(wú)血清培養(yǎng)基的5.14±1.03和3.59±0.56(p<0.05)，而與含10% FBS 的RPMI 1640的35.24±20.92相當(dāng)(p>0.05)。

表7 培養(yǎng)14天后總細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)Table 7 Expansion fold of total cells cultured for 14 days

3.2.3 細(xì)胞表型分析

CIK細(xì)胞是一類異質(zhì)型細(xì)胞群，由多種表型的細(xì)胞組成，其中CD3+為T細(xì)胞表面特異性標(biāo)記，以CD3+CD56+為特異性標(biāo)記的細(xì)胞是CIK細(xì)胞主要的效應(yīng)細(xì)胞，與其非MHC限制的腫瘤殺傷活性關(guān)系密切。這兩類細(xì)胞的比例對(duì)評(píng)價(jià)擴(kuò)增所獲得的CIK細(xì)胞功能具有重要意義。為此，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞在Optimizer、含10% FBS的RPMI 1640、SFM1和SFM2這4種培養(yǎng)基中擴(kuò)增14天的培養(yǎng)物中CD3+和CD3+CD56+細(xì)胞的比例。

由于單個(gè)核細(xì)胞在兩種商業(yè)無(wú)血清培養(yǎng)基SFM1和SFM2中培養(yǎng)14天后細(xì)胞倍數(shù)很低，因此，未對(duì)其表型進(jìn)行分析。在Optimizer、含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中擴(kuò)增14天的培養(yǎng)物中CD3+和CD3+CD56+細(xì)胞的比例。

表8為4個(gè)樣本擴(kuò)增所獲得的細(xì)胞中CD3+細(xì)胞的比例，CD3+細(xì)胞的比例均達(dá)到90%以上。Optimizer中擴(kuò)增的細(xì)胞中CD3+細(xì)胞比例為97.98%±1.41%與含10%FBS的RPMI1640的94.34%±1.29%相當(dāng)，二者之間無(wú)顯著性差異(p>0.05)，說(shuō)明Optimizer可支持CD3+細(xì)胞高效擴(kuò)增。

表9為4個(gè)樣本擴(kuò)增所獲得細(xì)胞中CD3+CD56+細(xì)胞比例，其范圍在10%~30%。Optimizer中擴(kuò)增獲得的CD3+CD56+細(xì)胞比例為18.17% ±7.39%，含10% FBS的RPMI 1640中擴(kuò)增獲得的CD3+CD56+細(xì)胞比例的為25.49% ±3.35%，采用Optimizer中擴(kuò)增的細(xì)胞中CD3+CD56+細(xì)胞比例要低于含10% FBS的RPMI 1640，二者之間存在顯著性差異(p<0.05)。

表10為擴(kuò)增所獲得的細(xì)胞中CD3+CD56+細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)，其擴(kuò)增倍數(shù)范圍在200~700，樣本之間存在差異，同一樣本在兩種培養(yǎng)基之間存在差異。Optimizer中擴(kuò)增獲得的CD3+CD56+細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)的平均值為440.86±222.89，與含10%FBS的RPMI1640的擴(kuò)增倍數(shù)429.27±249.16之間不存在顯著性差異(p>0.05)，說(shuō)明采用Optimizer擴(kuò)增CIK細(xì)胞的效果與含10% FBS的RPMI 1640相近。

表8 CD3+細(xì)胞的比例Table 8 Proportion of CD3+cells

表9 CD3+CD56+細(xì)胞的比例Table 9 Proportion of CD3+CD56+cells

表10 CD3+CD56+細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)Table 10 Expansion fold of CD3+CD56+cells

