小檗堿對小鼠外陰陰道假絲酵母菌病的作用研究

丁曉媚寧玉梅王法明周笑梅李瑞蘭

小檗堿對小鼠外陰陰道假絲酵母菌病的作用研究

丁曉媚1寧玉梅2王法明3周笑梅4李瑞蘭5

目的觀察小檗堿對小鼠外陰陰道假絲酵母菌病的治療效果。方法ICR小鼠112只，采用雌激素化+陰道灌洗白假絲酵母菌菌液，構(gòu)建外陰陰道假絲酵母菌病小鼠模型。隨機分為正常組、模型組、實驗組（小檗堿低、中、高劑量）和制霉菌素組，各18只，相應(yīng)藥物干預(yù)10天，觀察小鼠在接菌后4、7、14天癥狀、體征、微生物學(xué)及組織病理學(xué)改變。結(jié)果接菌第7天，小檗堿高劑量組和制霉菌素組感染癥狀、體征消失，與模型組比較，小檗堿高劑量組真菌載量和陰道灌洗液真菌陰性鼠數(shù)均明顯下降 [（1．83±0．75）104CFU/mL比（18．17±2．93）104CFU/mL，P＜0．05；5鼠比0鼠，P＜0．05]。小檗堿高劑量組和制霉菌素組效果相當[（1．83±0．75）104CFU/mL比（1．67±1．21）104CFU/mL，P＞0．05；5鼠比6鼠，P＞0．05]。結(jié)論小檗堿能有效治療雌激素化小鼠外陰陰道假絲酵母菌病。

小鼠；外陰陰道假絲酵母菌??；白假絲酵母菌；小檗堿

近年來，外陰陰道假絲酵母菌?。╒VC）的發(fā)病率和復(fù)發(fā)率逐漸上升，尋找新的治療外陰陰道假絲酵母菌病及預(yù)防其復(fù)發(fā)的藥物已成為研究熱點。本實驗觀察小檗堿對小鼠外陰陰道假絲酵母菌病的影響和作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 ICR品系小鼠（8～10周）112只，清潔級，雌性，體質(zhì)量25～27g，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供。實驗動物合格證號：SYXK（浙）2009－0129，自由飲水和攝食，環(huán)境溫度20～22℃，相對濕度70%。

1.2 藥物與試劑 鹽酸小檗堿（批號110713－201010），每片含鹽酸小檗堿0．1g；接種菌株（批號ATCC11106）均來浙江省新華醫(yī)院細菌室。鹽酸小檗堿陰道灌洗液配制：分別將1片鹽酸小檗堿溶解于80、40、20mL的蒸餾水中，配制成藥物濃度為0．125、0．25、0．5mg/mL藥物。制霉菌素堿陰道灌洗液配制：將1片制霉菌素溶解于2mL的蒸餾水中，配制成藥物濃度為25萬U/mL藥物。將配置好的藥物消毒后置于4℃冰箱待用，每次每只小鼠取20μL灌洗陰道。

1.3 動物模型的構(gòu)建及分組 隨機選取小鼠94只，按趙敬軍等[1]雌激素化+陰道灌洗白假絲酵母菌菌液（含白假絲酵母菌孢子數(shù)5×104個/20μL）法構(gòu)建小鼠外陰陰道假絲酵母菌病模型。以小鼠外陰紅腫，分泌物明顯增加，見陰道口排出白色凝乳狀分泌物，涂片鏡檢可見假菌絲及芽生苞子，為造模成功。其中4只涂片鏡檢未見假菌絲及芽生苞子，為造模失敗。將造模成功的90只小鼠隨機分為5組，每組18只：分別為小檗堿低劑量組（0．1mg/kg）、中劑量組（0．2mg/kg）、高劑量組（0．4mg/kg）、制霉菌素組（2萬U/kg）、模型組，其余18只作為正常組。模型組和正常組予等體積蒸餾水溶液，其余予相應(yīng)藥物灌洗陰道。小鼠感染后的第4天開始陰道灌洗給藥，1天1次，連續(xù)干預(yù)10天。

1.4 觀察指標

1.4.1 陰道灌洗液檢查 接菌第4、7、14天，各組分別取6只小鼠用無菌PBS液充分灌洗陰道，每只均取陰道灌洗液20μL，裝于無菌試管中。從以下3方面進行觀察：（1）混濁度；（2）真菌載量：將陰道灌洗液充分混勻，取其中的10μL加入490μL的無菌生理鹽水之中稀釋，后接種在改良后沙堡葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48h，進行CFU計數(shù)(即菌落形成單位，以個菌落/mL為單位計算)；（3）涂片鏡檢：剩余10μL進行涂片后鏡檢，整張涂片觀察到的菌絲數(shù)量按以下標準分級：0：未見菌絲；+：＜10條菌絲；++：10～30條菌絲；+++：≥30條菌絲但未聚集成團；++++：1個假菌絲團；+++++：＞1個假菌絲團。

1.4.2 陰道組織病理檢查 處死已取好陰道灌洗液的小鼠，在無菌操作下取小鼠的陰道組織，將取出的每個陰道組織用10%甲醛浸泡24h后作石蠟包埋、切片、染色（對同一標本同時做HE染色和PAS染色）。分別對HE染色的片子進行白細胞觀察，PAS染色的片子進行菌絲觀察。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13．0軟件統(tǒng)計包，進行統(tǒng)計分析，計量資料采用（±s） 表示，兩樣本間進行成組LSD－q檢驗。對方差不齊或數(shù)據(jù)不呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗。以P＜0．05作為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癥狀及體征 正常組在整個實驗中飲食正常，體質(zhì)量無明顯改變，未見有煩躁、外陰紅腫、分泌物增加的現(xiàn)象出現(xiàn)。其余各組在接菌的第4天均出現(xiàn)飲食減少、煩躁，外陰紅腫、分泌物增加、甚至有豆渣樣乳白色分泌物流出。接菌第7、14天，小檗堿高劑量組、制霉菌素組感染癥狀及體征均消失。模型組在整個實驗過程中癥狀、體征都呈持續(xù)狀態(tài)。

2.2 陰道灌洗液檢查結(jié)果

2.2.1 各灌洗日混濁度檢查 正常組在整個實驗過程中小鼠陰道灌洗液清澈。其余小鼠接菌第4天陰道灌洗液均混濁，見有豆渣樣白帶，模型組小鼠豆渣樣白帶一直持續(xù)到實驗結(jié)束。接菌第7天，小檗堿高劑量組、制霉菌素組陰道灌洗液均未見明顯的混濁；小檗堿低劑量組、小檗堿中劑量組仍見混濁，偶還可見豆渣樣白帶。

2.2.2 各灌洗日小鼠陰道灌洗液假絲酵母菌載量與正常組比較，模型組小鼠陰道灌洗液假絲酵母菌載量明顯升高（P＜0．05）；接菌第7、14天，小檗堿中劑量組、小檗堿高劑量組、制霉菌素組陰道灌洗液假絲酵母菌載量比模型組均有明顯減少（P＜0．05）。見表1。

表1 各組小鼠陰道灌洗液假絲酵母菌載量比較（×104CFU/mL±s）

表1 各組小鼠陰道灌洗液假絲酵母菌載量比較（×104CFU/mL±s）

注：與正常組比較，*P＜0．05；與模型組比較，△P＜0．05

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2.2.3 各灌洗日小鼠陰道灌洗液鏡檢假菌絲 接菌第4天，實驗組小鼠陰道灌洗液鏡檢假菌絲等級全部為+++～+++++，各實驗組間比較P＞0．05。接菌第7、14天，各組陰道灌洗液鏡檢假菌絲等級比較：模型組與正常組比較P＜0．05；小檗堿低劑量組、小檗堿中劑量組與模型組比較，P＞0．05；小檗堿高劑量組、制霉菌素組與模型組比較，P＜0．05；小檗堿高劑量組與制霉菌素組比較，P＞0．05。接菌7～14天各組陰道灌洗液鏡檢菌絲等級情況見表2～3。

表2 接菌后第7天各組實驗小鼠陰道灌洗液鏡檢假菌絲等級比較（只）

表3 接菌后第14天各組實驗小鼠陰道灌洗液鏡檢假菌絲等級比較（只）

2.3 陰道組織病理學(xué)檢查 實驗過程中正常組小鼠陰道組織都未見菌絲及明顯的白細胞浸潤。其余各組小鼠接種白假絲酵母菌后第4天，在PAS染色下陰道黏膜即可見大量紫紅色線狀菌絲，有些有成團狀及卵圓形孢子，但基本都只在黏膜的表面，未見明顯向角質(zhì)上皮穿透。在HE染色下見有PMNs浸潤。接菌后第7天小檗堿高劑量組、制霉菌素組陰道腔內(nèi)、陰道黏膜PAS染色下見菌絲大量減少且有見少量菌絲斷裂的現(xiàn)象，鏡下炎性細胞減少；小檗堿低劑量組、小檗堿中劑量組、模型組仍可見大量菌絲且有部分向角質(zhì)上皮穿透，黏膜下可見大量的以PMNs為主的炎性細胞浸潤。在接菌第14天小檗堿高劑量組、制霉菌素組中未見任何菌絲；小檗堿低劑量組、小檗堿中劑量組、模型組陰道腔內(nèi)可見少量的菌絲斷裂，但不明顯。見圖1～2（封二）。