分別以效靶比為3:1、5:1、7:1、9:1，檢測(cè)在Optimizer和含10% FBS的RPMI 1640中擴(kuò)增14天的CIK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性，結(jié)果見表11。當(dāng)效靶比為3:1時(shí)，Optimizer中擴(kuò)增的CIK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性為11.59%，而在含10%FBS的RPMI1640擴(kuò)增的細(xì)胞的殺傷活性為20.19%；而隨著效靶比的升高，兩種培養(yǎng)基中CIK細(xì)胞的殺傷活性均升高，且二者差異較小。當(dāng)效靶比為9:1時(shí)，Optimizer中CIK細(xì)胞的殺傷活性為53.65%，接近含10%FBS的RPMI 1640的53.86%。說(shuō)明，在所開發(fā)的Optimizer中擴(kuò)增的CIK細(xì)胞具有與有血清培養(yǎng)的CIK細(xì)胞具有相似的腫瘤殺傷活性。

表11 CIK細(xì)胞的殺死活性Table 11 Killing activity of CIK cells

4 結(jié) 論

本文考察了所開發(fā)的無(wú)血清培養(yǎng)基Optimizer支持CIK細(xì)胞體外高效擴(kuò)增的效果，以細(xì)胞形態(tài)、總細(xì)胞擴(kuò)增、CD3+、CD3+CD56+細(xì)胞的比例、CD3+CD56+細(xì)胞的擴(kuò)增以及對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性為評(píng)價(jià)指標(biāo)等方面均能達(dá)到與有血清培養(yǎng)基相似的效果。

[1] Sangiolo D. Cytokine induced killer cells as promising immunotherapy for solid tumors [J]. Journal of Cancer, 2011, 2(1): 363-368.

[2] Lidia G, Loretta G , Michela C, et al. Cytokine-induced killer cells as immunotherapy for solid tumors: current evidences and perspectives [J]. Immunotherapy, 2015, 7(9): 999-1010.

[3] Olioso P, Giancola R, Riti M D, et al. Immunotherapy with cytokine induced killer cells in solid and hematopoietic tumours: a pilot clinical trial [J]. Hematological Oncology, 2009, 27(3): 130-139.

[4] Jingting J, Changping W, Binfeng L. Cytokine-induced killer cells promote antitumor immunity [J]. Journal o f Translational Medicine, 2013, 11(1): 230-235.

[5] YUAN Li-hong (袁麗紅), SHAO Hui (邵輝), GU Yong-ming (顧永明), et al. Simunaneous extraction and hydrolysis in situ for the recovery of diosgenin from Dioscorea zingiberensis (盾葉薯蕷中水解原位提取薯蕷皂甙元) [J]. Journ al of Che mical Engineering of Chinese Universities (高校化學(xué)工程學(xué)報(bào)), 2007, 21(3): 538-544.

[6] FAN Jie-ping (范杰平), CAO Jing (曹婧), KONG Tao (孔濤), et al. Optimization of ultrasonic-assisted [Bmim]Br-K2HP04aqueous two-phase system extraction of puerarin from pueraria ([Bmim]BrK2HP04雙水相萃取與超聲耦合法提取葛根中的葛根素及其優(yōu)化) [J]. Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities (高?；瘜W(xué)工程學(xué)報(bào)), 2011, 25(6): 955-961.

[7] Jeon M K, Lim J B, Lee G M. Development of a serum-free medium for in vitro expansion of human cytotoxic T lymphocytes using a statistical design [J]. BMC Biotechnology, 2010, 10(39): 1-9.

[8] Wei C, Wang W, Pang W, et al. The CIK cells stimulated with combination of IL-2 and IL-15 provide an improved cytotoxic capacity against human lung adenocarcinoma [J]. Tumour biology, 2014, 35(3): 1997-2007.

[9] Darfler F J, Insel P A. Clonal growth of lymphoid cells in serum-free media requires elimination of H202toxicity [J]. Journal of Cellular Physiology, 1983, 115(1): 31-36.

[10] Darfler F J, Murakami H, Insel P A. Growth of T-lymphoma cells in serum-free medium: lack of involvement of the cyclic AMP pathway in long-term cultures [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1980, 77(10): 5993-5997.

[11] Yen A, Duigou R. Serum-free media for a human lymphocyte cell line and for PWM-stimulated peripheral blood lymphocytes: Requirements for insulin, transferrin and albumin [J]. Immunology Letters, 1983, 6(3): 169-174.