3 討論

外陰陰道假絲酵母菌?。╒VC）是由假絲酵母菌引起的一種常見的外陰陰道炎癥性疾病。國內(nèi)14家醫(yī)院聯(lián)合流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[2]，婦科門診陰道炎患者中，VVC患者居首位。據(jù)國外流行病學(xué)資料統(tǒng)計[3]，5%的VVC患者每年發(fā)作4次或4次以上，成為復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌?。≧VVC）。近年來，隨著臨床上抗生素的廣泛使用、應(yīng)用口服避孕藥女性增多、糖尿病發(fā)病率增加等因素，致使VVC和RVVC的發(fā)病呈明顯上升趨勢。因其臨床癥狀強烈、反復(fù)發(fā)作，易引起患者焦慮、抑郁等心理障礙，也增加了患者的經(jīng)濟負擔。對RVVC患者進行抗真菌治療常能收到滿意的效果但并不能預(yù)防其復(fù)發(fā)，這使治愈RVVC成為臨床上一個比較棘手的問題。小檗堿作為抗菌藥在臨床上已應(yīng)用多年，其療效確切，早在1969年Amin 等[4]就提出小檗堿是一種廣譜抗菌藥物，對多種革蘭氏陽性、陰性菌以及真菌（如白假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌）、霉菌、病毒、原蟲、線蟲具有抑制殺滅作用。趙民等[5]體外藥敏研究顯示，鹽酸小檗堿體外具有抗假絲酵母菌活性。我們在前期的體外藥敏試驗中也證明小檗堿是有抑制白念珠菌的作用，其抑菌濃度為15．625μg/mL。本研究顯示，小檗堿對小鼠外陰陰道假絲酵母菌病有明顯治療效果，0．4mg/kg用藥劑量治療效果與制霉菌素相當。

白假絲酵母菌具有孢子和菌絲兩種形態(tài)，且在一定的條件下，孢子和菌絲可以相互轉(zhuǎn)化。菌絲態(tài)的白假絲酵母菌更容易黏附于宿主黏膜，侵襲力和致病力都更強。致病真菌在代謝過程中可以產(chǎn)生前列腺素類物質(zhì)，其中最主要的就是前列腺系E2 （PGE2）。Downward等[6]用質(zhì)譜測定法證實白假絲酵母菌確實可由花生四烯酸代謝產(chǎn)生PGE2。Alem MA等[7]發(fā)現(xiàn)孢子和菌絲兩種形態(tài)的白假絲酵母菌細胞在37℃均能合成前列腺系（PGAs），但菌絲形態(tài)的細胞分泌更多的PGs。菌絲較孢子可以通過自身代謝和刺激宿主產(chǎn)生更多的PGE2，同時PGE2可以促進孢子態(tài)向菌絲態(tài)轉(zhuǎn)化[8－9]，菌絲形成后又可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生更多的PGE2[10]，劉亞莉等[11]也成功證實雌激素和白假絲酵母菌感染均可以誘導(dǎo)大量的PGE2產(chǎn)生，以上研究都證實PGE2在白假絲酵母菌性陰道炎中起著至關(guān)重要的作用。而毛秋嫻等[12]用酶聯(lián)免疫法（ELA）檢測到PGE2濃度隨鹽酸小檗堿的濃度升高而降低，其作用機制可能是通過COX－1或結(jié)合型前列腺系E2合成酶－1（mPGES－1）的途徑來影響PGE2的生成。小檗堿降低急性炎癥組織中PGE2含量，是小檗堿抗炎的一種重要機制。趙民等[5]體外藥敏研究顯示，鹽酸小檗堿體外具有抗假絲酵母菌活性。本實驗顯示，應(yīng)用一定濃度小檗堿陰道灌洗的方法治療雌激素依賴性外陰陰道假絲酵母菌病小鼠，小鼠炎性反應(yīng)減輕，菌絲形成被有效抑制，且0．4mg/ kg小檗堿和制霉菌素組的治療效果相同（P＞0．05）。而制霉菌素是目前臨床最為經(jīng)典的治療VVC藥物。說明小檗堿不僅在體外具有抗假絲酵母菌的作用，在體內(nèi)也具有抗假絲酵母菌的作用而起到治療VVC的作用，其機制可能為小檗堿可通過COX－1或mPGES－1的途徑來減少PGE2的生成，但需要進一步研究來證實或發(fā)現(xiàn)是否有其它的抑菌機制。

［1］趙敬軍，沈永年，陳偉，等.白念珠菌性陰道炎動物模型的構(gòu)建［J］．中華皮膚科雜志，2002，5（10）：346－348．

［2］劉朝暉，廖秦平.小檗堿對外陰陰道假絲酵母菌病小鼠的療效研究［J］．中國實用婦科與產(chǎn)科雜志，2005，4（21）：223－224．

［3］Centers for Disease Control and Prevention.Sexually Transmitted Disease Treatment Guidelines 2006［J］．MMWR，2006，55：（RR－11）54－56．

［4］Amin AH，Subbaiah TV，Abbasi KM.Berberine sulfate：antimicrobialactivity，bioassay，and mode of action［J］．Can J Microbiol，1969，15：1067－1076

［5］趙民，遲華基，牟文麗，等.鹽酸小檗堿抗假絲酵母菌及抗腫瘤活性研究［J］．實用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2009，25（2）：193－196．

［6］Downward JRE，Nover MC.Characterization of Prostagland in E2 Production by Candida albicans［J］．Infect Immun，2007，75（7）：3498－505．

［7］Alem MA，Douglas LJ.Prostaglandin production during growth of Candida albicans biofilms［J］．J Med Microbiol，2005，54 （11）：1001－1005．

［8］Kalo-Klein A，Witkin SS.Prostaglandin E2 enhances and gamma interferon inhibits germtube formation in Candida albicans［J］．Infect Immun，1990，58（1）：260－262．

［9］Noverr MC，Huffnagle GB.Regulation of Candida albicans Morphorgenesis by fattyacid metabolites［J］．Infect Immun，2004，72（11）：6206－6210．

［10］Scott G，Basil o，Ashraf SI，et al.Mechanisms by Which Candida albicans Induce Endothelial Cell Prostaglandin Synthesis［J］．Infection and Immunity，1994，62（3）：1064－1069．

［11］劉亞莉，肖敦振，高俊，等.外陰陰道念珠菌病小鼠模型陰道組織PGE2的測定及消炎痛對其治療的研究［J］．中國婦幼保健，2007，22（32）：4598－4599．

［12］毛秋嫻，龍啟才.鹽酸小檗堿對LPS誘導(dǎo)的小鼠RAW 264．7細胞PGE2、COX－2表達的影響［J］．現(xiàn)代醫(yī)院，2008，12（8）：7－9．

（收稿：2015-06-26 修回：2015-09-21）

Effect of Berberine on VulvovaginalCandidiasis of Mice

DING Xiaomei1,NING Yumei2,WANG Faming3,ZHOU Xiaomei4,LI Ruilan5． 1 Department of Traditional Chinese Medicine,People's Hospital of Lishui,Lishui (323000),China;2 Zhejiang Blood Center,Hangzhou(310000),China;3 Department of Rehabilitation,People's Hospital of Lishui,Lishui(323000),China;4 Department of Traditional Chinese Medicine,People's Hospital of Rui'an, Rui'an(325200),China;5 Department of Obstetrics&Gynecology,Xinhua Hospital,Hangzhou(310000),China.

ObjectiveTo investigate the effect of berberine on the treatment of vulvovaginal candidiasis（VVC）in mice．MethodsOne hundred and twelve mice was used to establish VVC by using estrogen and vaginal lavage fluid of white candida fungus．Ninety mice with VVC were randomly divided into blank control group,model group, experimental groups（lower,middle and high dose berberine）,and nystatin group,with 18 mice in each group．The treatment course lased for 10 d．In 4,7,and 14d after inoculation,signs and symptoms,microbiology test result and histopathological changes were observed in all groups．ResultsOn day 7 the signs and infection of VVC in high－dose berberine group and nystatin group disappeared;compared with model group,fungal load by microscopic examination was significantly decreased[（1．83±0．75）×104CFU/mL vs（18．17±2．93）×104CFU/mL,P＜0．05]and the number of mice with negative results was less in high－dose berberine group（0 mouse vs 5 mice,P＜0．05）．The treatment effect of high－dose berberine group was similar to that of nystatin group[（1．83±0．75）×104CFU/mL vs（1．67± 1．21）×104CFU/mL,P＞0．05]．ConclusionBerberine can effectively treat estrogen－dependent vulvovaginal candidiasis in mice．

mice；vulvovaginalcandidiasis；C．Albicans；erberine

浙江省中醫(yī)藥科技項目（No．2011ZA040）

1浙江省麗水市人民醫(yī)院中醫(yī)科（麗水 323000）；2浙江省獻血管理中心（杭州310000）；3浙江省麗水市人民醫(yī)院康復(fù)科（麗水 323000）；4浙江省瑞安市人民醫(yī)院中醫(yī)科（瑞安 325200）；5浙江省新華醫(yī)院婦產(chǎn)科（杭州310000）

丁曉媚，Tel：18957090510