[12] Hans Y, Jan E D V, Marcel K, et al. Serum free medium for generation and propagation of functional human cytotoxic and helper T cell clones [J]. Journal of lmmunological Methods, 1984, 72(1): 219-227.

[13] Helga S P, Herman P. Requirement of a combination of a saturated and an unsaturated free fatty acid and a fatty acid carrier protein for in vitro growth of lymphocytes [I]. The Journal of Immunology, 1981, 126(3): 949-959.

[14] Tamiko K S, Janice E E. Effects of phosphoethanolamine and ethonolamine on growth of mammary carcinoma cells in culture [J]. Experimental Cell Research, 1981, 136(1): 137-145.

[15] Hiroki M Hideo M, Gordon H S, et al. Growth of hybridoma cells in serum-free medium: Ethanolamine is an essential component [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1982, 79(4): 1158-1162.

[16] Tamiko K S, Dorothy M C, Ziro Y, et al. Phosphoethanolamine as a growth factor of a mammary carcinoma cell line of rat [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1979, 76(11): 5741-5744.

[17] Ulf B. Serum-free cultivation of lymphoid cells [J]. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 1987, 34: 95-109.

Optimization of Serum Substitute Concentration in Serum-Free Media for CIK Cells Using Central Composite Design and Response Surface Analysis

CHEN Xiao-dong, CAI Hai-bo, TAN Wen-song
(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)

CIK cells (cytokine-induced killer cells) are one type of effector cells in adoptive cell immunotherapy for tumors. Serum-free media are often necessary when CIK cells are expanded in vitro. This study investigated the applicability of insulin, linolenic acid, cholesterol and ethanolamine as substitutes of serum in promoting cell proliferation. Composite combination design and response surface analysis were combined to optimize the concentration of these chemicals to obtain the maximum expansion fold of total mononuclear cells. Their final optimized concentrations are 10, 5.66 19.86, 1.22 mg·L-1, respectively. These four components were added at their optimized concentrations to the basic medium consists of DMEM/F12 and IMDM at volume ratio of 1:1 to prepare serum-free media named Optimizer. Umbilical cord blood mononuclear cells were cultured for 14 days in Optimizer via half amount of dilution, and RPMI 1640 with 10% FBS was used as a control. Cells composition, expansion fold of CD3+CD56+cells and killing activity on K562 cells were assessed. The results indicate that the expansion fold of total cells in Optimizer is 56.54±18.87, which is significantly higher than 5.14±1.03(p<0.05) in SFM1 and 3.59±0.56(p<0.05) in SFM2, and it is similar to35.24±20.92(p>0.05) in RPMI1640 with 10% FBS. CD3+cell proportion is 97.98%±1.41% in Optimizer, which is similar to 94.34%±1.29% in RPMI 1640 with 10% FBS(p>0.05). CD3+CD56+cell proportion is 18.17%±7.38% and it is lower than 25.49%±3.35%(p<0.05) in RPMI 1640 with 10% FBS. However, the expansion fold of CD3+CD56+cells is 440.86±222.89 and 429.27±249.16 respectively in these two media, which shows no significant difference(p>0.05). When the ratio of effector cell and target cell is 9:1, the killing activities on K562 cells in these two media are both higher than 50%. These results provide fundamental data fo r the development of serum-free media for the expansion of CIK cells in vitro.

cytokine-induced killer cells; serum-free media; serum substitutes; response surface analysis

Q2-33

：A

10.3969/j.issn.1003-9015.2016.00.032

1003-9015(2016)06-1328-07

http://www.cnki.net/kcms/detail/33.1141.TQ.20161027.1645.002.html

2016-04-29；

：2016-07-30。網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-10-27 16:45:53

上海市科委資金(15JC1401402)。

陳小東(1990-)，男，甘肅隴南人，華東理工大學(xué)碩士生。

：蔡海波，E-mail：caihaibo@ecust.edu.cn